变异链球菌LuxS基因表达载体的构建

目的构建可用于变异链球菌表达系统的含LuxS基因的原核表达载体。方法应用聚合酶链反应(PCR)方法分别从变异链球菌的DNA、载体pEGFP-N1中扩增出LuxS基因的启动子(pLuxS)和绿色荧光蛋白(gfp)基因片段,经回收、纯化后,利用分子克隆技术分别克隆入载体pUC19中。结果通过对重组质粒pUC19-pLuxS-gfp的酶切图谱和DNA序列测定分析证实插入片段序列正确。结论成功构建出原核表达重组质粒pUC 19-pLuxS-gfp为下一步的功能研究奠定了基础。     

牙龈卟啉单胞菌精氨酸牙龈素催化结构域基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆牙龈卟啉单胞菌精氨酸牙龈素催化结构域（RgpAcd）基因,并将其置于大肠杆菌中作融合表
达。方法 利用PCR技术和基因重组技术,克隆牙龈卟啉单胞菌RgpAcd,然后插入中介载体pMD18-T中并测序鉴定。将目的基因片段插入原核表达载体pET-15b来构建表达质粒pET-15b/RgpAcd。重组原核表达质粒经酶切鉴定后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达融合蛋白。结果 核酸序列测定与分析的结果表明,克隆的1 476 bp基因序列与GenBank数据库中的序列呈现100%同源性;IPTG诱导后的菌体经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后有一个相对分子质量为5×104的融合表达蛋白产生。结论 本实验成功克隆了牙龈卟啉单胞菌RgpAcd基因,并在大肠杆菌中表达了RgpAcd蛋白,为进一步研制重组活载体疫苗奠定了基础。     

变形链球菌ComE蛋白在大肠杆菌中的高效表达与纯化

目的:构建变形链球菌comE基因原核表达载体,诱导ComE 融合蛋白高效表达,获取高质量的ComE 融合蛋白.方法:提取变形链球菌基因组,PCR 扩增得到变形链球菌comE基因片段,BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后定向克隆到pET28a(+) 表达载体中,并转化入E. Coli BL21(DE3).IPTG 诱导融合蛋白表达,Western blot 鉴定表达产物.进行蛋白表达的可溶性鉴定,并优化诱导时菌液的A600值、IPTG 浓度、诱导时间和温度4 个表达条件.然后用优化的条件大量诱导表达ComE 融合蛋白,采用镍柱和分子筛两步法进行纯化.结果:经PCR、双酶切反应以及测序鉴定,重组质粒中的插入序列为comE基因的全长片段(753 bp),无碱基的突变与读码框架的偏移.Western blot 证实表达产物确为6×His-ComE 融合蛋白,相对分子质量约为33 000.目的蛋白在上清和沉淀中均有表达,且当A600 为0.4 时,加入IPTG 至终浓度0.10 mmol/L,37 ℃诱导4 h后表达量最大.结论:成功构建pET28a(+)-comE 原核表达载体,用优化后的6×His-ComE 融合蛋白在E. Coli BL21(DE3) 中的表达条件,获得纯化的变形链球菌ComE 融合蛋白.     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因特异片段在大肠杆菌中的表达

目的原核表达变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因(glucan-bindingproteinCgene,gbpC)特异片段。方法将克隆获得的约0.45kb的gbpC基因特异片段经EcoRⅠ/SalⅠ双酶切后,定向插入pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1/gbpCE原核融合表达载体,转化感受态大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,酶切及PCR鉴定后,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropy1-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达融合蛋白GST-GbpCE,SDS-PAGE检测表达产物。结果在SDS-PAGE凝胶上出现一条新生蛋白质条带,其相对分子质量约为43000,与预计大小相符合。结论成功表达gbpC特异片段,获得了融合蛋白GST-GbpCE,可用于制备GbpC抗体。     

