2项对诊断儿童人巨细胞病毒活动性感染的比较

目的比较血清人巨细胞病毒(HCMV)-IgM抗体(以下简称IgM抗体)与HCMV pp65抗原(以下简称pp65)两种方法对HCMV活动性感染诊断检测的实用意义。方法采集临床疑似HMCV活动性感染儿童血标本91份,分离血浆和多形白细胞,分别用于IgM抗体检测和pp65抗原检测,同时用聚合酶链反应(PCR)检测HCMV DNA,与pp65抗原作平行比较。结果 pp65抗原检测的结果与IgM抗体检测的符合率为70.3%,与HC-MV DNA检测相比,pp65抗原检测的符合率、特异性和敏感度分别为85.5%、70.6%和75.6%,而且高pp65抗原血症与患者临床症状密切相关。结论 pp65抗原血症反映该病毒活动状况,可监测HCMV活动性感染。     

婴儿肝炎综合征中人类巨细胞病毒感染检测方法的比较

目的：探讨婴儿肝炎综合征中人类巨细胞病毒(HCMV)感染的检测方法。方法：用HCMV pp65抗原血症法及荧光定量聚会酶链反应(FQ-PCR)法检测24例患儿34份血浆及多形核白细胞(PMNLs)标本。结果：HCMV pp65抗原血症法诊断巨细胞病毒感染所致婴儿肝炎综合征的特异度为100％，灵敏度为90％；FQ-PCR法检测PNNLs的特异度为100％，灵敏度为60％；血浆FQ-PCR法的特异度为100％，灵敏度为50％。同一份血标本其血浆中的HCMVDNA拷贝数低于PMNLs，使得血浆FQ-PCR法在HCMV诊断及疗效观察方面具有滞后现象。动态观察发现HCMV pp65抗原血症法与FQ-PCR法检测的PMNLs结果与婴儿肝炎综合征患儿的治疗过程有较好的符合率。结论：HCMV pp65抗原阳性与HCMV活动性感染密切相关，可作为婴儿肝炎综合征患儿疗效的观察指标。HCMV pp65抗原血症法与FQ-PCR法可作为临床诊断HCMV症状性感染的一种快速、有效的实验室方法。     

人巨细胞病毒被膜磷蛋白pp65重组抗原酶联免疫吸附法的建立与两种方法的比较分析

目的用我们研制的一种新人巨细胞病毒(HCMV)重组被膜磷蛋白pp65为抗原，建立快速、简便和特异的检测HCMVIgM的间接酶联免疫吸附法(REC—EL．ISA)。方法用自行设计、表达的新的HCMV pp65重组抗原，建立REC—ELISA，并检测100份临床疑似为HCMV感染者血清中HCMV—IgM，同时与全病毒为抗原的间接ELISA法(简称全病毒一ELISA法)和美国BioCheck试剂盒(简称BioCheck法)检测结果进行比较。结果REC—ELISA法重组抗原最适量为3．5μg／孔，HRP标记二抗为1：800，血清稀释度为1：100；稳定性试验阳性变异系数(CV)为9．5％，重复性试验平均CV值：批内CV 4．5％，批间CV 9．6％。REC—ELISA法、全病毒-ELISA法和BioCheck法检测HCMV IgM的阳性率分别为44％、50％和45％；REC—ELISA法的敏感性为95．6％，其特异性(98．2％)高于全病毒-ELISA法(90．9％)；正确指数为92．8％，与BioCheck法一致性为97．0％。结论用pp65重组抗原建立的REC—ELISA法具有高度特异性与敏感性，且操作简单、快速，重复性好；与全病毒抗原相比，重组抗原可规模化、标准化生产，且更安全、经济，具有良好的临床应用前景。     

