脑损伤并胫骨骨折大鼠骨痂中神经肽的分布及意义

目的:研究证明,含有P物质、降钙素基因相关肽、血管活性肠肽、神经肽Y和酪氨酸羟化酶等神经肽的肽能神经共同存在于骨组织中,主要分布于骨代谢活跃的区域,表明这些肽能神经与骨的生长、发育密切相关.观察脑损伤后大鼠胫骨骨痂中神经肽的表达.方法:实验于2007-02/05在广西医科大学实验动物中心完成.①实验分组:雄性Wistar大鼠130只,体质量450～550 g,随机数字表法分为单纯骨折组(n =60),脑损伤合并骨折组(n =60),正常对照组(n =10).②实验方法:麻醉后显露大鼠右颅顶骨,中线旁2 mm 处开直径5 mm 骨窗,液压打击致中度脑损伤,并制备大鼠胫骨骨折模型,其中单纯骨折组头部只做颅骨开窗,正常对照组不做任何处理.③实验评估:术后3,7,14,21,28,35 d 苏木精-伊红染色和神经肽免疫组织化学染色观察神经肽在大鼠胫骨中的分布及胫骨骨折骨痂的连续性及骨折愈合情况.计算机X射线摄像仪(CR)摄片测定术后14,21,28 d 脑损伤合并骨折组及单纯骨折组骨痂面积大小.结果:纳入大鼠130只,均进入结果分析.①脑损伤合并骨折组早期形成大量纤维骨痂和软骨骨痂,骨痂中神经肽免疫阳性神经纤维较多,明显增厚的骨膜内层骨祖细胞、幼稚的软骨细胞胞质内降钙素基因相关肽、P物质、血管活性肠肽、酪氨酸羟化酶、神经肽Y强阳性表达.②脑损伤合并骨折组14 d 纤维骨痂中的软骨细胞团增大,骨膜下软骨细胞层增厚;21 d 小梁骨明显增厚,软骨岛增大;28 d 仍可见大量的纤维骨痂和软骨骨痂,软骨细胞团周边有少量结构稀疏的编织骨形成.单纯骨折组骨膜反应轻,纤维骨痂量少,骨内成骨和软骨内成骨并存,以前者为主,骨折愈合过程明显晚于脑损伤合并骨折组.③14,21 d 脑损伤合并骨折组骨痂面积较单纯骨折组大(P＜0.01);21,28 d 脑损伤合并骨折组骨痂面积变化明显快于单纯骨折组,提示骨痂塑性快(P＜0.01).CR摄片发现,各骨折组大鼠骨折端均未发现不愈合现象,单纯骨折组骨折线清晰,骨痂量较少;脑损伤合并骨折组骨性愈合较好,骨痂量较多,骨折线模糊.结论:正常大鼠骨生长活跃区有丰富的肽能神经支配.脑损伤后骨痂中神经肽有显著改变,并引起骨痂量和质的改变,骨折愈合加速.     