变形链球菌SBR基因表达载体的构建和表达

目的 :构建可用于大肠杆菌表达系统的含变形链球菌唾液结合区段 (SBR)基因的表达载体。方法 :采用定向克隆方法将变形链球菌唾液结合区段 (SBR)基因插入表达载体 pcMVT7,构建重组原核表达质粒pcMVT7 SBR ,转化大肠杆菌JM 10 9(DE3 ) ,IPTG诱导表达 ,亲和层析纯化目的蛋白。结果 :经酶切鉴定及DNA序列测定 ,重组质粒 pcMVT7 SBR序列及阅读框架正确 ,亲和层析纯化得到SBR融合蛋白。 结论 :SBR表达载体构建成功 ,为防龋疫苗的动物实验研究奠定基础。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因特异片段的克隆和在大肠杆菌中的表达

目的：克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因（Glucan-binding protein C gene，gbpC）编码序列的特异片段，并在大肠杆菌中实现原核表达。方法：根据gbpC序列设计并合成一对寡核苷酸引物，PCR扩增位于gbpC编码序列1342bp～1794bp间的一段特异片段，扩增产物经回收、酶切后，定向插入克隆载体puc18中，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a，挑选阳性克隆，鉴定后进行序列测定。将克隆获得的约0．45kb的gbpC基因特异片段经EcoRI／SalI双酶切后，定向插入pGEX-4T-1中，构建pGEX-4T-1／gbpCE原核融合表达载体，转化感受态大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆，酶切及PCR鉴定后，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）诱导表达融合蛋白GST-GbpC^E，SDS-PAGE检测表达产物。结果：测序结果与Sato等报道的序列一致；原核表达后，在SDS-PAGE凝胶上出现一条新生蛋白条带，其相对分子量约43000，与预计大小相符合。结论：成功克隆并表达gbpC特异片段，获得了融合蛋白GST-GbpC^E，为制备GbpC抗体打下了基础。     

mcpr1基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 :构建mcpr1基因原核表达载体 ,表达MCPR1蛋白。 方法 :采用多聚酶链式反应 (PCR)扩增出mcpr1基因的蛋白编码序列 ,克隆到中间载体中 ,再经双酶切 ,亚克隆到表达载体中 ,构建该基因的融合表达载体pGEX 4T mcpr1,在大肠杆菌中用IPTG诱导表达 ,SDS PAGE电泳。 结果 :酶切和测序鉴定 ,表明融合表达载体内插入片段正确 ,在大肠杆菌中诱导后 ,出现一条 3 60 0 0的新蛋白带 ,主要存在于细菌沉淀中 ,占总蛋白的3 9 %。结论 :研究表明mcpr1基因编码的蛋白质能够在原核细胞中表达 ,为进一步深入研究该蛋白质的结构与功能打下基础     

ADAM28基因原核表达载体的构建和在大肠杆菌中的融合表达

目的:利用消减杂交技术克隆出牙齿发育相关基因ADAM28。方法:本研究为构建ADAM28基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导其表达并纯化出ADAM28蛋白;采用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增出ADAM28基因的蛋白编码序列,克隆到中间载体pMD18-TVector中产生pMD18-T-ADAM28,再经双酶切得到ADAM28片段定向克隆到pGEX-4T-1载体中,构建融合表达载体pGEX-4T-ADAM28;在大肠杆菌中利用IPTG进行诱导表达,得到GST-ADAM28融合蛋白,并经SDS-PAGE电泳初步纯化。结果:①成功构建融合表达载体pGEX-4T-ADAM28,并经酶切鉴定、PCR鉴定和测序验证显示插入的ADAM28序列正确,阅读框架完整,未发现突变。②得到初步纯化的GST-ADAM28融合蛋白。经IPTG诱导后出现一条约35.3×103的新蛋白带。结论:ADAM28基因编码蛋白质能够在原核细胞中表达并纯化,为进一步研究该蛋白质的功能打下基础。     