酶联免疫吸附试验检测人类巨细胞病毒抗体在肝移植患者术后诊断及监测中的应用

目的 客观评价传统的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测人巨细胞病毒(HCMV)抗体对肝移植患者术后诊断和监测HCMV感染的意义.方法 对108例肝移植术后患者分别用ELISA检测HCMV特异性抗体IgM、用免疫组化法检测HCMV低基质磷酸化蛋白(pp65)抗原血症、用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测HCMV DNA,将这3种方法的检测结果进行比较.结果 108例患者中,IgM阳性者8例,pp65抗原阳性者10例,DNA阳性者12例.ELISA的敏感性较其他2种方法略低,但3种方法的特异性和阴性预测值之间差异无显著性.此外,ELISA检测HCMVIgM阳性者,其结果均在临床症状出现后6～14 d检出,而pp65阳性者和HCMV DNA阳性者均在临床症状出现前被检出.结论应用ELISA检测HCMV抗体可以用于诊断监测HCMV感染情况,但有一定的局限性.     

荧光定量PCR与PP65抗原检测在诊断儿童巨细胞病毒活动性感染的比较

目的用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)和pp65抗原检测儿童人巨细胞病毒(HCMV)感染,并对其诊断HCMV活动性感染进行比较评估。方法分析924例HCMV血清学检测阳性的儿童的全血HCMV-DNA荧光定量PCR及HCMV-pp65抗原检测结果,与临床诊断的符合程度进行比较。结果全血HCMV-DNA荧光定量PCR和pp65抗原检测的一致率为81.17%,其标准误为0.39,Kappa值为0.60;PCR检测HCMV感染的灵敏度为98.4%,特异度为97.3%,Youden指数为0.957,PVP和PVN分别为0.961和0.989;pp65抗原检测用于检测HC-MV感染的灵敏度为59.2%,特异度为100%,Youden指数为0.592,PVP和PVN分别为1.00和0.782。结论全血HCMV-DNA荧光定量PCR和pp65抗原检测的结果有较好的一致性,诊断HCMV感染PCR检测的灵敏度较pp65抗原检测的灵敏度要高,而后者的特异度较前者高。二种方法都可用于CMV活动性感染的诊断。     

人巨细胞病毒低基质蛋白pp65亲水性片段的克隆与表达

目的 为建立人巨细胞病毒（HCMV）活动性感染检测方法，表达HCMV早期复制的标志物pp65蛋白，以制备相应的抗体。方法 将pp65全基因和其亲水性强、有抗原代表性的片段（pp65 hp）分别克隆到表达载体pET22b（＋）中诱导表达，并以免疫印迹考察重组蛋白的抗原性。结果 重组rpp65全蛋白表达量低于全菌体蛋白的5％，而rp65 hp蛋白获得高效表达，约为全菌体蛋白的40％，并与HCMV IgG抗体特异性结合。结论 亲水性pp65 hp片段有较好的抗原性，可以制备相应的抗体，来检测HCMV活动性感染。     

检测pp65抗原和IgM抗体对移植患者CMV活动性感染监测价值比较

目的　比较血pp6 5抗原和IgM抗体检测对移植患者巨细胞病毒 (CMV)活动性感染的诊断价值。方法　收集 5 8位移植患者的血标本 (共 2 0 8份 ) ,分离血浆和多形核白细胞 ,血浆用于CMVIgM抗体检测 (ELISA) ,白细胞用于pp6 5抗原血症检测(荧光免疫组化 )。同时随机取部分血浆标本进行荧光定量PCR分析 ,检测CMVDNA。结果　pp6 5抗原阳性细胞数与CMVDNA拷贝数呈正相关 (r=0 .87) ,也与病人的临床症状密切相关 ,可用于监测移植患者CMV的活动性感染。IgM抗体与pp6 5抗原阳性的一致率为 2 1.2 % ,对CMV感染的敏感性为 2 2 .3% ,特异性为 95 .6 %。结论　pp6 5抗原阳性细胞数能反映CMV的数量 ,可监测CMV活动性感染 ,检测方法特异、灵敏、操作简单 ,适宜临床实验室应用。血清IgM抗体检测因为敏感性较低 ,不适用于移植患者CMV活动性感染的监测。     

