造血与淋巴组织肿瘤患者红细胞的天然免疫黏附功能及对NK细胞杀伤活性的影响

本研究探讨造血与淋巴组织肿瘤患者红细胞天然免疫黏附功能及红细胞对NK细胞杀伤活性的影响。外周血枸橼酸钠抗凝,检测红细胞在自身血浆条件下对K562细胞的免疫黏附并计算黏附率。用MTT法测定红细胞对正常NK细胞杀伤K562细胞活性的影响,并与未加红细胞时进行比较。结果表明:红细胞对K562细胞形成了"玫瑰花"样结合。正常人红细胞对K562细胞的免疫黏附结合率为(15.3±6.4)%,造血与淋巴组织肿瘤患者红细胞对K562细胞的免疫黏附结合率为(7.6±7.0)%,与正常人相比较显著下降(t=3.61,p(0.001)。不加红细胞条件下,正常人外周静脉血NK细胞杀伤K562细胞活性为67%-71%。正常人红细胞明显增加NK细胞杀伤K562细胞活性杀伤率为(14.7±5.2)%,造血与淋巴组织肿瘤患者的红细胞减低NK细胞杀伤K562细胞活性,杀伤率为(4.3±7.6)%,二者比较有显著差异(t=6.73,p(0.0001)。结论:造血与淋巴组织肿瘤患者红细胞对K562细胞的免疫黏附能力下降,正常人红细胞明显增加NK细胞杀伤K562细胞活性,而造血与淋巴组织肿瘤患者的红细胞减低NK细胞杀伤K562细胞活性,原因需进一步研究。     

IL-2和IL-15刺激脐血NK细胞对K562/Jurkat细胞的杀伤活性研究

本研究旨在探讨脐血(cord blood,CB)NK细胞的杀伤功能及细胞因子IL-2和IL-15对NK细胞杀伤K562/Jurkat细胞活性的影响。采用autoMACS及CD3阴选后CD56阳选两步免疫磁珠分选法从脐血单个核细胞纯化NK细胞,分选后NK细胞用流式细胞仪测定纯度,通过IL-2及IL-2和IL-15两种细胞因子组合培养3天,用LDH释放法检测培养前后脐血NK细胞对白血病细胞株K562和Jurkat的细胞毒活性(效靶比10∶1),并记录不同细胞因子培养体系条件下NK细胞的生长状况。结果表明,CB-MNC中CD3-CD56+细胞含量为(14.88±9.2)%,分选后CD3-CD56+细胞含量为(92.39±0.8)%;培养3天后,IL-2组NK细胞形成集落数为148.60±13.0,IL-2复合IL-15组NK细胞形成集落数为831.80±23.0,两者比较,有显著性差异;以K562为靶细胞时,新鲜纯化CB-NK的杀伤活性为(27.76±8.8)%,IL-2组杀伤活性为(61.9±9.1)%,IL-2复合IL-15组杀伤活性为(87.62±3.7)%,差别有统计学意义;以Jurkat为靶细胞时,新鲜纯化CB-NK细胞的杀伤活性为(29.32±2.5)%,IL-2组杀伤活性为(69.43±4.4)%,IL-2复合IL-15组杀伤活性为(92.95±3.2)%,差别有统计学意义。结论:脐血新鲜纯化NK细胞对K562、Jurkat细胞有一定的杀伤作用,但自发细胞毒活性较低,IL-2/IL-15刺激后杀伤活性显著提高,IL-15复合IL-2对促进脐血NK细胞的生长和提高其细胞毒活性明显优于单用IL-2。     

自然杀伤细胞在血液肿瘤免疫治疗中的应用及研究进展

自然杀伤(NK)细胞为机体固有免疫系统效应细胞,无需抗原预先致敏即可识别并杀伤肿瘤等异常细胞,参与免疫监视功能,移植物排斥反应与自身免疫疾病的发生.NK细胞对血液肿瘤细胞的杀伤活性主要取决于其细胞表面活化性受体与抑制性受体分别识别血液肿瘤细胞相应配体后产生的信号强度的综合.随着对NK细胞对肿瘤细胞杀伤作用机制的深入研究,以NK细胞为基础的血液肿瘤过继免疫治疗备受关注.     

