血友病的携带者与产前分子诊断

目的：建立一种简便、快速的血友病携带者检测与产前诊断体系。方法：用聚合酶链反应(PCR)方法分别检测FⅧ内含子22倒位及血友病A家系中FⅧ基因内的BclⅠ位点、内含子13和22中STR和FⅧ基因外的DXS 52(ST14)位点的多态性；对血友病B家系检测FⅨ基因外6个STR位点(DXS1192、DXS1211、DXS8094、DXSS013、DXS1227、DXS102)的多态性。结果：综合应用直接检测倒位和遗传连锁分析。21个血友病A家系的可诊断率为94．7％；联合FⅨ基因外6个STR位点对血友病B家系进行遗传连锁分析。使10个家系全部得到诊断。结论：FⅧ内含子22倒位检测阳性，可以直接诊断血友病A的携带者及患儿；检测FⅧ基因内、外及FⅨ基因外多个位点的多态性并进行遗传连锁分析，是血友病携带者检测与产前诊断的简便、快速的方法。     

血友病携带者与产前基因诊断

目的建立1种简便、快速的血友病携带者检测与产前诊断体系。方法对38个血友病A家系,用长链PCR及序列特异PCR作F8基因内含子22及1倒位检测;有家族史家系可联合F8基因内外的8个多态性位点进行遗传连锁分析,DXS 52(ST14)位点多态性以PCR产物凝胶电泳法检测,7个STR位点(F8C ivs13、CA22、DXS15、DXS9901、G6PD、DXS1073、DXS1108)的多态性以多重荧光PCR法检测,产前诊断加用性别位点(Amelo);对于散发家系,通过直接核苷酸测序查找先证者的基因突变,继而对家系女性成员作携带者与产前诊断。对12个血友病B家系采用直接核苷酸测序法确定基因突变,多重荧光PCR法检测F9基因外6个STR位点(DXS1192、DXS1211、DXS8094、DXS8013、DXS1227、DXS102)的多态性。结果38个血友病A家系中,10名先证者的F8基因内含子22倒位检测为阳性,1例先证者为F8基因内含子1倒位阳性,对于有家族史的家系,综合应用倒位检测和遗传连锁分析,携带者与产前诊断率均为100%;4个散发家系均可找到致病突变;38个血友病A家系的携带者及产前诊断总诊断率为94.81%。12个血友病B家系中有10个家系通过直接测序可找到突变,联合F9基因外6个STR位点对血友病B家系的遗传连锁分析的可诊断率为96.88%。结论F8基因内含子22及1倒位筛检联合F8基因内、外多个位点的遗传连锁分析可以进行血友病A的携带者及产前诊断;直接核苷酸测序可确定F9基因突变,而联合基因外多个多态性位点检测并进行遗传连锁分析,是血友病B携带者检测与产前诊断的简便、快速的方法。     

血友病A／B的携带者和产前诊断研究

目的：建立一套简易、快速且准确率高的血友病携带者和产前诊断体系。方法：对血友病A（HA）家系采用长距离聚合酶链反应（LD-PCR）及序列特异PCR进行F8基因内含子22及内含子1倒位检测。对有家族史的HA家系可联合F8基因内外的8个多态性位点进行遗传连锁分析．产前诊断加测性别位点（Amelo）。而对散发家系，则通过直接核苷酸测序查找先证者的基因突变，继而对家系女性成员进行携带者与产前诊断。对血友病B（HB）家系，采用直接核苷酸测序法确定其基因突变．结果：100个HA家系中。22例先证者的F8基因内含子22倒位检测结果为阳性；2例患者母亲为F8基因内含子1倒位的携带者：对有家族史的家系，综合应用倒位检测和遗传连锁分析，携带者与产前诊断率均为100％。34个HA散发家系除2个家系外均可找到致病突变：发现可能携带者105例，产前诊断65例，总诊断率为95．9％：23个HB家系中19个家系通过直接测序可找到突变．而联合F9基因外6个STR位点对HB家系进行遗传连锁分析，发现31例可能携带者及需产前诊断者16例，总诊断率为95．7％。结论：F8基因内含子22及1倒位筛检联合F8基因内、外多个位点的遗传连锁分析．可作为HA的携带者检测及产前诊断的方法；直接核苷酸测序可确定F9基因突变．而联合基因外多个多态性位点检测并进行遗传连锁分析．是HB携带者检测及产前诊断的简便、快速方法。     

