颌突外胚间充质干细胞参与根尖缺损修复作用的研究

目的:探讨颌突外胚间充质干细胞参与根尖缺损修复的作用。方法:将外胚间充质干细胞复合锻烧骨后移植入大鼠根尖缺损处,以大鼠成纤维细胞复合煅烧骨、空白煅烧骨作为对照,1月后取材,经HE染色鉴定。结果:实验组修复的效果明显好于对照组,形成牙髓牙骨质样物。结论:提示移植的外胚间充质干细胞向该局部组织细胞分化,并参与根尖组织的修复。     

诱导颌突外胚间充质干细胞向成骨细胞分化

目的：探讨外胚间充质干细胞向成骨细胞分化的能力；方法：利用矿化液诱导外胚间充质干细胞分化，通过免疫组化和RT—PCR鉴定，以大鼠成纤维细胞作为对照。结果：显示外胚间充质干细胞经矿化液诱导后，细胞形态发生变化，细胞形态为立方状，紧密排列，类似成骨细胞，随着培养时间增长，可形成矿化结节；免疫组化显示诱导的外胚间充质干细胞表达Ⅰ型胶原；RT—PCR结果说明诱导的外胚间充质干细胞表达成骨细胞特异标志-骨桥素mRNA。而对照组细胞形态未出现变化，也无成骨细胞标志表达。结论：外胚间充质干细胞经矿化液诱导后成为成骨细胞。     

面突外胚间充质干细胞在体内的自发分化

目的：探讨面突外胚间充质干细胞在体内自发分化的情况。方法：取第7代外胚间充质干细胞注射于裸鼠皮下，于第3d、1周、2周取材，HE及免疫组化染色观察细胞的生长及分化情况。结果：注射后细胞团块逐渐变小、消失。HE染色细胞形态多样，数量逐渐减少。注射后3d，细胞仍表达Vimentin，其余染色未见明显阳性，细胞趋于坏死、吸收。1周时，细胞数量少，为成纤维样细胞。2周时，细胞团消失。结论：面突外胚间充质干细胞在体内生长、分化能力不明显，多数细胞坏死、吸收。     

microRNA-145调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的实验研究

目的探讨microRNA-145在大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用。方法取3周龄雄性大鼠胫骨骨髓间充质干细胞,分为阴性对照组与microRNA-145下调组,分别感染慢病毒,观察microRNA-145对大鼠骨髓间充质干细胞在细胞增殖、细胞周期、凋亡和成骨分化方面的影响。结果 microRNA-145下调表达组(p Lv3-(anti)miR-145)与阴性对照组(p Lv3-Negative control)相比,大鼠骨髓间充质干细胞的增殖、细胞周期和凋亡无统计学差异(P>0.05);microRNA-145下调表达组成骨相关基因Sema3A、OPG、Runx2及Osterix/SP7表达均明显高于阴性对照组,且microRNA-145下调组茜素红染色范围也大于阴性对照组。结论 microRNA-145下调表达可以促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化,但对其细胞增殖、细胞周期和凋亡无明显影响。     

牙周炎大鼠上颌骨来源的BM-MSCs中破骨细胞相关因子的表达

目的 :研究来源于脂多糖(LPS)诱导的牙周炎大鼠上颌骨的间充质干细胞(MSC)表达破骨细胞因子的变化。方法:注射脂多糖构建牙周炎大鼠模型,6周后,处死大鼠,利用Micro CT观察上颌骨骨吸收情况,HE染色观察牙周组织的变化,抗酒石酸磷酸酶(TRAP)染色观察上颌骨内破骨细胞的数量;体外分离和培养大鼠上颌骨来源的MSCs,荧光定量PCR(q PCR)检测两组间充质干细胞中M-CSF、OPG和RANKL m RNA表达量,并计算OPG与RANKL的比值。结果:Micro CT显示实验组大鼠上颌骨牙槽骨吸收明显;HE染色显示实验组切片中牙龈明显退缩,结合上皮根向增殖,并有炎性细胞浸润;TRAP染色显示实验组上颌骨内破骨细胞数量明显增多;荧光定量PCR显示实验组BMMSCs表达的M-CSF增加,表达的OPG和RANKL减少,但OPG与RANKL的比值减小,差异具有统计学意义。结论:来源于LPS诱导的牙周炎大鼠,其颌骨的间充质干细胞在炎症状态下,表达的与破骨相关因子上调,可能有增强破骨细胞的功能,能加速骨吸收进程。     

