冷冻干燥保存血小板的实验研究

本研究探讨冷冻干燥保存血小板的方法,以获得可长期冻干保存的血小板制品,使之能在常温条件下保存、占用空间小、重量轻、便于长距离运输,能够满足突发事件和战伤救治的需要。在冷冻干燥保存过程中添加血小板可逆性激活抑制剂、DMSO和海藻糖等低温保护剂,进行预处理、冷冻、一级干燥、二级干燥,再水化,并同时测定血小板回收率,凝血酶聚集反应,促凝血功能,CD62p表达率和PAC-1表达率等。结果表明:血小板回收率为56.29%,其对凝血酶的聚集反应与对照组无明显差异,对ADP和丙基没食子酸诱导的聚集反应较对照组分别降低49.34%和26.25%,促凝血功能与对照组比较也无统计学差异;冻干血小板CD62p表达率为42.36%,PAC-1表达率为2.12%,凝血酶激活后CD62p再表达率为50.88%,PAC-1再表达率为54.55%。结论:添加血小板可逆性激活抑制剂,海藻糖和DMSO后的冻干血小板,其聚集活性和促凝血功能与新鲜血小板无明显差异,血小板可逆性激活抑制剂降低了冻干血小板的CD62p表达,增强了冻干血小板的生存能力,因而延长了其生存时间,因此可以该冻干方法为基础进一步提高冻干保存血小板的效率。     

冻干血小板功能的体外评价

目的评价冻干血小板的体外功能。方法将经过可逆性激活抑制、添加DMSO和海藻糖等低温保护剂、冷冻干燥后获得的血小板再水化,与新鲜血小板比较,应用流式仪检测分析其CD62p和PAC-1的表达,评价血小板活化状态和血小板反应能力;应用APACT检测诱导剂诱导的血小板最大聚集率并用SPAT评价血小板聚集和促凝血活性;应用扫描电镜和透射电镜技术研究血小板的形态和超微结构的变化。结果经过血小板激活抑制剂和冻干保护剂预处理的冻干血小板,再水化后对凝血酶的最大聚集率(79.0%)与对照组(86.2%)差异无统计学意义(P>0.05),对ADP和没食子酸诱导的聚集反应比对照分别降低49.34%和26.25%;经凝血酶激活后CD62p再表达率为50.88%略低于对照组70.32%(P<0.05),PAC-1再表达率为54.55%与对照组63.38%无明显差异;促凝血功能SPAT检测结果69.4 s与对照组70.6 s差异无统计学意义(P>0.05)。结论经过冷冻干燥保护剂和血小板激活抑制剂预处理后获得的冻干血小板,体外聚集活性和促凝血功能接近新鲜血小板。     

冻干血小板保护液优化的实验研究

目的优化冻干血小板保护液,减少冻干过程对血小板的损害,有效保护其功能。方法采用3因素3水平的正交设计法,对血小板膜保护剂、血小板激活抑制剂、蛋白质类保护剂的3类成分组成的保护液进行优选。检测血小板最大聚集率、血小板活化标志PAC-1、CD62P的阳性表达率和血小板回收率,通过比较其差异,筛选出本实验的最优冻干血小板保护液。以优化保护液对血小板处理后进行冻干,并以此为实验组,与新鲜血小板和原保护液处理后冻干血小板进行比较验证,验证指标与优选指标相同,比较3者4项指标之间的差异。结果正交设计试验结果显示:血小板最大聚集率组间最高(74.33±24.01)%,血小板活化标志PAC-1和CD62P低于9组平均水平,血小板回收率高于9组平均水平。以主要体现血小板功能的血小板最大聚集率为优先指标,结合其余3项检测指标进行综合分析,在原保护液的基础上,筛选出添加了2%DMSO、第2信使调节剂、2 mmol/L维生素B6,75%的PPP保护液组为最优组合。验证实验结果显示,优化保护液组血小板最大聚集率(76.12±6.02)%,与原保护液组相比,差异有统计学意义(P0.05),与新鲜血小板组相比,差异没有统计学意义(P0.05)。最优保护液组血小板激活标志PAC-1和CD62P阳性表达率分别为(3.23±0.49)%和(36.83±8.21)%,2者与原保护液组、新鲜血小板组相比,差异无统计学意义(P0.05);最优保护液组冻干血小板复水化后血小板回收率为(85.90±2.24)%,与原保护液组相比,差异无统计学意义(P0.05)。结论本实验优化的血小板保护液优于原保护液,明显提高了冻干血小板复水化后最大聚集率,能更好地保护血小板的功能,但对血小板冻干过程的保存损害问题没有得到更好的改善,有待下一步深入研究。     