两个同源重组血友病家系的基因诊断

目的探讨特殊血友病家系的基因诊断。方法通过FⅧ基因内含子22倒位及内含子1倒位的直接检测与遗传连锁分析的间接诊断相结合对1个血友病A（HA）家系进行基因诊断；采用核酸直接测序法对FⅨ各外显子及其侧翼序列进行检测，并联合FⅨ基因相关的6个微卫星（STR）位点对1个血友病B（HB）家系进行基因诊断。结果HA家系先证者为FⅧ内含子1倒位阳性，家系中要求做携带者诊断的女性成员为内含子1倒位携带者；而FⅧ基因内外8个多态性位点遗传连锁分析证实该女性成员发生同源染色体重组。HB家系先证者除7号外显子测序未成功外，其余部分均未找到突变，家系中要求做携带者与产前诊断的女性，其羊水细胞经直接核酸测序未找到突变，利用FⅨ相关的6个STR位点进行遗传连锁分析发现该女性有染色体同源重组现象存在，胎儿为正常男性。结论在应用间接诊断方法进行HA和HB的携带者及产前基因诊断时，要考虑到染色体同源重组现象的发生可能导致误诊与漏诊的情况。在中国人群中应该开发更多的FⅧ和FⅨ分子中信息量大的多态性位点，以提高HA和HB的携带者及产前诊断的准确率。     

两个特殊血友病A患者家系的基因诊断

目的 探讨特殊血友病A(HA)家系的基因诊断。方法 用内含子22倒位检测及FⅧ基因内外4个位点的多态性进行遗传连锁分析;用核酸直接测序法对FⅧ各外显子及其侧翼序列进行检测。结果 家系1先证者表型为重型HA,FⅧ内含子22倒位检测及FⅧ基因内外4个位点的多态性遗传连锁分析未获得诊断信息;直接核酸测序证实先证者及其妹FⅧ基因24号外显子第2209位氨基酸存在R2209Q错义突变,后者胎儿DNA检测为正常男性。家系2中HA先证者已去世,一名要求做携带者检测的女性表型正常,内含子22倒位检测及直接核酸测序没有发现基因缺陷,用FⅧ基因内外4个位点的多态性遗传连锁分析均显示该成员未携带血友病A基因。结论 联合应用直接核酸测序法及多态性遗传连锁分析可以对特殊血友病A家系进行基因诊断。     

无先证者血友病A家系的基因诊断

目的 :探讨无先证者血友病A(hemophilia A,HA)家系的基因诊断。方法 :对5个无先证者的HA家系,采用长距离PCR及序列特异PCR直接检测疑似携带者的凝血因子Ⅷ(coagulation factorⅧ,FⅧ)基因内含子22倒位及1倒位;对其中未检测出的家系通过联合FⅧ基因内外的7个STR位点(FⅧCivs13、Intron25、3_486、5_147、5_226、DXS8069、DXS1073)进行遗传连锁分析,对于有产前诊断要求的孕妇则结合其男性胎儿脐带血的FⅧ活性检测结果作出分析。结果 :5个HA家系中,有3例疑似携带者的FⅧ基因内含子22倒位检测结果为阳性,1例疑似携带者的FⅧ基因内含子1倒位检测结果为阳性。对于另1例22倒位、1倒位检测结果均为阴性但有产前诊断要求的孕妇,通过联合FⅧ基因内外的7个STR位点进行遗传连锁分析,发现胎儿是携带1条致病X染色体的男性,且胎儿脐带血的FⅧ活性为1%,故联合诊断胎儿为男性HA患者。结论:在无HA先证者情况下,通过FⅧ基因内含子22及1倒位筛检,联合FⅧ基因内、外多个位点的遗传连锁分析及胎儿脐带血FⅧ活性检测,可为家系女性携带者的诊断及产前诊断提供有用信息。     