人成釉蛋白编码区cDNA的克隆和N端肽的融合表达

目的 :克隆人成釉蛋白 (Ameloblastin)编码区基因并原核表达其N端肽。方法 :抽提人牙胚总RNA ,用Oligo(dt)作引物逆转录合成人牙胚cDNAs,然后利用PCR方法 ,从cDNAs中扩增出人成釉蛋白编码区cDNA序列 ,将所得基因片段插入 pGEM -TEasy质粒载体 ,转化入大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆 ,提取重组质粒DNA ,通过限制性酶切和核苷酸序列测定鉴定阳性克隆。将所克隆序列的 5’端 5 5 8bp的片段连入原核表达载体 pGEX - 4T1并在大肠杆菌中诱导表达 ,SDS -PAGE分析。 结果 :克隆片段测序结果与GenBank数据库收录的序列一致 ,经诱导表达见Mr为 4 6× 10 3 的融合蛋白。结论 :克隆到人成釉蛋白编码区cDNA ,并在大肠杆菌中表达了人成釉蛋白N端肽     

GTF-PAc融合防龋DNA疫苗的研究(Ⅰ)携带GLU基因片段的真核表达质粒pGLU的构建

目的 :将变形链球菌葡糖基转移酶GTF I的编码葡聚糖结合区 (GLU)的序列克隆到真核载体 pCI中 ,为构建GTF PAc融合防龋DNA疫苗做准备。方法 :用PCR的方法扩增含gtfB基因的重组质粒 pYNB13的GLU区序列 ;将载体 pCI和GLU扩增片段分别酶切 ,体外连接 ,构建成真核表达质粒pGLU ,酶切电泳鉴定。 结果 :PCR获得了glu目的片段 ,质粒 pGLU含有 glu目的片段。 结论 :构建出了含有gtfB基因重要抗原决定簇区的真核表达质粒 pGLU     

采用酵母表达载体pWX530构建表达人重组牙骨质蛋白1

目的：构建含人重组牙骨质蛋白1（recombination human cementum protein 1,rhCEMPl）基因的真核表达载体,观察其在酿酒酵母细胞中的表达。方法：采用PCR方法扩增rhCEMPl基因,利用定向克隆技术将rhCEMPl基因插入到中间载体pTeasy中,再进一步转插入载体pWX530。重组的pWX530-rhCEMPl在大肠杆菌DH5a中扩增后,通过酶切电泳鉴定和DNA序列测定所构建的质粒。经鉴定正确的表达载体pWX530-rhCEMPl转入酵母感受态细胞中,酵母经氨基酸营养缺陷型筛选后培养表达。利用聚丙烯酰胺凝胶（SDS—PAGE）电泳和酶联免疫吸附测定（ELISA）分析蛋白表达情况,离子交换层析提纯蛋白。结果：构建的重组质粒成功转入酵母细胞,通过SDS—PAGE和ELISA检测rhCEMPl表达成功。结论：成功构建的含m—CEMPl基因的真核表达载体pWX530-rhCEMPl,并能转入酵母细胞中成功表达。     

构建用于酵母表达的hrCEMP1真核表达载体

目的：构建用于酵母表达的含hrCEMP1基因的真核表达载体。方法：采用PCR方法扩增hrCEMPI基因,利用定向克隆技术将hrCEMP1基因插入到中间载体pTeasy中,再进一步转插入载体pWX530中。重组的pWX530-hrCEMP1在大肠杆菌DH5ct中扩增后,通过酶切电泳鉴定和DNA序列测定质粒构建是否成功。结果：酶切电泳鉴定和DNA序列测定证实重组质粒插入基因序列为hrCEMP1 cDNA。结论：成功构建含hrCEMP1基因的真核表达载体pWX530-hrCEMP1,该载体可直接转入酵母表达,为大批量获得CEMP1蛋白并进行牙周组织重建研究奠定基础。     