外周血白细胞中人巨细胞病毒pp65抗原的定位及意义

目的明确人巨细胞病毒（HCMV）磷酸基质蛋白65（pp65）抗原在阳性细胞中的定位并初探其定位与病毒活动间的关系，为指导临床病毒抗原血症的监测提供依据。方法利用4，6-联脒-2-苯基吲哚（DAPI）荧光染料能与细胞双链DNA结合的特点，在激光共聚焦显微镜下对HCMV pp65单抗阳染细胞进行抗原定位；同时通过外周血白细胞与病毒共培养技术，检测分析其定位与病毒活动的关系。结果临床标本检测的HCM-Vpp65抗原阳染细胞的表现形式有3种，即细胞浆型、细胞核型和细胞浆核混合型，其中细胞核中的HCMV pp65抗原聚集于细胞核的内部，而非仅仅附着于核表面。进一步的白细胞与病毒共培养结果显示，只有野生型病毒株感染的人胚肺成纤维细胞（HELF）与外周血白细胞共培养，才能检出HCMV pp65抗原阳性的白细胞，而且表现为仪初期（培养1h内）可检出细胞浆阳染型，随着时间延长，约80％～90％的抗原阳染白细胞表现为细胞核型，偶见细胞浆核混合型。结论HCMV pp65抗原血症时阳染的外周血白细胞的表现形式有3种，即细胞核型、细胞浆型以及细胞浆核混合型，其中细胞核型属细胞核内部型，并非细胞核表面附着型。结合共培养结果认为，细胞核型阳染细胞的检出更能提示病毒的活动。     

抗巨细胞病毒pp65抗原单克隆抗体的制备及临床初步比对检测

目的：制备抗巨细胞病毒pp65单克隆抗体并建立外周血巨细胞病毒抗原血症免疫荧光检测方法。方法 CM V AD169感染人胚胎肺成纤维细胞M RC‐5后24、48、72h ,超声波破碎和甲醛灭活制备CM V抗原,以及CMV pp65重组抗原免疫BALB／C小鼠,标准方法制备抗巨细胞病毒pp65单克隆抗体。利用所得单克隆抗体建立检测外周血巨细胞病毒抗原血症检测的实验方法,并与进口试剂盒CM V BriteTM Kit进行比对。结果共有两株杂交瘤细胞产生特异性抗体,克隆名称为13D1‐3和29F1‐1,免疫球蛋白亚型分别是IgG1型和IgG2a型,制备的腹水抗体纯化后仍具有良好的免疫学特性。单克隆抗体13D1‐3与 CM V BriteTM Kit试剂盒比对,阳性符合率为88．8％,阴性符合率为98．9％,总符合率为97．3％,Kappa值为0．895,吻合度较高。结论成功制备抗巨细胞病毒pp65单克隆抗体,建立以13D1‐3单克隆抗体为基础的检测外周血巨细胞病毒抗原血症方法,与CM V BriteTM Kit试剂盒比对具有良好的符合性。     

人巨细胞病毒pp65蛋白的研究进展

人巨细胞病毒（HCMV）pp65抗原血症的监测用于HCMV活动性感染的诊断已成为国际公认的相对“金标准”。此外，利用pp65蛋白能刺激、诱导病毒特异性CD8^＋T细胞活化与增殖特性，用于检测宿主对HCMV的特异性细胞免疫功能，已为疾病的治疗和预防开创新思路和新方法。本文就HCMVpp65蛋白的特性以及在HCMV感染的诊断、治疗和预防上的应用进行综述。     

儿童抽动-秽语综合征HCMV pp65抗原检测的临床意义

目的探讨儿童巨细胞病毒(Hum an cytom egalov irus,HCMV)活动性感染与抽动-秽语综合征(T ourette’s sym-drom e,TS)的关系。方法离心分离64例抽动-秽语综合征患儿和40例正常儿童外周血单个核细胞(PBM C s)和血浆,分别用免疫荧光法和定量PCR检测HCMV pp65抗原和HCMV DNA,并比较2种方法的一致性。结果64例TS患儿HCMV pp65抗原有14例阳性,阳性率21.9%,40例正常儿童HCMV pp65抗原有1例阳性,阳性率2.5%,2组儿童HCMV感染率有显著性差异(2χ=7.49,P<0.01)。免疫荧光法和实时定量PCR有较好的一致性(89.1%)。结论抽动-秽语综合征儿童HCMV感染率显著高于正常儿童,HCMV活动性感染可能诱发抽动-秽语综合征。     

