变形链球菌表面蛋白pcDNA3/pacA与pcDNA3/pacP真核表达质粒的构建

目的：构建变形链球菌表面蛋白真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＡ与ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＰ,即表面蛋白氨基端与中央区Ｔ、Ｂ细胞表位的两个基因疫苗。方法：通过ＰＣＲ扩增,获得分别编码变形链球菌表面蛋白ＰＡｃ氨基端和中央区Ｔ、Ｂ细胞表位的两个目的基因ｐａｃ－Ａ和ｐａｃ－Ｐ。将它们与真核穿梭表达载体ｐｃＤＮＡ３进行体外重组,并转化大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ,采用菌落原位杂交筛选出阳性克隆子后,抽提重组质粒,进行酶切鉴定、Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交分析和ＤＮＡ序列测定。结果：真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＡ与ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＰ构建正确,目的基因ｐａｃ－Ａ和ｐａｃ－Ｐ定向插入至真核表达载体中,插入的相位正确,未改变目的基因的阅读框架。结论：真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＡ与ｐｃＤＮＡ３／ｐａｃＰ分别包含了变形链球菌表面蛋白ＰＡ     

变形链球菌表面蛋白真核表达质粒pcDNA3/pacA和pcDNA3/pacP在哺乳动物细胞中的表达

目的:研究变形链球菌表面蛋白真核表达质粒pcDNA3/pacA 及pcDNA3/pacP在哺乳动物细胞中的转录及表达情况。方法:利用脂质体介导的转染技术,将真核表达质粒pcDNA3/pacA 及pcDNA3/pacP分别转染COS-7细胞,1mg*ml-1 G418加压筛选获取稳定转染的COS-7细胞之后,采用RT-PCR法、LSAB法、流式细胞术及Western印迹法,对真核表达质粒中插入基因pac-A和pac-P的转录及表达产物进行检测。结果:真核表达质粒pcDNA3/pacA及pcDNA3/pacP的插入基因在导入哺乳动物细胞后具有转录和翻译活性,表达的蛋白质产物可位于胞内、胞膜及胞外。结论:构建的真核表达质粒pcDNA3/pacA 和pcDNA3/pacP能在哺乳动物细胞中表达插入基因所编码的蛋白质,为进一步的动物实验提供了实验依据。     

含变链菌PAc蛋白编码基因保守区重组质粒pCIA-P的亚克隆构建

人类致龋菌变形链球菌 (Ｓ .ｍｕｔａｎｓ)的一种表面蛋白ＰＡｃ ,由于参与介导细菌对牙面的粘附而被视作Ｓ .ｍｕｔａｎｓ的重要毒力因子 ,因此成为研制防龋疫苗的主要备选抗原。我们选择ｐａｃ基因中编码ＰＡｃ主要免疫活性区域的ＤＮＡ序列 ,制备出待表达ＤＮＡ片段 ,经亚克隆至ｐＧＥＭ Ｔ质粒后 ,再克隆到高效哺乳动物表达质粒ｐＣＩ中构建成含ｐａｃ基因重要抗原决定簇编码区域的重组质粒 ,从而为防龋ＤＮＡ疫苗的免疫实验研究完成了重要准备。一、材料和方法1.目的片段的体外扩增 :从ｐａｃ基因中选定包含两个主要免疫活性区 (Ａ区及…     

变形链球菌表面蛋白DNA防龋疫苗的构建

旨在构建一种新型的表面蛋白防龋疫苗－ＤＮＡ防龋疫苗。方法从表面蛋白ｐａｃ基因上利用ＢａｍＨＩ和ＳａｃＩ双酶切，获得一个３２８１ｂｐ的片段。将该片段定向插入真核表达载体ｐＳＶＬ，再将连接后新构成的质ｐＳＶＬ／ｐａｃ转入氯化钙法制备的感受态大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α。     

小鼠牙本质涎蛋白成熟肽编码区cDNA克隆和部分序列分析

目的：克隆小鼠牙本质涎蛋白（ＤＳＰ）成熟肽编码区基因。方法：用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨牙牙胚组织中抽提总ＲＮＡ,用Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）作引物逆转录合成牙胚ｃＤＮＡ,然后利用ＰＣＲ方法,从ｃＤＮＡ中扩增出小鼠ＤＳＰ成熟区的基因片段（约１．４ｋｂｐ）,将所得基因片段插入ｐＢＳ质粒载体,转化到大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ后挑选阳性克隆,提取重组质粒ＤＮＡ,通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：重组质粒ｐＢＳ－ＤＳＰ的酶切图谱和部分序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到小鼠ＤＳＰ成熟肽编码区基因,正在进行该基因的表达和活性鉴定。     