NK细胞对骨髓瘤RPMI 8226细胞的体外杀伤活性

目的:探讨NK细胞对骨髓瘤RPMI 8226细胞的体外杀伤活性.方法:分离纯化NK细胞,LDH法检测不同效靶比时NK细胞对RPMI 8226细胞的杀伤活性,并以K562细胞为对照.同时用甲基纤维素克隆形成试验观察效靶比为20:1时细胞克隆形成率.结果:NK细胞对K562、RPMI 8226细胞的杀伤活性随着效靶比升高而增强,在同一效靶比,NK细胞对K562、RPM1 8226细胞的杀伤活性组间比较差异均有统计学意义.NK细胞对K562细胞克隆形成抑制率为(63.48±6.78)%,对RPMI 8226细胞克隆形成抑制率为(23.71±2.39)%,差异有显著统计学意义.结论:NK细胞可杀伤骨髓瘤RPMI 8226细胞,但为低度敏感.     

熊果酸诱导结肠癌HT-29细胞凋亡与凋亡相关基因的关系

目的：体外实验探讨熊果酸诱导结肠癌HT-29细胞凋亡的可能性，揭示该凋亡发生与其相关基因之间的关系。方法：采用四甲基偶氮唑蓝比色、TUNEL法、流式细胞术检测熊果酸对结肠癌HT-29细胞的增殖抑制与杀伤作用；应用免疫组织化学SP法检测凋亡相关基因caspase-9、bcl-2、bax的表达。结果：熊果酸在体外对HT-29细胞有中度增殖抑制效应，在熊果酸作用下，HT-29细胞出现显著的细胞凋亡征象，TUNEL法显示细胞固缩，核染色质聚集或断裂，形成凋亡小体。流式细胞术检测在G1期之前出现sub-G1峰，凋亡率最高为11．63％，熊果酸的作用具有浓度和时间依赖性。在HT-29细胞凋亡过程中，凋亡相关基因caspase-9、bax的表达增强，bcl-2的表达减弱。结论：熊果酸在体外对结肠癌HT-29细胞有诱导凋亡作用，而caspase-9和bax的表达增强，bcl-2的表达减弱可能是其作用机制之一。     

流式细胞术检测NK细胞活性在获得性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症诊断中的应用

本研究目的旨在建立一种准确、稳定的NK细胞杀伤活性检测方法,应用于获得性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症诊断。21例疑似患者及20例健康对照者纳入本研究。根据HLH-2004标准将疑似患者分为确诊组和排除组,将pEGFP—N1质粒转染人NK细胞的天然靶细胞K562,经过G418筛选后进一步单克隆,得到稳定、均一表达绿色荧光蛋白的EGFP—K562细胞,将EGFP—K562细胞与人外周血单个核细胞按10：1的比例混合孵育2小时后,用碘化丙啶（PI）标记,用流式细胞仪分析呈红、绿色荧光的细胞数,最后计算NK细胞的杀伤效率;同时采用LDH释放法测定外周血NK细胞对单纯K562细胞的杀伤活性,并进行比较。结果表明：获得了稳定表达绿色荧光蛋白的EGFP—K562细胞;流式细胞仪检测表明健康人NK细胞杀伤率与病人组之间存在明显差异,流式细胞仪技术检测NK细胞杀伤活性与传统LDH释放法检测NK细胞杀伤活性具有显著相关性。结论：EGFP—K562细胞株作为靶细胞用于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性,无需预先染色和标记靶细胞,操作简便、省时、稳定、重复性高,可应广泛应用于获得性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症诊断。     