合并脑损伤时骨折愈合过程中血管内皮细胞生长因子的表达

背景:大量临床病例显示,骨折合并脑损伤患者骨痂量明显增多,骨折愈合速度明显加快.但对合并脑损伤时骨折愈合过程中血管内皮细胞生长因子的表达及作用机制缺乏前瞻性对照研究,对其潜在的机制尚未阐明.目的:对比观察SD大鼠在骨折合并脑损伤以及单纯骨折时骨折愈合过程中骨痂内血管内皮细胞生长因子的表达变化.方法:将SD大鼠以数字表法随机分为3组:正常对照组、单纯骨折组、骨折合并脑损伤组.脑损伤模型采用改进的Marmarou自由落体装置撞击大鼠颅骨制作弥漫性中度脑损伤模型;于左侧胫骨髁间处钻孔,插入无菌克氏钢针,在胫骨中上1/3处横向折断胫骨,制作骨折模型.术后X射线摄片观察骨折修复过程和效果;RT-PCR检及免疫组化染色观察骨痂标本血管内皮细胞生长因子表达.结果与结论:骨折后3,7,14d,单纯骨折组、骨折合并脑损伤组X射线表现无明显差别.与单纯骨折组相比,骨折后24d脑损伤合并骨折组骨折线变得模糊,形成较多骨痂量;42d后骨折线消失,伤肢基本愈合.单纯骨折组骨痂中血管内皮细胞生长因子骨折后7d开始出现,表达逐渐增强,约3周时达高峰,42d已经不见血管内皮细胞生长因子表达;脑损伤合并骨折后3d即可见血管内皮细胞生长因子表达,两三周达高峰期,其表达高峰提前且持续时间较长.说明脑损伤后大鼠骨折愈合加速,骨痂量增多,表明脑损伤对骨折愈合有促进作用,这可能与脑损伤后大鼠体内生长因子血管内皮细胞生长因子表达高峰提前且持续时间较长有关.     

神经生长因子对大鼠胫骨骨折愈合的影响

背景：临床中发现失神经可导致骨折断端骨痂过度生长甚至在肌肉中出现异位骨化，这一现象提示神经因素对骨折愈合有影响。目的：探讨神经生长因子对大鼠胫骨骨折愈合的影响。设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005—06／2006—03在解放军第二军大学动物实验中心完成。材料：健康雄性3个月龄SD大鼠120只，体质量250—300g，随机分为单纯左胫骨骨折组和神经生长因子治疗组，每组60只。注射用神经生长因子由厦门北大之路生物工程有限公司提供。方法：两组人鼠制备单纯胫骨骨折，神经生长因子治疗组肌注2000AU（1．4g），1次／d，分别注射两侧腓肠肌，连续肌注2周。伤后第4周对2组大鼠骨折断端行断层CT，测量骨折断端最大横截面及计算骨痂灰度值，行生物力学3点折弯试验。主要观察指标：①骨组织形态计量学、骨密度测定。②骨痂组织形态学的观察。③免疫组化法测定骨痂组织骨钙素的表达。④观察2组大鼠骨痂中成骨细胞的超微结构变化。@Western印迹检测Ⅰ、Ⅱ型胶原的表达。结果：神经生长因子治疗组3点折弯试验各项生物力学参数均优于单纯左胫骨骨折组（P〈0．05）。形态学及超微结构观察见神经生长因子治疗组骨折愈合优于单纯左胫骨骨折组。神经生长因子治疗组Ⅰ型胶原蛋白表达明显高于单纯左胫骨骨折组（P〈0．05）；而单纯左胫骨骨折组骨痂Ⅱ型胶原蛋白的表达明显高于神经生长因子治疗组（P〈0．05）。结论：生物力学测试及Ⅰ型胶原蛋白表达和成骨细胞微观结构均说明神经生长因子对骨折断端的骨化有促进作用，其途径有可能在骨痂生长的不同时期通过调节Ⅰ、Ⅱ型胶原的量来调控骨折的愈合。     