p16基因对舌鳞癌细胞生物学特性影响的研究

ｐ16基因是一个多种肿瘤抑制基因 ,其编码蛋白为周期依赖性激酶 4(ＣＤＫ4)的抑制因子 ,能阻止ＣＤＫ4与细胞周期素Ｄ结合 ,从而使细胞周期阻滞在Ｇ1期[1] 。我们为了探讨引入野生型ｐ16基因后口腔鳞癌细胞生物学的变化 ,构建了ｐ16基因真核表达质粒 ,并于体外转染ｐ16基因产物缺乏的舌鳞癌细胞ＴＳＣＣａ中 ,探索ｐ16基因治疗口腔鳞癌的可行性。1 材料 :ｐｃＤＮＡ3真核表达质粒 ;人舌鳞癌细胞系ＴＳＣＣａ ;ｐ16的ＲＴ ＰＣＲ引物顺序 :正义链 :5′ ＧＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＡＣＴＧＧ 3′ ;反义链 :5′ ＧＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＴＣＧＧＧＧＡＴＧＴＣＴＧＡＧＧＧ 3′。2 .方法 :(1)ｐｃＤＮＡ ｐ16真核表达质粒的构建 :常规提取ｐｃＤＮＡ3质粒ＤＮＡ ,ＢａｍＨ1和ＥｃｏＲ1酶切 ;提取人正常口腔粘膜总ＲＮＡ ;ＲＴ ＰＣＲ扩增ｐ16全长ｃＤＮＡ ;ＢａｍＨ1和ＥｃｏＲ1酶切 ,纯化后和线性ｐｃＤＮＡ3进行连接反应 ,筛选阳性克隆 ,ＢａｍＨ1和ＥｃｏＲ1酶切鉴定定向克隆的重组质粒ｐｃＤＮＡ3 ｐ16。(2 )ｐｃＤＮＡ3和ｐｃＤＮＡ3 ｐ16转染ＴＳ...     

基因重组乳链球菌防龋疫苗的研究Ⅴ.重组乳链球菌中RNA的提取纯化及RNA点印迹杂交

对参与蛋白质生物合成的转录产物ＲＮＡ进行异硫氰酸胍提取,氯化铯超速离心纯化以及ＲＮＡ点印迹杂交,测定重组乳链球菌中特定的ＲＮＡ,分析影响重组基因表达的因素。紫外分光法测定获得高浓度（５～８ｍｇ／ｍｌ）、纯度（ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＞２．０）ＲＮＡ。以切口平移生物素标记ＤＮＡ探针并进行ＤＮＡ－ＲＮＡ点印迹杂交,光基因核酸系统检测结果提示,乳链球菌ＨＬ１０７,ＨＬ４５均含有与变形链球菌相同的特定ＰＡｃ－ｍＲＮＡ靶序列及密度扫描影像。提示ＰＡｃ－ｍＲＮＡ作为指导蛋白质合成的中介物存在于重组乳链球菌中,使重组乳链球菌完成了克隆ｐａｃ基因的表达。     

稳定表达骨形成蛋白Ⅱ型突变受体的NIH3T3细胞的建立及鉴定

目的：建立稳定表达ＢＭＰｓⅡ型突变受体的ＮＩＨ３Ｔ３细胞株。方法：用ＦｕＧＥＮＥ６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ真核转染试剂盒将携带ＢＭＰｓⅡ型突变受体的ｃＤＮＡ的真核表达载体转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞。结果：得到抗Ｇ－４１８的阳性细胞克隆转染细胞，ｎｅｏ基因原位杂交阳性。结论：成功建立了稳定表达ＢＭＰｓⅡ型突变受体的ＮＩＨ３Ｔ３细胞株。     

基因重组乳链球菌防龋疫苗的研究 Ⅲ．乳链球菌重组质粒DNA的Southern印迹和点印迹杂交分析

为了证实重组质粒ＤＮＡ分子中插入的外源ＤＮＡ确是来自变形链球菌拱体菌，检测受体菌中是否有探针同源的序列。本研究采用ＤＮＡＳｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交、点印迹杂交和切口平移制备生物素ＤＮＡ探针以及光敏基因检测技术，对乳链球菌ＨＬ１０２，ＨＬ１０７中的重组质粒ＤＮＡｐＬＦ１０２，ｐＬＦ１０７作了进一步分析鉴定，ＤＮＡ点印迹杂交结果显示，含有ｐａｃ基因的ｐＰＣ４１ＰｓｔⅠ酶切ＤＮＡ探针均与上述质粒ＤＮＡ结合，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交提示重组质粒１．５ｋｂ的酶切片段与生物素探针杂交，证实该基因片段是从ｐＰＣ４１中获得的变形链球菌目的基因片段，重组乳链球菌ＨＬ１０２，ＨＬ１０７均携带变形链球菌表面蛋白抗原（ＰＡｃ）结构基因ｐａｃ。     