西达本胺对NK细胞体外杀伤K562细胞活性的影响及其相关机制

目的:观察西达本胺对自然杀伤细胞(NK)体外杀伤K562细胞活性的影响并探讨其作用机制。方法:用不同浓度的西达本胺预处理K562细胞,与NK细胞不同效靶比共同孵育,采用流式细胞术检测西达本胺作用于K562细胞后NK细胞对其杀伤作用、K562细胞表面NKG2D相关配体表达量及K562细胞凋亡率的变化。结果:西达本胺可增加K562细胞对NK细胞杀伤的敏感性,同时可上调K562细胞表面ULBP2表达,对ULBP1、MICA/MICB表达无明显影响,西达本胺于K562细胞本身无明显细胞毒性作用。结论:西达本胺可能通过增加ULBP2的表达提高K562细胞对NK细胞杀伤敏感性。     

IL-1β反义RNA在肝癌细胞中对NK细胞固有免疫杀伤的影响

目的：探讨将所获IL-1β反义RNA真核表达载体导入HepG2细胞后．肝癌细胞对NK细胞杀伤敏感性的变化。方法：转染后用RT—PCR法检测反义基因片段的表达，MTT比色法分析NK一92细胞杀伤活性的变化。结果：转染后反义RNA均得到高水平表达，并使NK细胞的杀伤活性提高约15％。结论：IL-1β反义RNA可在一定程度上恢复肝癌细胞对NK细胞的杀伤敏感性。     

NK细胞对造血细胞的杀伤作用

自然杀伤细胞(NK细胞)对各种靶细胞起自发细胞毒作用。它不具有经典的巨噬细胞、粒细胞或细胞毒性T细胞的特性;其细胞毒作用无MHC限制性。NK细胞不仅对自体、同种及异种肿瘤细胞有细胞毒活性,而且对胚胎成纤维细胞、巨噬细胞、骨髓和胸腺的某些细胞亚群,对疱疹病毒、流感病毒及支原体感染细胞也有杀伤作用。本文就NK细胞对骨髓细胞(BMC)的杀伤作用作一总结。     

Ⅱ型胶原对关节炎大鼠免疫功能的影响

目的体外实验研究Ⅱ型胶原（CⅡ）对关节炎大鼠和正常大鼠免疫功能的影响,探讨CⅡ的免疫调节作用。方法建立大鼠胶原型关节炎模型,体外实验研究CⅡ对关节炎大鼠和正常大鼠淋巴细胞增殖反应、自然杀伤细胞（NK细胞）杀伤活性以及淋巴细胞亚群的影响。结果CⅡ在体外实验中表现为低浓度促进而高浓度抑制大鼠淋巴细胞增殖的作用,对NK细胞杀伤活性、淋巴细胞亚群无影响。结论CⅡ对关节炎大鼠有一定的免疫调节作用。     

Genetic Control Of Natural Killing and In Vivo Tumor Elimination by the Chok Locus

The molecular mechanisms underlying target recognition during natural killing are not well understood. One approach to dissect the complexities of natural killer (NK) cell recognition is through exploitation of genetic differences among inbred mouse strains. In this study, we determined that interleukin 2–activated BALB/c-derived NK cells could not lyse Chinese hamster ovary (CHO) cells as efficiently as C57BL/6-derived NK cells, despite equivalent capacity to kill other targets. This strain-determined difference was also exhibited by freshly isolated NK cells, and was determined to be independent of host major histocompatibility haplotype. Furthermore, CHO killing did not correlate with expression of NK1.1 or 2B4 activation molecules. Genetic mapping studies revealed linkage between the locus influencing CHO killing, termed Chok, and loci encoded within the NK gene complex (NKC), suggesting that Chok encodes an NK cell receptor specific for CHO cells. In vivo assays recapitulated the in vitro data, and both studies determined that Chok regulates an NK perforin–dependent cytotoxic process. These results may have implications for the role of NK cells in xenograft rejection. Our genetic analysis suggests Chok is a single locus that affects NK cell–mediated cytotoxicity similar to other NKC loci that also regulate the complex activity of NK cells.     