大鼠外胚间充质干细胞的体外生长特性及促进造血恢复的研究

目的:了解大鼠外胚间充质干细胞(EMSC)的生物学特性,探索体内输入EMSC能否促进照射动物造血功能的恢复。方法:取E11.5SD大鼠胚胎颌突,消化法培养获得外胚间充质干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态和生长状况,免疫组化鉴定细胞来源;雄性SD大鼠(180～220g)分为外胚间充质干细胞组(A组)、照射对照组(B组)、成纤维细胞组(C组)、正常对照组(D组),前三组给予60Coγ射线全身照射,剂量6.0cGy,动态观察大鼠外周血变化,并于第4周检测骨髓有核细胞数量;测定大鼠骨髓细胞粒—巨噬细胞(CFU-GM)形成能力;采用内源性脾结节法测定脾集落形成能力。结果:培养的细胞呈单层生长,成纤维状、长梭形、有2～4个突起,抗HNK1、Vi mentin、S-100、NSE染色阳性,抗GFAP、NF、MA染色阴性,证实为未分化外胚间充质细胞;体内植入EMSC能够明显促进大鼠放射后外周血白细胞和血红蛋白的恢复,增加骨髓有核细胞数,减少骨髓造血细胞的坏死、凋亡,促进骨髓细胞的CFU GM的形成率并能有效地支持造血细胞增殖、分化。结论:EMSC具有干细胞特征,能促进照射大鼠造血功能的恢复。     

骨髓间充质干细胞参与牙髓损伤修复的体内实验研究

目的:观察体内的骨髓间充质干细胞(BMMSCs)能否参与牙髓损伤的局部修复,初步探讨骨髓间充质干细胞在牙髓损伤修复中的作用。方法:构建绿色荧光蛋白转基因大鼠骨髓间充质干细胞(GFP-BMMSCs)嵌合SD大鼠模型,30 d后,通过流式细胞术检测外周血单核细胞和骨髓间充质干细胞中荧光细胞的比例,冰冻切片观察心、肝、肾组织中是否有荧光细胞的分布,检测模型是否构建成功。然后利用该模型,通过制备牙本质缺损构建牙髓损伤模型,分别于牙本质缺损后5、10、15 d取材,切片,HE及免疫荧光染色,观察牙髓的病理变化以及GFP-BMMSCs在牙髓组织中的分布情况和变化。结果:HE染色可见牙本质缺损组初期有牙髓充血,后期牙髓炎症逐渐恢复并有修复性牙本质形成。免疫荧光染色可见牙髓组织中有荧光细胞的分布,牙本质缺损组比正常组中可见更多的荧光细胞,且随着牙髓炎症的恢复,荧光细胞减少。结论:牙髓损伤时,骨髓间充质干细胞可以迁移到损伤的牙髓处参与其损伤的修复。     

BMSCs和FG作为种子细胞和支架材料修复大鼠牙槽骨缺损的效果

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)和纤维蛋白胶(FG)作为种子细胞和支架材料修复大鼠牙槽骨缺损的效果。方法选取SD大鼠30只,建立牙槽骨缺损模型,随机分为观察组、阴性对照组和空白对照组,每组10只。观察组植入BMSCs和FG修复大鼠牙槽骨缺损,阴性对照组植入FG,空白对照组不植入,采用HE染色及Micro-CT扫描观察各组成骨效应。结果观察组植入6周后,骨愈合情况良好,愈合面较平整;阴性对照组和空白对照组骨缺损仍存在,无明显成骨;观察组新生骨面积百分比为(76.23±7.11)%,明显高于阴性对照组和空白对照组,差异比较有统计学意义(P<0.05);Micro-CT横断扫描显示:观察组骨缺损处新骨形成,骨缺损基本愈合,与周边无明显界限,阴性对照组和空白对照组无明显成骨,骨缺损仍明显。结论 BMSCs和FG作为种子细胞和支架材料修复大鼠牙槽骨缺损有较好的效果,提高了新骨生成量,是牙槽骨缺损修复的理想材料。     