凝血因子Ⅷ内含子X ba Ⅰ多态位点检测及其在血友病A产前诊断中的应用

目的建立凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因内含子22的 Xba Ⅰ多态位点高特异的基因连锁分析法,并应用于血友病 A(HA)家系中孕妇携带者检测及产前基因诊断。方法用长距离 PCR 特异性扩增206个无血缘关系个体中 FⅧ基因内含子226.2 kb 片段并进行Ⅹba Ⅰ酶切,计算Ⅹba Ⅰ多态性位点的基因频率和多态信息量;用内含子22倒位检测及 FⅧ基因内Ⅹba Ⅰ,Bcl Ⅰ,Hind Ⅲ和(CA)n 二核苷酸重复序列多态性位点和 FⅧ基因外 DXS52多态性位点对20个 HA 家系进行间接基因诊断。结果ⅩbaⅠ多态性位点的基因频率和多态信息量分别是0.5475和0.4955;20个 HA 家系中,7个为内含子22倒位,13个非倒位家系中有6个家系Ⅹha Ⅰ均提供多态信息,其中2个家系只能用Ⅹba Ⅰ作出分子诊断,诊断率达46.15%;两个或两个以上连锁分析方法均提供多态信息的有8个家系。结论改进的 FⅧ基因内Ⅹba Ⅰ多态位点是一个特异性高,信息量大的分子诊断标志。联合用22内含子倒位及Ⅹba Ⅰ等5种间接检测方法大大地提高了 HA 基因诊断率,是防止患儿出生,阻断致病基因传递的有效措施。     

凝血因子Ⅷ内含子ⅩbaⅠ多态位点检测及其在血友病A产前诊断中的应用

目的建立凝血因子Ⅷ（FⅧ）基因内含子22的Ⅹba Ⅰ多态位点高特异的基因连锁分析法，并应用于血友病A（HA）家系中孕妇携带者检测及产前基因诊断。方法用长距离PCR特异性扩增206个无血缘关系个体中FⅧ基因内含子226．2kb片段并进行Ⅹba Ⅰ酶切，计算Ⅹba Ⅰ多态性位点的基凶频率和多态信息量；用内含子22例位检测及FⅧ基因内Ⅹba Ⅰ，BclⅠ，HindⅢ和（CA）n二核苷酸重复序列多态性位点和FⅧ基因外DXS52多态性位点对20个HA家系进行间接基因诊断。结果ⅩbaⅠ多态性位点的基因频率和多态信息量分别是0．5475和0．4955；20个HA家系中，7个为内含子22倒位，13个非倒位家系中有6个家系Ⅹba Ⅰ均提供多态信息，其中2个家系只能用Ⅹba Ⅰ作出分子诊断，诊断率达46．15％；两个或两个以上连锁分析方法均提供多态信息的有8个家系。结论改进的FⅧ基因内Ⅹba Ⅰ多态位点是一个特异性高，信息量大的分子诊断标志。联合用22内含子倒位及Ⅹba Ⅰ等5种间接检测方法大大地提高了HA基因诊断率。是防止患儿出生，阻断致病基因传递的有效措施。     

倒位PCR法检测血友病A FⅧ基因内含子22/1倒位

目的建立血友病A（hemophilia A,HA）FⅧ基因第22内含子倒位PCR检测法,并初步应用于HA直接基因诊断。方法应用倒位PCR（inversion-PCR,I-PCR）方法对24个HA家系中所有先证者的FⅧ基因22内含子倒位进行检测,对检测阳性者的母亲进一步用上述方法行携带者诊断,并对其中1例进行羊水产前基因诊断。检测阴性者再行内含子1倒位筛查。结果 24个HA家系中,7例先证者的F基因内含子22倒位检测为阳性,阳性检出率、可诊断率分别为29.17%、100%,未发现内含子1倒位;7例内含子22倒位突变阳性患者的母亲有6例为倒位携带者,羊水诊断未发现内含子22/1倒位。结论 I-PCR法能准确地检测F基因22内含子倒位突变,可应用于HA患者及携带者FⅧ基因22内含子倒位基因诊断及产前诊断。     