尿液HCMV-DNA和血清HCMV-IgM检测对婴儿巨细胞病毒感染的诊断价值

目的：探讨尿液人巨细胞病毒‐DNA和血清人巨细胞病毒免疫球蛋白检测在婴儿巨细胞病毒感染中的诊断价值。方法对泉州儿童医院收治的856例巨细胞病毒感染疑似住院患儿,采用化学发光免疫法检测血清人巨细胞病毒免疫球蛋白,采用荧光定量聚合酶链反应法检测尿液中巨细胞病毒载量,并进行统计分析。结果尿人巨细胞病毒‐DNA 和血清人巨细胞病毒免疫球蛋白阳性检出率分别为30．72％和34．93％（ P＞0．05）;不同性别疑似感染率差异无统计学意义（P＞0．05）,不同年龄组人巨细胞病毒免疫球蛋白与人巨细胞病毒‐DNA检测差异有统计学意义（P＜0．01）;不同年龄组荧光定量聚合酶链反应检测差异有统计学意义（P＜0．01）,三个年龄组中＜28 d组阳性率最低,6个月‐1岁组最高。结论尿液人巨细胞病毒‐DNA和血清人巨细胞病毒免疫球蛋白联合检测,有助于人巨细胞病毒感染的诊断。     

人巨细胞病毒pp65 IgG亲和指数在人巨细胞病毒原发感染小鼠模型中的标志作用

目的 通过对人巨细胞病毒(human eytomegalovims,HCMV)原发感染BALB/c模型小鼠感染状态的实验研究,探索检测HCMV pp65 IgG亲和指数(avidity index,AI)在原发感染诊断中的意义和作用.方法 取6～8周龄SPF(Specific Pathogen Free)级BALB/c雌性小鼠30只,分为5组,每组6只,分别用2×105、2×105、2×104、2×103和2×102PFU/ml的5个剂量的病毒悬液腹腔注射小鼠,1.0 ml/只;另取浓度为2×106PFU/ml剂量的病毒,经56℃30 min灭活后,1.0 ml/只腹腔注射雌性小鼠共6只,作为灭活对照组;同株同代的HF细胞悬液1.0 ml/只腹腔注射雌性小鼠共6只,作为HF细胞对照组.各组小鼠于屏障系统内饲养1个月后,检测小鼠的感染状态.病毒分离检测脑、肺组织中感染性病毒颗粒,观察HCMV特异性细胞病变效应,PCR试验检测细胞培养物UL83基因,间接免疫荧光试验检测细胞玻片pp65抗原;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测小鼠脑、肺组织中HCMV pp67的转录;同时,用本室自制的截短pp65抗原制备的ELISA试剂盒检测血清标本中HCMVpp65特异性IgM抗体和IgG-Al.结果 2×104PFU/ml和2×105PFU/ml剂量的病毒感染小鼠后,脑、肺组织中均可检测到感染性病毒颗粒,感染率均为100%;RT-PCR均可检测到小鼠脑、肺组织中pp67转录产物;血清学检测这两组小鼠HCMV pp65 IgM均为阳性,HCMV pp65 IgG-AI＜50%;检测结果判断该两组小鼠为HCMV原发感染.余低剂量病毒组、灭活病毒组和人胚成纤维细胞(HF)对照组检测结果均为阴性.结论 HCMV AD169株可感染BALB/c小鼠,初次感染病毒1个月后可表现原发感染状态;以HCMV pp65重组蛋白为抗原榆测特异性IgM抗体以及相应IsG-AI间接ELISA法,可作为对HCMV原发感染的初筛手段,是诊断HCMV原发感染有效的方法之一.     