组织工程骨促进犬牙槽骨再生的体内研究

目的：探讨以犬骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）为种子细胞,Bio-Oss小牛无机骨粉为支架,构建组织工程化骨,结合Bio-Gide胶原膜促进犬牙槽骨再生的可行性。方法：在3只犬的口腔里人工制作12个三壁骨缺损,每只犬的左侧为实验组,右侧为对照组。实验组：植入组织工程化骨;对照组：单纯植入Bio-Oss骨粉。手术后即刻及术后4周,8周,通过影像学和组织学方法（HE,Masson染色）检测骨缺损的再生效果。结果：术后8周,实验组X-ray可见缺损区新生骨骨量明显增加,切片HE染色见新生牙槽骨已充满骨缺损处,骨小梁成团状,Masson染色为红色;对照组X-ray可见骨缺损区阴影变浅,HE染色骨小梁排列凌乱,Masson染色为蓝绿色。结论：组织工程化骨促进犬牙槽骨再生是可行的。     

碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素样生长因子对大鼠外胚间充质干细胞增殖活性的影响

目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对大鼠外胚间充质干细胞增殖活性的影响,为研究颅面与牙齿的发育机制及外胚间充质干细胞的诱导分化提供理论依据。方法 采用四甲基偶氮唑盐(MTT)微量酶反应比色法检测经 10 ng/ml bFGF、100 ng/ml IGF-1刺激4 d后大鼠外胚间充质干细胞的吸光度值。结果 培养4 d后,bFGF处理组吸光度值高于对照组(P<0.05),而IGF-1组及bFGF+IGF-1组与对照组差异均无显著性(P>0.05)。结论 bFGF可促进大鼠外胚间充质于细胞的增殖,bFGF和IGF-1可能协同促进其分化。     

两种新型胶原膜引导骨组织再生的体内外性能研究

目的　研究两种新型胶原膜（鱼胶原、猪胶原）对SD大鼠骨髓间充质干细胞（rat bone marrow mesenchymal stem cells, rBMSCs）成骨分化的影响,并观察其促进SD大鼠颅顶骨缺损修复的效果。方法　利用扫描电镜（SEM）和接触角测量仪表征两种膜的表面形貌及水接触角。在两种膜上培养rBMSCs,并将细胞接种在空白孔板上作为空白对照组。1、3、5、7d时以CCK-8法检测两种膜对rBMSCs增殖的影响,并通过激光共聚焦显微镜观察24h时细胞的粘附与伸展。用碱性磷酸酶（ALP）染色和活性检测,茜素红染色和钙结节半定量测定及实时荧光定量PCR评估两种膜的体外成骨性能。体内实验中,在SD大鼠颅中缝两侧制备直径5mm的骨缺损,在左侧骨缺损区植入鱼胶原膜或猪胶原膜,右侧骨缺损区作为空白对照组,3个月后采用micro-CT检测颅顶骨缺损区骨再生情况。结果　SEM：鱼胶原膜表面致密,猪胶原膜呈疏松多孔的表面。接触角测量仪：猪胶原膜的亲水性强于鱼胶原膜(P<0.05)。CCK-8及激光共聚焦显微镜：细胞在两种膜及空白孔板上24h时铺展良好,7d内稳定增殖。体外成骨性能检测：猪胶原膜上rBMSCs在5 d时的ALP活性、14 d时细胞外基质矿化水平、7d时细胞相关成骨基因Bmp2、Col1、Runx2的表达高于鱼胶原组和空白对照组(P<0.05)。体内成骨实验（3个月）：猪胶原膜促进骨再生明显优于鱼胶原膜和空白对照组（P<0.05）, 鱼胶原膜组和空白对照组无明显差异。结论　猪胶原膜体内外促进骨再生的效果明显优于鱼胶原膜组,具有作为引导骨组织再生膜材料的潜能。     