冻干血小板再水化后聚集

本研究旨在观察冻干血小板再水化后聚集反应性变化。以4种不同浓度的凝血酶、瑞斯托霉素、ADP、胶原作诱导剂,使用APACT2型血小板聚集仪,检测冻干再水化和新鲜血小板的最大聚集率,以ADP为诱导剂,检测胞内外海藻糖对再水化冻干血小板最大聚集率的影响。结果表明当凝血酶、瑞斯托霉素、ADP、胶原浓度分别为1U/ml、1.6mg/ml、20μmol/L、2μg/ml时,新鲜血小板最大聚集率达100%左右,冻干再水化血小板最大聚集率分别达(70.17±7.36)%、(15.3±2.81)%、(68.67±6.86)%、(64.67±11.6)%。胞内外海藻糖组、胞外海藻糖组、空白对照组冻干再水化血小板最大聚集率分别达(66.0±4.69)%、(25.3±2.42)%、(11.5±1.87)%(P<0.01)。结论凝血酶、瑞斯托霉素、ADP、胶原浓度分别为1U/ml、1.6mg/ml、20μmol/L、2μg/ml可作为血小板聚集实验的合适浓度,胞内外海藻糖使冻干再水化血小板最大聚集率显著提高。     

冷冻干燥保存兔血小板的实验研究

目的研究冷冻干燥长期冻干保存的血小板制品的方法。方法将24只大白兔随机分为3个实验组:在所抽取的兔血小板中添加血小板可逆性激活抑制剂、DMSO和海藻糖等低温保护剂,经过预处理、冷冻、一级干燥、二级干燥等过程冷冻干燥兔血小板,分别室温保存1 d(实验1组)、7 d(实验2组)和15 d(实验3组)后经再水化;分别与各自冷冻干燥前的新鲜血小板为对照。并检测血小板回收率和聚集反应功能,并用851Cr示踪法评价血小板体内生存活性。结果3个实验组血小板冷冻干燥后回收率分别为71.68%,68.76%和70.64%,组间无明显差异。实验1、2、3组对凝血酶的最大聚集率(73.20%,77.53%和71.31%)与对照组(86.20%)差异无明显统计学意义(P>0.05),对ADP和没食子酸诱导的聚集反应率(35.6%和58.0%、36.61%和62.56%,32.65%和60.12%)比对照组低(72.4%和91.0%);冻干后保存兔血小板的1、24和48 h体内生存率分别为70%—79%、52%—56%和32%—40%,3组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论添加血小板可逆性激活抑制剂、海藻糖和DMSO后冷冻干燥获得的冻干兔血小板,具有较好的聚集活性和体内存活率,保存活性较为稳定。     

冻干血小板再水化后稳定性的实验研究

目的 探讨冻干血小板再水化后的稳定性变化。方法 使用血细胞计数仪测定冻干血小板再水化后细胞计数回收率，以及在室温条件下随放置时间的不同，胞内外海藻糖浓度变化的趋势。结果 冻干血小板再水化后，细胞计数回收率在8h内保持稳定。胞外海藻糖浓度为30mM和1％人血清白蛋白混合物，可使冻干血小板回收率显著提高（P〈0．01）。结论 负载海藻糖的冻干血小板再水化后8h内仍保持较好的稳定性，海藻糖可使冻干再水化血小板的稳定性显著提高。     