FⅧ基因内含子1倒位及X染色体非随机灭活导致的女性血友病A1例

目的：对1例女性血友病A（HA）患者进行基因分析，探讨其分子发病机制，并对其表姐进行携带者诊断．方法：测定1例女性HA患者的活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、FⅧ活性（FⅧ：C）、FⅨ活性（FⅨ：C）及血管性血友病因子（vWF）等，并进行HA表型诊断；采用长距离PCR及序列特异PCR检测其FⅧ基因内含子22及内含子1倒位，并对FⅧ基因的所有外显子及其侧翼序列进行测序。对FⅧ基因内外的8个多态性位点进行遗传连锁分析．应用凝胶电泳法检测PCR产物分析DXS52（ST14）位点多态性，采用多重荧光PCR法检测7个STR位点（F8Civs13、CA22、DXS15、DXS9901、G6PD、DXS1073及DXS1108）的多态性。应用甲基化敏感的HpaⅡ内切酶，对基因组DNA进行酶切；荧光PCR法对HpaⅡ酶切前后的基因组DNA进行人雄激素受体基因（HUMARA）CAG重复序列扩增：荧光扫描法对扩增产物进行检测，并根据酶切前后PCR产物的峰值变化，分析判断X染色体的随机灭活模式。结果：表型检测先证者APTT延长（128．5s），FⅧ：C活性明显下降（〈1％），家系另2例患者FⅧ：C活性亦明显下降（〈1％）。该家系成员FⅧ内含子22倒位检测均为阴性；1例位检测则显示该女性HA患者为阳性携带者，该家系另2例男性患者均显示为该倒位阳性：该女性HA患者FⅧ基因测序未发现突变。遗传连锁分析发现，该女性患者携带致病基因的染色体遗传自其母亲：其X染色体为非随机灭活，遗传自父亲的X染色体被大部分灭活，而遗传自母亲的X染色体保留3大部分活性．结论：该女性HA患者存在FⅧ基因内含子1倒位的X染色体来自其母亲，且在X染色体非随机灭活中保留了活性。FⅧ基因内含子1倒位及X染色体非随机灭活导致了女性HA的发生。     

Carrier detection and prenatal diagnosis of hemophilia A.

The aim of this study was to establish a simple, rapid carrier detection and prenatal diagnosis system for hemophilia A. Intron 22 inversion in FVIII gene was directly examined by long-distance polymerase chain reaction. Polymorphisms of factor VIII intragenic restriction fragment length polymorphism of Bcl I, short tandem repeat (STR) within intron 13 and 22, and extragenic DXS 52 (St 14) variable number tandem repeats (VNTR) loci were assessed by hereditary linkage analysis. The diagnostic rates for these loci were 47.6% (intron 22 inversion), 27.8% (Bcl I, 28.6% and 29.4% (STR within intron 13 and 22), and 81.3% (DXS52), respectively. The overall diagnostic rate in 21 families was 94.7%. The diagnosis in hemophilia A patients or carriers can be made if intron 22 inversion is present. The intragenic and extragenic loci hereditary linkage analysis could be used to establish the diagnosis in intron 22 inversion-negative patients.     