组织工程骨修复颅骨极限缺损种子细胞归宿的探讨

目的：检测纳米羟基磷灰石复合胶原／聚乳酸材料（nHAC／PLA，nano-hydroxyapatite／collagen／Polyacticacid）与骨髓基质细胞（BMSCs，bone marrow stroma cells）在体外复合构建的组织工程骨修复兔颅骨极限缺损的能力，并探讨种子细胞的归宿。方法：将圆盘状nHAC／PLA与BrdU标记的自体BMSCs复合后，植入新西兰大白兔颅骨直径1．5cm全层缺损中。设自体髂骨组、空白对照组及nHAC／PLA组，术后8w、16w通过X线片、HE染色、Masson’s三色法染色、荧光组织学和免疫组织化学染色，观察比较颅骨缺损的修复情况及种子细胞的归宿。结果：nHAC／PLA＋自体BMSCs组修复颅骨缺损的能力强，与自体髂骨组类似，nHAC／PLA组材料修复骨缺损的能力较弱，但强于空白对照组，组织工程骨的成骨细胞由植入的种子细胞演化而来。结论：nHAC／PLA复合自体BMSCs具有良好的修复骨缺损能力。     

PEGS/β-TCP屏障膜在促进大鼠颅骨缺损骨组织再生中的作用

目的 通过体内和体外实验,探讨PEGS/β-TCP复合膜诱导骨组织再生的效果。方法 将PEGS/β-TCP复合膜与大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）共培养,观察rBMSCs细胞黏附、增殖及成骨分化情况。建立大鼠颅骨缺损动物模型,将PEGS/β-TCP复合膜植入缺损特定区域,通过Micro-CT观察骨缺损区域新骨形成情况;再通过脱钙组织H-E染色,观察炎性浸润程度和新骨形成的情况。采用SPSS 22.0软件包对数据进行统计学分析。结果 rBMSCs可良好黏附和广泛分布于PEGS/β-TCP复合膜上。rBMSCs接种1、4和7 d后进行的dsDNA定量分析结果显示,从第1天到第7天,细胞DNA含量逐渐增加;培养7 d后,实验组细胞DNA含量显著高于对照组（P<0.001）。对接种于PEGS/β-TCP复合膜上的rBMSCs进行体外成骨诱导,其碱性磷酸酶（ALP）染色浓度显著增高。ALP活性半定量检测显示,实验组较对照组细胞ALP活性增加更为显著（P<0.01）。成骨诱导21 d后,实验组与对照组茜素红矿化染色结果与ALP染色结果一致。动物模型Micro-CT检测及组织H-E染色均显示,实验组各检测时间点的新骨形成量显著高于对照组,且各组炎症反应均轻微可控。结论 PEGS/β-TCP复合膜具有理想的细胞相容性和骨引导再生效果。     

牙本质支架体外诱导兔骨髓干细胞分化

目的：探讨将人牙本质作为组织工程支架的可行性,采用不同的方式处理牙本质片,观察牙本质片处理后诱导兔骨髓基质干细胞贴壁附着生长的规律及成骨分化潜能。方法：将兔的骨髓基质干细胞分别接种于经机械去除前期牙本质加EDTA-柠檬酸脱矿处理（A组）,标准根管预备-EDTA处理（B组）的牙本质片上,体外培养1周,扫描电镜观察细胞与牙本质片的附着情况,碱性磷酸酶、茜素红及Vonkossa染色观察兔骨髓基质干细胞成骨分化。结果：兔骨髓基质细胞附着在2种方式处理的牙本质片上生长良好,贴附紧密。B组牙本质片上细胞碱性磷酸酶表达阳性率高达80％,茜素红、Vonkossa染色观察到钙结节数量多于A组。结论：经标准根管预备一EDTA处理的人牙本质能有效促进骨髓基质干细胞增殖及成骨分化,可能成为一种理想的成骨生物支架,并为牙体牙髓疾病的治疗提供了新的思路。广西科学研究与技术开发计划项目（桂科攻1012400lA一42）     

体外成牙环境对牙髓干细胞和外胚间充质干细胞分化的影响

目的利用牙胚细胞（TGC）作为诱导成牙环境,将牙髓干细胞（DPSC）、外胚间充质干细胞（EMSC）分别与其共培养,观察DPSC和EMSC的分化能力。方法利用出生后4 d的大鼠TGC作为诱导成牙环境,将培养的DPSC、EMSC使用BrdU标记及鉴定后与其共培养,免疫荧光双标检测标记细胞表面抗原牙本质涎蛋白（DSP）的表达和碱性磷酸酶（ALP）活性的变化,免疫组化染色鉴定及图像分析DPSC、EMSC在成牙环境中的分化能力。结果共培养7 d后,EMSC共培养组DSP阳性细胞的转化率高于DPSC共培养组（P<0.05）。免疫组化染色图像分析结果表明共培养7 d后,共培养组与TGC单独培养组差异显著（P<0.05）。共培养组3、7 d后ALP活性明显增高,EMSC共培养组较DPSC共培养组ALP活性高。结论混合培养的TGC作为诱导细胞分化的微环境与DPSC、EMSC共培养后,能够诱导细胞向成牙本质细胞分化,EMSC分化能力高于DPSC。     