大鼠胫骨骨折愈合过程中Ⅰ,Ⅱ型胶原蛋白的表达:失神经状态下Western blot方法测定

背景：近年来大量的实验及临床观察均证实神经因素对骨折愈合有调节和支配作用。Ⅰ型胶原是促成骨细胞分化和增强成骨细胞黏附能力主要因素，是组成骨构架的基质蛋白；而Ⅱ型胶原由软骨细胞产生。目的：观察失神经状态下骨折愈合过程中Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白表达的变化规律。设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005—05／12在解放军第二军医大学动物实验室及细胞生物教研究室完成。材料：选用3月龄健康雄性SD大鼠40只，采用随机数字表法分为2组，单纯胫骨骨折组与脊髓损伤并胫骨骨折组各20只。方法：单纯胫骨骨折组大鼠于从左胫骨平台前缘插入1根中Φ8min克氏针，制成胫骨骨折模型。脊髓损伤并胫骨骨折组在植备上述模型的基础上，横断切除T30段脊髓约0．3cm，制成T10脊髓完全性损伤大鼠胫骨骨折模型。主要观察指标：分别于伤后1，2，4，5周采用Western blot法检测两组大鼠骨折断端骨痂中Ⅰ、Ⅱ型胶原的蛋白表达。结果：伤后第1周两组大鼠骨折断端骨痂中Ⅰ、Ⅱ型胶原均有表达，脊髓损伤并胫骨骨折组两种胶原的表达程度均高于单纯胫骨骨折组（P〈0．05）：伤后第2周脊髓损伤并胫骨骨折组Ⅱ型胶原的表达量达到峰值，高于单纯胫骨骨折组（P〈0．05）；伤后第4周单纯胫骨骨折组Ⅰ型胶原表达量达峰值，高于脊髓损伤并胫骨骨折组（P〈0．05），脊髓损伤并胫骨骨折组Ⅱ型胶原仍有高表达：伤后第5周两组Ⅰ、Ⅱ型胶原表达量均下降。结论：失神经状态下骨折愈合过程中Ⅰ、Ⅱ胶原的分泌规律与正常骨折愈合一致，区别在于各时间点尤其是在峰值点上表达量有明显差异。     

大鼠胫骨骨折愈合过程中Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白的表达：失神经状态下Westernblot方法测定

背景：近年来大量的实验及临床观察均证实神经因素对骨折愈合有调节和支配作用。Ⅰ型胶原是促成骨细胞分化和增强成骨细胞黏附能力主要因素，是组成骨构架的基质蛋白；而Ⅱ型胶原由软骨细胞产生。目的：观察失神经状态下骨折愈合过程中Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白表达的变化规律。设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005—05／12在解放军第二军医大学动物实验室及细胞生物教研究室完成。材料：选用3月龄健康雄性SD大鼠40只，采用随机数字表法分为2组，单纯胫骨骨折组与脊髓损伤并胫骨骨折组各20只。方法：单纯胫骨骨折组大鼠于从左胫骨平台前缘插入1根中Φ8min克氏针，制成胫骨骨折模型。脊髓损伤并胫骨骨折组在植备上述模型的基础上，横断切除T30段脊髓约0．3cm，制成T10脊髓完全性损伤大鼠胫骨骨折模型。主要观察指标：分别于伤后1，2，4，5周采用Western blot法检测两组大鼠骨折断端骨痂中Ⅰ、Ⅱ型胶原的蛋白表达。结果：伤后第1周两组大鼠骨折断端骨痂中Ⅰ、Ⅱ型胶原均有表达，脊髓损伤并胫骨骨折组两种胶原的表达程度均高于单纯胫骨骨折组（P〈0．05）：伤后第2周脊髓损伤并胫骨骨折组Ⅱ型胶原的表达量达到峰值，高于单纯胫骨骨折组（P〈0．05）；伤后第4周单纯胫骨骨折组Ⅰ型胶原表达量达峰值，高于脊髓损伤并胫骨骨折组（P〈0．05），脊髓损伤并胫骨骨折组Ⅱ型胶原仍有高表达：伤后第5周两组Ⅰ、Ⅱ型胶原表达量均下降。结论：失神经状态下骨折愈合过程中Ⅰ、Ⅱ胶原的分泌规律与正常骨折愈合一致，区别在于各时间点尤其是在峰值点上表达量有明显差异。     