Characterization of peripheral natural killer cells in primary Sjögren's syndrome: impaired NK cell activity and low NK cell number

The aim of this study was to compare the number of peripheral blood natural killer (NK) cells, NK cell activity, expression of NK cell activating receptors, and serum cytokine levels in patients with primary Sj?gren's syndrome (SS) vs normal controls. The authors found that NK cell number, NK cell killing activity, and the expression of activating receptors CD2 and NKG2D were significantly decreased, and the expression of NKp46, as well as the percentage of apoptotic NK cells, were significantly increased in primary SS patients compared with healthy controls. NK cell killing activity on a per-cell basis was similar in primary SS patients and healthy controls. Moreover, the levels of IL-18 and TNF-alpha, cytokines that have been shown to promote NK cell death, were significantly increased in sera from patients with primary SS compared with controls. These data suggest that reduced NK cell numbers, probably a result of apoptotic death, may contribute to impaired NK cell activity in patients with primary SS.     

β1整合素表达下调对人结肠癌细胞增殖和化疗敏感性影响

目的 观察β1整合素表达下调对人结肠癌HT-29细胞增殖和化疗敏感性的影响.方法 采用反义寡核苷酸（ASODN）技术转染HT-29细胞,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测β1整合素表达下调情况.MTT法检测HT-29细胞相对存活率.给予梯度浓度氟尿嘧啶（5-FU）,计算IC50.结果 实验组β1整合素条带吸光度积分（IAD）值/β-actin条带IAD值的比值及HT-29细胞的存活率与对照组相比显著降低（F=1 630.08,q=72.40,P〈0.01;t=4.37,P〈0.05）.5-FU＋ASODN组HT-29细胞对5-FU的IC50与5-FU组比较显著下降（t′=37.71,P〈0.05）.结论 β1整合素表达下调可抑制结肠癌细胞增殖,增强结肠癌细胞对化疗药物敏感性.     

非选择性环氧化酶抑制剂诱导结肠癌细胞凋亡的研究

目的：研究非选择性环氧化酶抑制剂舒林酸对结肠癌细胞株HT-29生长的影响及其参与引起细胞凋亡的可能机制。方法：采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测舒林酸对结肠癌细胞增殖的抑制作用,采用激光共聚焦显微镜（LSM）观察细胞凋亡情况,采用流式细胞仪（FCM）分析其对细胞凋亡及细胞周期的影响。结果：舒林酸能呈剂量和浓度依赖性押制HT-29的增殖．在4．8mmol·L^-1时其抑制率可迭91．8％。AnnexinV／H染色后LSM观察到凋亡细胞胞膜绿染,胞核红染或呈桔黄色。FCM显示此药能促进细胞的凋亡,使处于G0／G1期的细胞比例显著降低。结论：舒林酸可抑制结肠癌细胞株HT-29生长,其机制可能与其阻止细胞周期的进展,诱导细胞凋亡有关。     

microRNAs在脂多糖诱导的结肠癌细胞炎性反应模型中的表达

目的:研究microRNAs(miRNAs)在脂多糖(LPS)诱导的结肠癌细胞HT-29炎性反应模型中的表达。方法:用400 ng/mL的LPS处理HT-29细胞48 h,构建HT-29细胞炎性反应模型(LPS组),将未经LPS处理的HT-29细胞作为对照组;抽提细胞总RNA,检测HT-29细胞中白介素-6(IL-6)、C反应蛋白(CRP)的表达水平;用颈环结构引物反转录miRNAs,应用实时荧光定量PCR测定其表达水平。结果:LPS组中IL-6和CRP的表达较对照组显著升高(P0.01),表明建模成功。LPS组miR-22、miR-26、miR-214的表达水平较对照组低,而miR-23的表达水平较对照组高(P0.05);两组miR-24、miR-30、miR-181的表达水平差异无统计学意义。结论:miRNAs可能参与LPS诱导的HT-29结肠癌细胞的炎性反应过程。     