人巨细胞病毒gp52蛋白与pp65蛋白融合表达及初步应用

为提高HCMVIgM抗体检测试剂盒的敏感性及特异眭．本研究重组表达了HCMV糖蛋白gp52与磷蛋白DD65的嵌台抗原。从病毒及质粒中分别扩增gp52(氨基酸181～333，f1)及pp65(氨基酸261～373，f2)两个片段．以不同酶切位点插人到pTrcHi B载体上，筛选正确的重组质粒并在太肠杆菌中诱导表达融合蛋白rp52～65。SDE-PAGE结果显示表达蛋白占菌体总蛋白的30％，卧包涵体的形式存在，分子量为35000。以金属鳌合亲和屡析(IMAC)及分子筛方法纯化表达蛋白，纯度达到96％，回收率为252％。以间接法检测HCMV IgM阳性血清，敏感性达到904％(19／21)，证明此融合蛋白具有良好的抗原性，可作为HCMV IgM抗体检测试剂盒的包被抗原。     

尿液上皮细胞中巨细胞病毒载量预测婴儿巨细胞病毒激活感染的价值

目的 探讨尿液上皮细胞(EC)中人巨细胞病毒(HCMV)DNA载量预测婴儿活动性HCMV感染的应用价值.方法 分别收集82例HCMV潜伏感染组和84例活动性感染组婴儿外周血和尿液标本,采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCB)和化学发光免疫分析检测血浆HCMV DNA载量和HCMV IgM/IgG抗体;间接免疫荧光法检测外周血多形核白细胞(PMNLs)中HCMV pp65抗原;UF-100尿沉渣全自动分析仪和FQ-PCR分别做尿液EC计数和HCMV DNA载量检测,并计算尿液EC中HCMV DNA载量.同时,用受试者工作特征曲线(ROC)评价尿液上皮细胞中HCMV DNA载量在婴儿HCMV激活感染诊断中的敏感度和特异度.结果 166例HCMV感染婴儿尿液上皮细胞中HCMV DNA阳性检出率最高,为94.58%(157/166),病毒载量范围为5.67×102-1.31×107拷贝/103EC;不同时段尿液EC中HCMV DNA载量差异无统计学意义(F=0.19,P>0.05);活动性感染组尿液EC中HCMV DNA载量[5.13±0.99(拷贝/103EC,lg)]显著高于潜伏感染组[3.92±0.82(拷贝/103EC,lg),t=8.52,P<0.01];根据ROC曲线,当cut-off值为4.55时,尿液EC中HCMV DNA载量对活动性感染诊断的敏感度和特异度分别为71.4%和75.2%;活动性感染患儿更昔洛韦治疗后尿液EC中HCMV DNA载量显著低于治疗前(t=5.44,P<0.01).结论 尿液EC中HCMV DNA载量用于预测婴儿HCMV活动性感染是一种简便、有效的方法,并能用于治疗监测.     

人巨细胞病毒IE抗原快速免疫荧光检测法在先天性人巨细胞病毒感染筛查中的应用

目的探讨人巨细胞病毒(HCMV)IE抗原快速免疫荧光检测法在先天性HCMV感染筛查中的应用价值。 方法收集2017年1至12月安徽省妇幼保健院产科352例新生儿唾液标本和足底干血片标本。使用病毒分离培养和HCMV IE抗原快速免疫荧光检测法检测新生儿唾液标本;使用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测足底干血片标本HCMV-DNA。以病毒分离培养的结果作为标准,比较HCMV IE抗原快速免疫荧光检测法和足底干血片标本荧光定量PCR法在检测先天性HCMV感染中的检验效能。 结果352例唾液标本共分离5例阳性标本,阳性率为1.42%;而荧光定量PCR检测足底干血片标本仅4例阳性,阳性率为1.14%;HCMV IE抗原快速免疫荧光检测法检测的结果与病毒分离完全一致。足底干血片荧光定量PCR检测的敏感度为80%,特异度为100%;HCMV IE抗原快速免疫荧光检测的敏感度为100%,特异度为100%。HCMV IE抗原快速免疫荧光检测的敏感度高于足底干血片荧光定量PCR检测,但差异无统计学意义(Z＝0.94,P＝0.350)。 结论HCMV IE抗原快速免疫荧光检测可能是更准确的先天性HCMV感染早期诊断方法。