合并中枢神经损伤骨折愈合过程中胰岛素样生长因子Ⅰ的作用

背景：胰岛素样生长因子Ⅰ由成骨细胞合成,并对成骨细胞具有促进增殖和分化作用。目的：观察中枢神经损伤对胰岛素样生长因子Ⅰ在血清、局部骨痂的表达及骨折愈合的影响。方法：取Wistar大鼠随机分成正常对照组、脑损伤-骨折组、脊髓损伤-骨折组、单纯骨折组。于术后第1,2,3周测量血清中胰岛素样生长因子Ⅰ水平;术后第2,3周行X射线摄片评估骨痂愈合情况,术后1,2,3,4周取股骨制作标本,测量骨痂体积,术后3d,1,2周免疫组织化学染色法检测骨痂局部胰岛素样生长因子Ⅰ的表达。结果与结论：正常对照组、单纯骨折组的胰岛素样生长因子Ⅰ血清质量浓度无明显变化,脑损伤-骨折组和脊髓损伤-骨折组骨痂体积、X射线评分高于单纯骨折组（P〈0.05）;伤后3d,1,2周时,脑损伤-骨折组和脊髓损伤-骨折组胰岛素样生长因子Ⅰ的血清质量浓度较其他两组明显增加（P〈0.01）;伤后1周,脑损伤-骨折组和脊髓损伤-骨折组骨折端平均阳性细胞数高于单纯骨折组（P〈0.01）。提示中枢神经损伤可以影响血清中胰岛素样生长因子Ⅰ的质量浓度和骨痂局部的表达,从而能促进骨折愈合。     

活血化瘀汤对骨折愈合过程中诱导型一氧化氮合酶基因表达的影响

目的：观察活血化瘀汤对骨折愈合中诱导型一氧化氮合酶mRNA表达的影响，从而调控成骨作用。方法：实验于2002-12／2004-08在华中科技大学基础学院分子生物学实验室完成。将24只SD大鼠胫骨中段闭合骨折骨髓内克氏针固定制成骨折模型，随机分为活血化瘀汤组(n=12)及生理盐水组(n=12)；于骨折后4，7，14，21d收集骨痂样本，反转录聚合酶链反应测定诱导型一氧化氮合酶的mRNA表达水平。结果：24只大鼠均进入结果分析。骨折后7，14，21d所有骨痂样本诱导型一氧化氮合酶的mRNA表达增强，骨折后14d达到峰值，活血化瘀汤组与生理盐水组比较，骨折后7，14d骨痂诱导型一氧化氮合酶基因表达显性增强(P=0．0037)。结论：活血化瘀汤可能通过增加早期大鼠骨痂诱导型一氧化氮合酶源性一氧化氮，影响骨细胞增殖功能，从而促进骨折愈合。     

尼古丁对大鼠骨折愈合和骨痂血管内皮生长因子表达的影响

目的探讨尼古丁对大鼠骨折愈合和骨痂血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法将120只SD大鼠随机分为3组,低尼古丁组（n=40）、高尼古丁组（n=40）和对照组（n=40）。建立骨折愈合模型,于建模后第3、7、14、21天分别处死10只大鼠,采集桡骨骨折部位骨痂组织,采用苏木素-伊红（HE）染色进行显微镜下观察、测量骨痂厚度和成熟度,采用免疫组织化学染色检测骨痂中VEGF表达水平。结果建模后第3天,低尼古丁组、高尼古丁组大鼠骨痂厚度、成熟度及VEGF表达水平与对照组的差异无统计学意义（P〉0.05）。建模后第7、14、21天,低尼古丁组、高尼古丁组大鼠的VEGF表达水平高于对照组,但骨痂厚度和成熟度低于对照组（P〈0.05）;低尼古丁组大鼠VEGF表达水平高于高尼古丁组（P〈0.05）。结论尼古丁减少骨痂形成,延缓骨折愈合过程,促进VEGF表达,且不同尼古丁剂量对VEGF表达的影响不同。     