Use of Intron 1 and 22 inversions and linkage analysis in carrier detection of hemophilia A in Indians

BACKGROUND: Hemophilia A is an X-linked recessively inherited bleeding disorder characterized by deficiency of procoagulant factor VIII (FVIII). METHODS: Sixty unrelated hemophilia A patients and their family members have undergone tests for carrier detection by linkage analysis using the polymorphic markers Bcl I, Xba I and Intron 13 or 22 VNTRs. In families of sporadic hemophiliacs, the carrier status of female subjects was ascertained by linkage analysis along with FVIII:C/VWD Ag estimation. RESULTS: Of the 33 families with positive family history, the defective X chromosome was tracked in 28 mothers. The carrier status of females from hemophilia A families with positive family history, ascertained by linkage analysis and Intron 22 and 1 inversion, was made out in 85% cases. FVIII:C/VWF Ag ratio was evaluated in 36 females from 9 sporadic hemophilic families. Using the FVIII:C/VWF Ag ratio along with linkage analysis, carrier status was determined in 9 (25%) of the 36 females studied. Using Intron 22 inversion along with linkage analysis and FVIII:C/VWF Ag estimation, the informativity in female subjects from families of sporadic hemophiliacs increased from 25% to 52%. CONCLUSION: In the West, linkage analysis with Bcl I, Xba I and Intron 13 or 22 VNTR markers and inversion 22 offers a good tool for carrier detection of hemophilia A in India.     

Evaluation of DNA-based diagnosis for haemophilia A.

Haemophilia A is an X-linked disorder affecting 1.7/10,000 males. Carrier detection in females and prenatal diagnosis of male foetuses is greatly improved by DNA-based diagnosis. This study describes the use of the polymerase chain reaction (PCR) and allele-specific oligonucleotides (ASO) in a clinical study comprising 190 individuals in 27 families. Prenatal diagnosis was performed in eight cases. Of three male fetuses, two were found to be affected and one unaffected. It is shown that 62% of women in the Swedish population are heterozygous for the intragenic BclI or XbaI polymorphisms and consequently a majority of them (53%) can be analysed in the PCR-based format. Using three intragenic polymorphisms, a combined heterozygosity of 64% was recorded in the females. If the extragenic loci DXS52 and DXS15 were used in addition, 97% of the women could be counselled by DNA-analysis. Our study demonstrates the usefulness of PCR-based analysis of the BclI- and the XbaI-polymorphisms in genetic counselling. The counselling of women with conflicting results between coagulation data and DNA-based linkage analysis is discussed.     

FⅧ基因内含子22倒位及X染色体非随机灭活导致的女性血友病A

目的 对1例女性血友病A(HA)患者进行产前诊断,探讨其分子发病机制.方法 利用测定FⅧ活性(FⅧ:C)、出血时间(BT)、血管性血友病因子(VWF)等指标进行HA表型诊断;用长链PCR及序列特异PCR进行FⅧ基凶内含子22及1倒位检测,对FⅧ基因的所有外显子及其侧翼序列进行测序.联合FⅧ基因内外的8个多态性位点进行遗传连锁分析,DXS 52(ST14)位点多态性以PCR产物凝胶电泳法榆测,7个微卫星位点(F8Civs13、CA22、DXS15、DXS9901、G6PD、DXS1073、DXS1108)的多态性以多重荧光PCR法检测,产前诊断加用性别位点(Amelo).利用甲基化敏感的限制性内切酶HpaⅡ对基因组DNA进行酶切,荧光PCR法对HpaⅡ酶切前后的基因组DNA进行人类雄激素受体基丙(HUMARA)中CAG重复序列的扩增,荧光扫描法对扩增产物进行检测,根据酶切前后PCR产物的峰值变化来分析判断X染色体的随机灭活模式.结果 先证者的FⅧ:C为2.1%,其余表型检测结果均正常,其家系成员表型检测结果均正常.FⅧ基因内含子22倒位检测示先证者为22倒位阳性携带者,家系其他成员及胎儿均为22倒位阴性;先证者FⅧ基因内含子1倒位检测结果为阴性,其FⅧ基因测序未发现突变.遗传连锁分析发现先证者的X染色体分别遗传自其父亲、母亲;其胎儿为女性且遗传了先证者来源于其母亲的1条X染色体.先证者为X染色体非随机灭活,其来自母亲的x染色体被大部分灭活,而来自父亲的x染色体大部分被保留活性.结论 FⅧ基冈内含子22倒位及X染色体非随机灭活导致了该例女性血发病A的发生,其胎儿为正常女性.