伴放线放线杆菌细胞膨胀致死毒素重组蛋白的表达

目的 通过分子克隆技术构建细胞膨胀致死毒素(cytolethal distending toxin,CDT)的重组表达载体,并诱导重组CDT蛋白的表达,以期为重组CDT蛋白的生物学功能研究奠定基础.方法 采用聚合酶链反应(PCR)扩增获得CDT的编码基因cdtABC,通过TA克隆和限制性酶切将cdtABC与目的载体pQE60连接,转化感受态大肠杆菌后诱导重组COT蛋白的表达,收集细菌总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法鉴定.结果 pQE60-cdtABC转染的感受态大肠杆菌中均携带cdtABC基因,该片段与GenBank中的DNA一致性高达99%.细菌总蛋白中21 000、25 000、32 000左右的蛋白增多,蛋白质印迹法检测发现带有6-His标记的目的蛋白.结论 本研究成功构建了CDT的重组表达载体,并诱导重组CDT蛋白的表达.     

伴放线放线杆菌细胞膨胀致死毒素重组蛋白的表达

目的 通过分子克隆技术构建细胞膨胀致死毒素(cytolethal distending toxin,CDT)的重组表达载体,并诱导重组CDT蛋白的表达,以期为重组CDT蛋白的生物学功能研究奠定基础.方法 采用聚合酶链反应(PCR)扩增获得CDT的编码基因cdtABC,通过TA克隆和限制性酶切将cdtABC与目的载体pQE60连接,转化感受态大肠杆菌后诱导重组COT蛋白的表达,收集细菌总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法鉴定.结果 pQE60-cdtABC转染的感受态大肠杆菌中均携带cdtABC基因,该片段与GenBank中的DNA一致性高达99%.细菌总蛋白中21 000、25 000、32 000左右的蛋白增多,蛋白质印迹法检测发现带有6-His标记的目的蛋白.结论 本研究成功构建了CDT的重组表达载体,并诱导重组CDT蛋白的表达.     

伴放线放线杆菌细胞膨胀致死毒素重组蛋白的表达

目的 通过分子克隆技术构建细胞膨胀致死毒素(cytolethal distending toxin,CDT)的重组表达载体,并诱导重组CDT蛋白的表达,以期为重组CDT蛋白的生物学功能研究奠定基础.方法 采用聚合酶链反应(PCR)扩增获得CDT的编码基因cdtABC,通过TA克隆和限制性酶切将cdtABC与目的载体pQE60连接,转化感受态大肠杆菌后诱导重组COT蛋白的表达,收集细菌总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法鉴定.结果 pQE60-cdtABC转染的感受态大肠杆菌中均携带cdtABC基因,该片段与GenBank中的DNA一致性高达99%.细菌总蛋白中21 000、25 000、32 000左右的蛋白增多,蛋白质印迹法检测发现带有6-His标记的目的蛋白.结论 本研究成功构建了CDT的重组表达载体,并诱导重组CDT蛋白的表达.     

伴放线放线杆菌细胞膨胀致死毒素重组蛋白的表达

目的 通过分子克隆技术构建细胞膨胀致死毒素(cytolethal distending toxin,CDT)的重组表达载体,并诱导重组CDT蛋白的表达,以期为重组CDT蛋白的生物学功能研究奠定基础.方法 采用聚合酶链反应(PCR)扩增获得CDT的编码基因cdtABC,通过TA克隆和限制性酶切将cdtABC与目的载体pQE60连接,转化感受态大肠杆菌后诱导重组COT蛋白的表达,收集细菌总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法鉴定.结果 pQE60-cdtABC转染的感受态大肠杆菌中均携带cdtABC基因,该片段与GenBank中的DNA一致性高达99%.细菌总蛋白中21 000、25 000、32 000左右的蛋白增多,蛋白质印迹法检测发现带有6-His标记的目的蛋白.结论 本研究成功构建了CDT的重组表达载体,并诱导重组CDT蛋白的表达.     