血小板冻干保存的稳定性研究

目的评价我们研究的血小板冻干技术所获得的冻干血小板的稳定性。方法我们用前期筛选出的,最优血小板预处理液配方技术所获得的冻干血小板,分别置于-20℃、4℃和室温下密封保存,选取0、10、30、90、180 d5个时间点,检测复水化后冻干血小板,以血小板回收率、MPV冻干前后差值、血小板相对聚集率,以及血小板激活后生长因子PDGF-BB、VEGF、TGF-β释放量做为评价指标。结果血小板冻干保存的稳定性研究结果显示:同一时间点,-20℃、4℃和室温3种保存温度之间,血小板回收率、相对聚集率、血小板激活后上清中VEGF和TGF-β含量,均无统计学差异(P0.05)。结论优选配方预处理后的冻干血小板在室温下保存,与置于4℃和-20℃保存效果相当,冻干血小板室温下可以稳定保存至少6个月。     

预冻技术参数对血小板冻干保存的影响

本研究采用正交设计方案探讨冻结速率、退火速率、退火温度和退火持续时间4个预冻条件参数对血小板冻干保存的影响。冻干血小板再水化后的数值恢复率、细胞形态和结构、血小板活化和聚集力等指标分别用血细胞计数计、扫描电子显微镜、3色流式细胞仪及对凝血酶的聚集反应进行检测并综合评价。结果显示:在不同的预冻条件组合方式下,冻干血小板的数值恢复率在(91.3%-53.5)%范围内;实验各组血小板冻干制品的冰晶大小和形状有所不同;冻干再水化血小板的活化标记物PAC-1和CD62p的表达和分布与新鲜血小板较为接近,其中PAC-1表达率均维持在较低水平(0.03%-0.22%),而各组样本CD62p的表达水平存在差异。实验中根据血小板数值恢复率得到预冻条件的最佳理论组合是A2B1C1D3,即将血小板悬液先以20℃/min的速率冻结至-40℃维持2小时,再以1.5℃/min对搁板升温至-30℃后维持0.5小时,最后进入冻干程序直至结束。结论:冻结速率、退火速率、退火温度和退火持续时间对冻干血小板的数值恢复率均有作用,预冻条件参数的不同组合方式影响血小板冻干保存效果。     

预冻技术参数对血小板冻干保存的影响

本研究采用正交设计方案探讨冻结速率、退火速率、退火温度和退火持续时间4个预冻条件参数对血小板冻干保存的影响．冻干血小板再水化后的数值恢复率、细胞形态和结构、血小板活化和聚集力等指标分别用血细胞计数计、扫描电子显微镜、3色流式细胞仪及对凝血酶的聚集反应进行检测并综合评价．结果显示：在不同的预冻条件组合方式下，冻干血小板的数值恢复率在（91．3％-53．5）％范围内；实验各组血小板冻干制品的冰晶大小和形状有所不同；冻干再水化血小板的活化标记物PAC-1和CD62p的表达和分布与新鲜血小板较为接近，其中PAC-1表达率均维持在较低水平（0．03％-0．22％），而各组样本CD62p的表达水平存在差异．实验中根据血小板数值恢复率得到预冻条件的最佳理论组合是A2B1C1D3，即将血小板悬液先以20℃／min的速率冻结至-40℃维持2小时。再以1．5℃／min对搁板升温至-30℃后维持0．5小时，最后进入冻干程序直至结束。结论：冻结速率、退火速率、退火温度和退火持续时间对冻千血小板的数值恢复率均有作用，预冻条件参数的不同组合方式影响血小板冻干保存效果．     