反应性氧代谢物清除剂逆转ROM对NK细胞抗K562细胞系体外抑制作用

为了探讨新型反应性氧代谢物(reactiveoxygenmetabolites,ROM)清除剂在NK细胞抑制K562细胞时作为免疫佐剂的作用,采用IL-2及PHA活化单核(MO)细胞,使MO细胞的ROM产量增加,观察NK细胞活性和K562细胞抑制率(KIR)的相应变化,然后在不同比例的MO NK K562细胞培养体系中加入不同浓度的ROM清除剂(硫普罗宁),定期检测ROM产量及KIR(每种检测均做3个复孔),同时应用不同浓度的二氢氯组胺(DHT)作为阳性对照。结果表明:在K562细胞、NK细胞混合培养体系中,当E/T=10/1时,加入IL-2/PHA后ROM的产量从33.17±25.02U/ml增至223.59±59.41U/ml(P<0.05),KIR从65.56%升至85.89%(P<0.05);当按E/MO=10/2、10/5、10/10三种比例加入MO细胞后,ROM产量随着MO细胞数量的增加而增加(ROM产量分别为389.79±43.83U/ml,456.74±42.77U/ml,601.42±21.92U/ml),而KIR则相反(KIR分别为82.36%,81.36%,48.09%);而在K562 NK MO IL-2/PHA混合培养体系中加入硫普罗宁、DHT后,当E/MO=10/2时,ROM产量从389.79±43.83U/ml分别降至-1.20±60.70U/ml和50.21±22.4U/ml(P<0.05),KIR则从82.53%分别升至96.09%和94.64%(P<0.05)。随着硫普罗宁、DHT浓度的增加,ROM产量逐渐减少。ROM产量与KIR呈负相关(r=-0.518)。当E/MO为10/5或10/10时,各浓度硫普罗宁及高浓度的DHT可使ROM产量减少(P<0.05),但KIR提高不明显(P>0.05)。硫普罗宁在提高KIR的效应方面与DHT相似(P>0.05),而在清除ROM方面,硫普罗宁较DHT为优(P<0.05)。结论:①MO细胞是ROM产生的最主要来源,其产生的ROM可使NK细胞的抗瘤(抗K562)活性下降;②新型ROM清除剂(硫普罗宁)可有效清除ROM,在一定程度上逆转ROM对NK细胞抗K562细胞的抑制作用,且在逆转ROM方面优于DHT,在提高NK细胞对K562细胞的抑制率方面效应强度与DHT相似,但毒副作用较低,有望替代DHT作为免疫佐剂用于白血病的过继性免疫治疗中。     

The irinotecan/5-fluorouracil combination induces apoptosis and enhances manganese superoxide dismutase activity in HT-29 human colon carcinoma cells

BACKGROUND: We examined whether induction of apoptosis and Mn-superoxide dismutase (Mn-SOD) and Cu,Zn-superoxide dismutase (Cu,Zn-SOD) activities were involved in the greater cytotoxicity of the irinotecan (CPT-11)/5-fluorouracil (5-FU) combination for human colon cancer cells when compared to both drugs alone. METHODS: HT-29 and SNU-C4 human colon carcinoma cell lines were treated with 5-FU and CPT-11, then apoptosis was evaluated by flow cytometry and SOD activities were determined by polyacrylamide gel electrophoresis. RESULTS: Enhanced apoptosis of HT-29 cells was observed with all treatments containing 5-FU in SNU-C4 cells; however, in HT-29 cells, apoptosis was enhanced only with the CPT-11/5-FU combination. In the SNU-C4 cell line, none of the treatments exerted a significant effect on Cu,Zn-SOD or Mn-SOD activity. However, in HT-29 cells, the CPT-11/5-FU combination enhanced Mn-SOD activity when compared to cells treated with CPT-11 alone. Nevertheless, the combined treatment did not interfere with Cu,Zn-SOD activity. CONCLUSION: Treatment with the CPT-11/5-FU combination may promote in HT-29 cell apoptosis by enhancing Mn-SOD activity.