小鼠牙本质涎蛋白成熟肽编码区cDNA 隆和部分序列分析

目的：克隆小鼠牙本质涎蛋白（ＤＳＰ）成熟肽编码区基因。方法：用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨睡胚组织中抽提总ＲＮＡ，用Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）作引物逆转录合成牙胚ｃＤＮＡ，然后利用ＰＣＲ方法，从ｃＤＮＡ中扩增出小鼠ＤＳＰ成熟区的基因片段（约１．４ｋｂｐ），将所得基因片段插入ｐＢＳ质粒载体，转化到大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ后挑选阳性克隆，提取重组质粒ＤＮＡ，通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果     

转染人骨形成蛋白2基因对NIH3T3细胞生物学行为的影响

目的从分子水平探讨骨形成蛋白２（ｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ２,ＢＭＰ２）对细胞分化的调节作用,并为ＢＭＰ２基因疗法的建立提供依据。方法用脂质体转染法将人ＢＭＰ２噬菌粒表达载体ｐＢＫＢ２导入ＮＩＨ３Ｔ３细胞,Ｇ４１８筛选获得阳性细胞克隆。原位杂交、免疫组化及夹心ＥＬＩＳＡ法检测ＢＭＰ２基因的稳定转染及表达分泌,并检测转染细胞增殖活力及碱性磷酸酶和骨钙素的含量。结果转染细胞有ＢＭＰ２ｍＲＮＡ的转录及其蛋白的表达分泌,转染细胞的增殖能力减弱但碱性磷酸酶和骨钙素的含量增加。结论ＢＭＰ２基因在ＮＩＨ３Ｔ３细胞中得到表达并参与了其向成骨样细胞分化的过程。     

重组质粒pcDNA3-gtfB在哺乳动物细胞中的表达

目的:检测含有变形链球菌葡糖基转移酶抗原基因(gtfB)的重组质粒pcDNA3-gtfB能否在哺乳动物细胞 COS-1中正确地转录和表达。方法:采用脂质体介导法,将pcDNA3-gtfB转染哺乳动物细胞COS-1,采用RT-PCR法、免疫组化LSAB法、Western免疫印迹法检测重组质粒的转录水平和表达产物。结果:pcDNA3-gtfB在转染COS-1细胞后具有转录和翻译活性,蛋白质表达产物分子量为116~212 kD,且可与兔抗葡糖基转移酶抗体发生特异性结合。结论:重组质粒pcDNA3-gtfB在哺乳动物细胞中能正确地转录和表达,为其作为基因疫苗进行动物实验提供了依据。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白A真核表达质粒pcDNA3.1/GBD在哺乳动物细胞中的表达

目的　观察变形链球菌葡聚糖结合蛋白A(GbpA)的葡聚糖结合区(GBD)真核表达质粒pcDNA3·1/GBD在哺乳动物细胞COS-7的表达情况。方法　通过基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3·1/GBD,通过脂质体转染法将其转染至COS-7细胞,通过免疫组化SABC法检测其在COS-7细胞的表达。结果　pcDAN3·1/GBD质粒转染的细胞质呈棕黄色染色,胞核无着色,pcDAN3·1空载体转染的细胞质及胞核无着色,空白对照组也无着色。结论　质粒 pcDAN3·1/GBD转染COS-7后能够在细胞内翻译、表达,表达的蛋白质位于细胞质中,可与抗GbpA抗体特异性结合,具有抗原性,可作为基因疫苗。     

成骨蛋白—1成熟蛋白编码区cDNA克隆与序列分析

目的：克隆成骨蛋白－１（ＯＰ－１）成熟蛋白编码区基因。方法：用一步酸酚法从中国健康人胎盘组织中提取总ＲＮＡ，用Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）作引物逆转录合成胎盘ｃＤＮＡ文库，然后利用ＰＣＲ的方法，从ｃＤＮＡ文库中扩增出编码人ＯＰ－１成熟区的基因片段，将所得基因片段插入ｐＧＥＭ－３ｚｆ（＋）载体，转化大肠杆菌后挑选阳性克隆，提取双链ＤＮＡ模板，用ＡＢＩＤＮＡ自动测序仪进行序列测定分析。结果：克隆和测序结果与国外文献报道一致。结论：在国内第一次克隆到ＯＰ－１的成熟蛋白编码区基因。     