二甲亚砜对血小板冻存中功能保护作用的实验研究

本研究探讨二甲亚砜（DMSO）对血小板冻干保存中激活的抑制作用。以CD62p和PAC-1表达作为血小板的激活标志，CD62p和PAC-1再表达和血小板最大聚集率作为评价血小板功能的指标。对血小板经离心、洗涤及海藻糖负载等顸处理过程中加与不加DMSO的实验组，分别进行血小板膜表面糖蛋白CD62p和PAC-1表达及再表达的流式细胞术（FCMs）分析，血小板最大聚集率和血小板平均体积（MPV）的测定，研究DMSO对血小板激活抑制作用的可逆性。结果显示，血小板经预处理后，不含DMSO组的CD62p和PAC-1表达率显著增高，分别达30．37％和15．01％；含DMSO的组，CD62p表达率为10．72％，PAC．1几乎不表达（0．11％），显著低于不含DMSO组（P〈0．01）。DMSO稀释后，血小板CD62p再表达为54．39％，显著低于对照组（71．69％）和高于不含DMSO组（35．98％）（P均〈0．01）；PAC-1再表达率为49．28％，与对照组（54．48％）无显著差异，显著高于不含DMSO组（P〈0．叭）。在含DMSO组，血小板用原血浆稀释后，血小板聚集功能恢复，对restocetin，thrombin和propylgallate诱导的血小板聚集率分别为92．76％，91．24％和89．66％，与对照组和无DMSO组比无显著性差异，对ADP诱导的聚集率有34．33％，显著高于无DMSO组（P〈0．01），但仍显著低于对照组（P〈0．01）。结论：DMSO对体外处理所致的血小板膜表面CD62p和PAC-1表达具有抑制作用，且该抑制作用是可逆的，DMSO稀释后血小板仍具有CD62p和PAC．1表达能力和聚集反应功能，提示DMSO具有抑制激活损伤和低温保护的双重功能，这一生物学特性使DMSO在血小板的冻干保存中发挥重要作用。     

左旋精氨酸和西洛他唑对血小板体外激活的抑制作用

本实验旨在研究左旋精氨酸(L-arginine)和西洛他唑(cilostazol)在体外对血小板激活的抑制和功能保护作用,为可逆性血小板抑制剂在血小板保存中的应用提供依据。采用对血小板CD62p和PAC-1表达及凝血酶激活后再表达率的流式细胞分析(FCMs)、血小板聚集试验以及血小板凝血活性检测等手段,观察血小板激活、血小板功能状态。结果表明,体外处理后血小板CD62p和PAC-1表达率显著增加,西洛他唑和左旋精氨酸对这一过程CD62p和PAC-1表达有较强抑制作用,且随浓度增加而递增。西洛他唑可抑制凝血酶激活后CD62p和PAC-1的表达,左旋经氨酸仅抑制凝血酶激活后的PAC-1表达。左旋精氨酸和西洛他唑对3种诱导剂诱导的血小板聚集呈现不同程度的抑制作用,抑制作用随浓度递增。左旋精氨酸≥15mmol/L时,血小板聚集时间延长甚至不凝集。西洛他唑在浓度1-4mmol/L范围均延长血小板聚集时间。结论:5mmol/L和10mmol/L的左旋精氨酸均可抑制血小板体外处理过程的激活,且血小板的聚集和再表达功能不受影响,5mmol/L作用更佳。1mmol/L浓度西洛他唑抑制血小板体外激活,可保留血小板部分聚集活性和再表达能力。     

植酸钠和百维利肽体外抑制血小板活化的实验研究

目的探讨植酸钠和百维利肽在体外对血小板激活的抑制和功能保护的作用。方法测定血小板对诱导剂的聚集反应、血小板CD62p和PAC-1表达、凝血酶激活后血小板的CD62p和PAC-1再表达以及血小板聚集功能,研究在离心、洗涤和重悬等体外处理过程中,不同浓度的植酸钠和百维利肽对血小板的激活损伤、血小板功能保存和血小板促凝血活性的影响。结果经体外处理后的血小板CD62p和PAC-1表达显著增加;1mmol/L植酸钠可抑制PAC-1表达,但对血小板CD62p和PAC-1再表达无明显抑制作用,血小板对诱聚剂仍有聚集反应性;百维利肽浓度为1μmol/L时,对CD62p和PAC-1表达有较强的抑制作用,CD62p和PAC-1表达率仅为0.78%和0.24%,抑制血小板CD62p和PAC-1再表达,保留血小板除凝血酶之外诱导的聚集反应;植酸钠浓度≤2mmol/L可显著延长血小板发生聚集的时间,≥3mmol/L时,血小板不聚集;百维利肽浓度≤3μmol/L时,血小板聚集时间无明显延长。结论1mmol/L的植酸钠可抑制血小板GPⅡb/Ⅲa构象的改变,并保留血小板的部分凝集和再表达功能;1μmol/L的百维利肽可作用于凝血酶的激活途径,抑制血小板激活,且能部分保留血小板的再表达和聚集功能,适当减少其作用浓度会对血小板有更好的功能保护效果。     