脑损伤并股骨骨折愈合患者骨痂中骨形态发生蛋白2和胰岛素样生长因子1的表达

背景:临床观察及基础研究发现,合并颅脑损伤可加速骨折愈合,但具体机制尚不明确.目的:观察脑损伤后SD大鼠股骨骨折愈合过程中骨痂骨形态发生蛋白2和胰岛素样生长因子1的表达,探讨脑损伤对大鼠股骨骨折愈合的影响及其作用机制.设计、时间及地点:随机对照,基因水平动物实验,于2007-05/2008-03在华北煤炭医学院骨科实验室完成.材料:SPF级10周龄雄性SD大鼠48只.方法:48只SD大鼠随机分成2组,每组24只.参考文献建立大鼠单纯股骨骨折模型和脑损伤合并股骨骨折模型.于术后7,14,28 d分批处死动物,行X射线摄片后,取股骨骨痂,分别用于提取总RNA进行实时荧光定量聚合酶链反应.主要观察指标:以X射线摄片观察骨折愈合情况;以苏木精-伊红染色、免疫组织化学染色观察骨痂组织骨形态发生蛋白2和胰岛素样生长因子1的表达.结果:X射线摄片示,与单纯骨折组相比,骨折合并脑损伤组骨痂出现早,同一时间骨痂更大.免疫组织化学显示,造模7,14 d脑损伤合并股骨骨折组骨形态发生蛋白2、胰岛素样生长因子1的平均阳性细胞百分率高于单纯骨折组.实时荧光定量聚合酶链反应结果发现,脑损伤合并股骨骨折组7,14 d骨形态发生蛋白2基因mRNA表达高于单纯骨折组,7,14,21 d胰岛素样生长因子1基因mRNA表达高于单纯骨折组.结论:与单纯骨折组相比,骨折合并脑损伤组大鼠骨折愈合加速,骨痂中骨形态发生蛋白2和胰岛素样生长因子1的表达显著性升高,提示脑损伤促进了骨折愈合的机制可能与此有关.     

骨折愈合过程中降钙素基因相关肽表达与脑损伤的影响

背景:临床观察及实验研究发现合并中枢神经损伤的骨折愈合加速,但其具体机制尚未明确.目的:观察股骨骨折合并脑损伤大鼠骨痂中降钙素基因相关肽及其mRNA的表达变化,探讨脑损伤对骨折愈合的影响及作用机制.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-01/10在华北煤炭医学院骨科实验室完成.材料:健康12周龄雌性SD大鼠64只,建立大鼠开放骨折模型.方法:骨折造模后64只SD大鼠随机数字法分为骨折合并脑损伤组和单纯骨折组,每组32只,骨折合并脑损伤组接着制备脑损伤模型.造模后7,14,21,28 d分批麻醉并处死动物,苏木精-伊红染色观察骨折愈合情况,免疫组织化学染色及原位杂交检测降钙素基因相关肽及其mRNA的表达变化.主要观察指标:①造模后28 d大鼠右侧股骨X射线平片表现.②造模后不同时间点两组大鼠骨痂苏木精一伊红染色、免疫组织化学染色及原位杂交结果.结果:64只SD大鼠均进入结果分析.①X射线平片显示与单纯骨折组相比,骨折合并脑损伤组骨折端骨痂形成早,骨痂量多.②苏木精一伊红染色示单纯骨折组呈典型骨折愈合过程,而骨折合并脑损伤组骨痂形成及改造提前,骨折愈合加速.免疫组织化学染色显示骨折愈合过程中内皮细胞、骨祖细胞、软骨细胞及成骨细胞表达降钙素基因相关肽.骨折合并脑损伤组造模后各时间点阳性细胞数均高于单纯骨折组,差异有显著性意义(P<0.05).原位杂交检测示骨折合并脑损伤组造模后7,14,21 d表达降钙素基因相关肽mRNA的成骨细胞数均高于单纯骨折组,差异有显著性意义(P<0.05).结论:脑损伤对骨折愈合有促进作用,可能与合并脑损伤后降钙素基因相关肽及其mRNA表达水平升高有关.