伴放线放线杆菌细胞膨胀致死毒素重组蛋白的表达

目的 通过分子克隆技术构建细胞膨胀致死毒素(cytolethal distending toxin,CDT)的重组表达载体,并诱导重组CDT蛋白的表达,以期为重组CDT蛋白的生物学功能研究奠定基础.方法 采用聚合酶链反应(PCR)扩增获得CDT的编码基因cdtABC,通过TA克隆和限制性酶切将cdtABC与目的载体pQE60连接,转化感受态大肠杆菌后诱导重组COT蛋白的表达,收集细菌总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法鉴定.结果 pQE60-cdtABC转染的感受态大肠杆菌中均携带cdtABC基因,该片段与GenBank中的DNA一致性高达99%.细菌总蛋白中21 000、25 000、32 000左右的蛋白增多,蛋白质印迹法检测发现带有6-His标记的目的蛋白.结论 本研究成功构建了CDT的重组表达载体,并诱导重组CDT蛋白的表达.     

伴放线放线杆菌细胞膨胀致死毒素重组蛋白的表达

目的 通过分子克隆技术构建细胞膨胀致死毒素(cytolethal distending toxin,CDT)的重组表达载体,并诱导重组CDT蛋白的表达,以期为重组CDT蛋白的生物学功能研究奠定基础.方法 采用聚合酶链反应(PCR)扩增获得CDT的编码基因cdtABC,通过TA克隆和限制性酶切将cdtABC与目的载体pQE60连接,转化感受态大肠杆菌后诱导重组COT蛋白的表达,收集细菌总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法鉴定.结果 pQE60-cdtABC转染的感受态大肠杆菌中均携带cdtABC基因,该片段与GenBank中的DNA一致性高达99%.细菌总蛋白中21 000、25 000、32 000左右的蛋白增多,蛋白质印迹法检测发现带有6-His标记的目的蛋白.结论 本研究成功构建了CDT的重组表达载体,并诱导重组CDT蛋白的表达.     

伴放线放线杆菌细胞膨胀致死毒素重组蛋白的表达

目的 通过分子克隆技术构建细胞膨胀致死毒素(cytolethal distending toxin,CDT)的重组表达载体,并诱导重组CDT蛋白的表达,以期为重组CDT蛋白的生物学功能研究奠定基础.方法 采用聚合酶链反应(PCR)扩增获得CDT的编码基因cdtABC,通过TA克隆和限制性酶切将cdtABC与目的载体pQE60连接,转化感受态大肠杆菌后诱导重组COT蛋白的表达,收集细菌总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法鉴定.结果 pQE60-cdtABC转染的感受态大肠杆菌中均携带cdtABC基因,该片段与GenBank中的DNA一致性高达99%.细菌总蛋白中21 000、25 000、32 000左右的蛋白增多,蛋白质印迹法检测发现带有6-His标记的目的蛋白.结论 本研究成功构建了CDT的重组表达载体,并诱导重组CDT蛋白的表达.     

伴放线放线杆菌细胞膨胀致死毒素重组蛋白的表达

目的 通过分子克隆技术构建细胞膨胀致死毒素(cytolethal distending toxin,CDT)的重组表达载体,并诱导重组CDT蛋白的表达,以期为重组CDT蛋白的生物学功能研究奠定基础.方法 采用聚合酶链反应(PCR)扩增获得CDT的编码基因cdtABC,通过TA克隆和限制性酶切将cdtABC与目的载体pQE60连接,转化感受态大肠杆菌后诱导重组COT蛋白的表达,收集细菌总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法鉴定.结果 pQE60-cdtABC转染的感受态大肠杆菌中均携带cdtABC基因,该片段与GenBank中的DNA一致性高达99%.细菌总蛋白中21 000、25 000、32 000左右的蛋白增多,蛋白质印迹法检测发现带有6-His标记的目的蛋白.结论 本研究成功构建了CDT的重组表达载体,并诱导重组CDT蛋白的表达.