糖基化修饰后人血小板形态、超微结构及功能的研究

经糖基化修饰可使4℃保存的血小板在输入体内后延长其存活。本研究探讨尿苷二磷酸半乳糖（UDP—Gal）糖基化修饰对血小板形态、结构、功能以及其膜糖蛋白的影响。实验分为室温对照组、冷藏对照组和修饰组。用荧光标记的特异凝集素（FITC—RCA I）检测膜糖蛋白糖残基变化，用扫描、透射电镜观察修饰后血小板形态和超微结构的变化，用比浊法测定血小板聚集率，用流式细胞术检测血小板膜蛋白CD42b、膜表面标志CD62P以及血小板凋亡标志annexinV结合率。结果表明，UDP—Gal修饰组RCAI结合率显著高于室温对照组和冷藏对照组（P〈0．01）；与新鲜血小板相比，UDP—Gal处理后的血小板超微结构无明显变化，而冷藏对照组则有伪足延伸等形态学改变；修饰后最大聚集率可达新鲜血小板的50％以上；血小板膜蛋白CD42b、膜表面标志C1362P及annexinV结合率与室温对照组相比均无明显差异。结论：UDP—Gal可使β-半乳糖有效地结合于链聚糖末端，糖基化血小板仍然具有较强的聚集活性和相对完整的超微结构，功能基本正常。     

丁胺卡那霉素对EDTA依赖性凝集血小板的解离及其机制

目的研究丁胺卡那霉素对EDTA抗凝剂依赖的聚集血小板的解离作用和机制,为血常规标本中血小板凝聚提供可靠的解决方法。方法在EDTA依赖的假性血小板减少症(PTCP)患者的EDTA-K2抗凝血样本中,于不同时间段加入不同浓度丁胺卡那霉素进行凝集血小板的解离试验,通过血小板计数和涂片观察解离效果;用流式细胞仪检测血小板膜表面CD41、CD61、CD62p、PAC-1和IgG的表达百分率。结果抽血后1h内加入丁胺卡那霉素对血小板凝集的解离作用明显,血小板计数可恢复到即时检测的水平,血小板CD62p、PAC-1和IgG的表达量被显著抑制,而CD41和CD61未受明显影响。结论PTCP患者血常规样品抽血后1h内加入丁胺卡那霉素能有效解离凝集的血小板,作用机制可能与抑制患者血小板膜表面CD62p、PAC-1和IgG的表达有关;此法有助于解决EDTA所致的血小板计数的假性减少。     

冻干保存血小板可逆性抑制激活的实验研究

目的探索最优的血小板激活抑制剂组成方案,以建立一套完善的血小板冻干前处理程序。方法选择已基本确定有效作用浓度的6种血小板激活抑制剂如前列腺素E1、腺苷、左旋精氨酸、植酸钠、百维利肽和西洛他唑,结合血小板冷冻干燥保护剂的负载过程,以CD62p、PAC-1、MPV和P lt作为血小板活化指标,CD62p和PAC-1的再表达率作为血小板反应性指标,诱导剂诱导的血小板最大聚集率和SPAT作为血小板聚集和促凝血功能的指标;采用正交实验设计,分8个实验组,研究分析各因素在负载中对血小板状态和功能的影响,选择最优的负载液组成。结果A因素(负载环境)水平Ⅰ在抑制血小板MPV增大、D62p和PAC-1的表达以及再表达率保留、血小板最大聚集率和SPAT影响均优于水平Ⅱ(P均<0.05);B因素(PGE1)C因素(左旋精氨酸)F因素(植酸钠)G因素(百维利肽)的水平Ⅱ则均由于各自的水平Ⅰ。因此,在8个实验条件中,以第3实验组(A1B2C2D1E1F2G2)对血小板功能保护的最好。结论在血小板冻干前保护剂负载过程程序,在血浆负载环境中添加1μmol/L前列腺素E1,5 mmol/L左旋精氨酸,0.5 mmol/L植酸钠和0.5μmol/L百维利肽,可有效抑制血小板激活,使保存的血小板具有表达CD62p和PAC-1活性、聚集反应和促凝血活性。