犬骨髓间充质干细胞复合磷酸钙骨水泥修复骨缺损的实验研究

目的:评价骨髓间充质干细胞复合磷酸钙骨水泥支架材料修复下颌骨缺损的效果。方法:分离培养犬骨髓间充质干细胞(BMSCs)。成骨诱导培养14 d后,分别采用茜素红染色与碱性磷酸酶染色,观察其诱导效果。将细胞与磷酸钙骨水泥(CPC)支架材料复合,用于动物实验。在4只Beagle犬的下颌骨每侧制作3处大小一定的骨缺损。随机将骨缺损分为3组进行处理:BMSCs-CPC组(移植复合种子细胞的支架材料)、CPC组(只移植支架材料)和空白组(不做任何处理)。分别于移植后第4、8周处死2只犬,行大体、X线、骨缺损修复区组织形态观察与计量分析。采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析。结果:术后各组均有不同程度的骨再生。BMSCs-CPC组、CPC组中骨组织再生情况优于空白组。BMSCs-CPC组支架材料降解程度与新骨形成情况优于CPC组。术后第4、8周,BMSCs-CPC、CPC组新生骨面积百分比均显著高于空白对照组(P<0.05),BMSCs-CPC组新生骨面积百分比显著高于CPC组(P<0.01);BMSCs-CPC组中剩余支架材料面积百分比显著低于CPC组(P<0.01)。结论:BMSCs种子细胞复合CPC支架材料是一种有效的、促进新骨再生的骨缺损修复方法,有利于颌骨高度及宽度的保存。     

骨髓间充质干细胞复合脱细胞软骨和富血小板血浆的体内成骨实验

目的:研究骨髓间充质干细胞(BMSCs)和富血小板血浆(PRP)复合物中加入脱细胞软骨碎块(DCM)后的成骨能力.方法:全骨髓贴壁法分离培养兔BMSCs;采集兔新鲜动脉血制备PRP;剪取新鲜兔耳碎化后用化学法脱细胞制备DCM,将BM-SCs与PRP和DCM混合后注射到裸鼠皮下,8周后取材观察成骨情况.结果:体外实验显示本实验分离培养的BMSCs有较强的成骨、成脂分化能力,软骨碎块脱细胞效果理想,8周裸鼠体内结果取材苏木精-伊红染色(HE)和改良Massons染色显示类骨质和骨质较多,甲苯胺蓝(TB)染色显示剩余软骨成分较少.结论:BMSCs-PRP-DCM复合物诱导软骨内成骨.     

兔髁突来源骨髓间充质干细胞体内对骨缺损修复的实验研究

目的:研究兔下颌骨髁突来源骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)的体外分离、培养、鉴定及其体内成骨情况。方法:从兔下颌骨髁突中分离干细胞进行培养,对BMMSCs向成骨、成骨骼肌细胞的分化进行鉴定。实验组将BMMSCs复合于载黄芪多糖(APS)支架材料上,植入骨缺损区;对照组1植入单纯珊瑚羟基磷灰石(CHA)材料;对照组2植入APS/CHA复合材料;空白组不植入任何材料。应用组织学和扫描电镜观察,并比较植入材料与骨组织交界处的成骨修复情况。结果:细胞经过传代后形态一致,呈梭形;ALP染色呈阳性,成骨诱导后形成钙结节;成骨骼肌诱导后desmin免疫细胞化学染色阳性。植入体内修复骨缺损12周,实验组见大量新生骨及活跃的骨细胞;对照组1仅在材料表面见少量新骨形成;对照组2材料内有部分新骨形成;空白组基本未见骨修复。结论:从兔下颌骨髁突中分离、培养出的BMMSCs,具有体内、体外成骨的能力。