小鼠牙本质涎磷蛋白成熟蛋白编码区cDNA克隆与部分序列分析

目的 克隆小鼠牙本质涎磷蛋白（ｄｅｎｔｉｎ ｓｉａｌｏｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ,ＤＳＰＰ）成熟蛋白编码区基因。方法 用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨牙牙胚组织中抽提总ＲＮＡ,用Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）作引物逆转录合成牙胚ｃＤＮＡ,然后利用ＰＣＲ方法,从ｃＤＮＡ中扩增出小鼠ＤＳＰＰ成熟区的基因片段（约３ｋｂｐ）,将所５得基因片段插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ质粒载体,转化到大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ     

小鼠釉原蛋白成熟肽编码区cDNA的克隆和部分序列分析

目的：克隆小鼠釉原蛋白（ＡＭＧ）成熟肽编码区基因。方法：用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨牙牙胚组织中抽提总ＲＮＡ，用Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）作引物逆转录合成牙胚ｃＤＮＡ，然后利用ＰＣＲ方法，从ｃＤＮＡ中扩增出小鼠釉原蛋白成熟区的基因片段（约６７０ｂｐ），将所得基因片段插入ｐＢＳ质粒载体，转化到大肠杆菌ＤＨ５α后挑选阳性克隆，提取重组质粒ＤＮＡ，通过限制性酶切和部分核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：重组质粒ｐＢＳ－ＡＭＧ的酶切图谱和序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到小鼠釉原蛋白成熟肽编码区基因。     

转染突变的BMPsⅡ型受体使NIH3T3细胞的增殖活性降低

目的：探讨转染ＢＭＰｓＩＩ型突变受体的ＮＩＨ３Ｔ３细胞生物学行为的影响。方法：用携带ＢＭＰｓＩＩ型突变受体的ｃＤＮＡ的真核表达载体转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞,对ＮＩＨ３Ｔ３细胞进行生长曲线、ＭＴＴ比色、流式细胞仪分析、ＢｒｄＵ检测。结果：转梁细胞的增殖活性和ＤＮＡ合成下降。结论：转梁的突变体使被转染细胞的增殖活性降低。     

转染骨形成蛋白2基因对细胞凋亡影响的实验观察

目的：探讨骨形成蛋白（ＢＭＰ）与细胞凋亡的关系及意义。方法：利用脂质体转染方法将ＢＭＰ２真核表达载体ｐＢＫ－Ｂ２导入ＮＩＨ３Ｔ３细胞,通过Ｇ－４１８筛选获得阳性细胞克隆。细胞原位杂交和免疫组化检测ＢＭＰ２基因的稳定转染及表达,并利用ＴＵＮＥＬ法观察细胞凋亡情况。结果：ＢＭＰ２基因成功导入ＮＩＨ３Ｔ３细胞并得到表达。转染细胞的凋亡细胞阳性率与未转染细胞相比有显著性差异。结论：ＢＭＰ２能够诱导细胞凋亡,且这种作用与细胞所处的生长分化状态密切相关。     

转染人骨形成蛋白2基因对NIH3TE细胞生物学行为的影响

目的 从分子水平探讨骨形成蛋白对细胞分化的调节作用，并为ＢＭＰ２基因疗法的建立提供依据。方法 用脂持体转染法将入ＢＭＰ２噬菌粒表达载体ｐＢＫ－Ｂ２导入ＮＩＨ３Ｔ３细胞，Ｇ－４１８筛选获得阳性细胞克隆。原位杂交，免疫组化及夹心ＥＬＩＳＡ法检测ＢＭＰ２基因的稳定转染及表达分泌，并检测转染细胞增殖活力及碱性磷酸酶和骨钙素的含量。     

牙龈卟啉单胞菌FimA蛋白和IL-15真核共表达质粒的构建与鉴定

目的 构建含编码牙龈卟啉单胞菌FimA蛋白和IL-15基因的真核共表达质粒,并检测其在哺乳动物细胞中的表达。方法 应用基因重组技术,构建真核表达载体pIRES-fimA和真核共表达载体pIRES-fimA:IL15,通过酶切、PCR及DNA序列测定鉴定获得的质粒,用Lipofectamine 2000介导转染CHO细胞,用Western blot检测重组质粒在哺乳动物中的表达,酶联免疫吸附试验检测培养上清中的蛋白表达。结果 PCR扩增获得的fimA和IL-15目的基因与预计相同,定向插入真核表达质粒pIRES中,插入位相正确,未改变阅读框架。转染的CHO细胞能够检测到目的基因的表达,在培养上清中也可以检测到蛋白质的表达。结论 本实验成功构建了牙龈卟啉单胞菌FimA蛋白和IL-15的真核共表达质粒pIRES-fimA:IL15,为研制增强免疫应答的抗牙龈卟啉单胞菌DNA疫苗奠定了基础。