丹参对烧伤大鼠肠黏膜上皮细胞线粒体功能的影响

目的 :探讨丹参对烧伤大鼠肠黏膜上皮细胞线粒体呼吸功能及氧自由基的影响。方法 :96只 SD大鼠按随机数字表法分为对照组 ( A)、烧伤组 ( B)、治疗组 ( C)。B组和 C组造成 2 0 %总体表面积 度烧伤。在伤后1、2、6 h,动态检测肠黏膜上皮细胞线粒体内细胞色素 aa3、细胞色素 C、能荷和超氧化物歧化酶 ( SOD)水平。结果 :1伤后 2 h内 ,B、C组肠黏膜上皮细胞线粒体内细胞色素 aa3水平无显著降低 ( P均 >0 .0 5 )。伤后 6 h,B、C组肠黏膜上皮细胞线粒体内细胞色素 aa3水平均显著低于 A组 ( P均 <0 .0 5 ) ;同时 C组显著高于 B组( P<0 .0 5 )。2伤后 1h始 ,大鼠肠黏膜上皮细胞线粒体内细胞色素 C水平、能荷和 SOD活力下降 ;C组显著高于 B组 ( P均 <0 .0 5 )。结论 :丹参能显著提高细胞色素 aa3、细胞色素 C、能荷和 SOD水平 ;明显改善大鼠烧伤后肠黏膜上皮细胞线粒体呼吸功能及明显减少氧自由基的产生。     

二甲双胍通过激活腺苷酸活化蛋白激酶抑制大鼠心脏成纤维细胞增殖及胶原合成

目的探讨降糖药物二甲双胍（metformin）对心脏成纤维细胞（CF）增殖及胶原合成的影响及可能的机制。方法培养新生SD大鼠CF,以血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）刺激CF增殖,同时分别单独或联合应用二甲双胍及一磷酸腺苷活化蛋白激酶（P-AMPK）抑制剂Compound C,用MTT法测CF增殖,3H-脯氨酸掺入率法测定CF胶原合成,Western blot测定腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）及P-AMPK水平。结果 CF经AngⅡ刺激24h后,显著增殖,同时胶原率提高;二甲双胍显著抑制了AngⅡ诱导的CF增殖及胶原合成增加;Compound C完全抑制了二甲双胍的这一效应,而单独应用Com-pound C并未进一步加重AngⅡ诱导的CF增殖及胶原合成。二甲双胍显著提高AngⅡ刺激的CF的P-AMPK水平,同时Compound C抑制了二甲双胍对AMPK的磷酸化激活。结论二甲双胍显著抑制了AngⅡ诱导的CF增殖及胶原合成增加,这一效应可能由二甲双胍激活AMPK介导。     

抗精神病药氯氮平通过AMPK-ULK1-Beclin1信号通路对神经元自噬的影响

目的 探究抗精神病药氯氮平是否通过AMPK-ULK1-Beclin1信号通路引起神经元自噬,并进行验证。方法 SPF级C57/BL6雄鼠45只根据随机数字表法分为溶剂组、氯氮平组、氯氮平加AMPK抑制剂(Compound C)组。氯氮平组小鼠通过腹腔注射给予氯氮平(10 mg/kg),溶剂组小鼠给予等量溶剂(0. 3%酒石酸)腹腔注射,氯氮平加Compound C组除给予氯氮平腹腔注射外,还通过脑室给予1μl Compound C(25 nmol/L)注射。取小鼠海马脑组织,通过Western blotting检测腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、unc-51样自噬激活激酶1 (ULK1)、Beclin1蛋白及各自磷酸化水平;通过LC3免疫荧光染色观察该蛋白表达,计算海马脑区自噬水平。结果 与溶剂组相比,氯氮平组AMPK和ULK1及Beclin1的磷酸化水平均有显著增加(pAMPK1/AMPK:2. 37 vs. 1. 0,P 0. 001; pULK1/ULK1:1. 75 vs. 1. 0,P 0. 05; p Beclin1/Beclin1:2. 01 vs. 1. 0,P 0. 001),小鼠海马脑区神经元自噬水平显著增加(0. 773%vs. 0. 291%,P 0. 001);而与氯氮平组相比,给予Compound C脑室注射后ULK1及Beclin1的磷酸化水平均有显著降低(p ULK1/ULK1:0. 511 vs. 1. 0,P 0. 05; p Beclin1/Beclin1:0. 665 vs. 1. 0,P 0. 01),神经元自噬水平也显著降低(0. 132%vs. 0. 622%,P 0. 001)。结论 氯氮平可以通过AMPK-ULK1-Beclin1信号通路诱导神经元自噬。     

小剂量环孢霉素A抑制大鼠缺血性急性肾衰竭中肾小管上皮细胞线粒体通透性转运

目的研究小剂最环孢霉素A(CsA)对大鼠缺血性急性肾衰竭诱导的肾小管上皮细胞线粒体通透性转运的影响,探讨其抑制肾小管上皮细胞凋亡的作用机制。方法Wistar大鼠双侧肾动脉夹闭30min诱导缺血性急性肾衰竭。再灌注18h后留取肾组织及血液标本。比色法测定血清肌酐(SCr)浓度,原位末端标记(TUNEL)法检测肾小管上皮细胞凋亡情况,Westernblot测定肾组织中胞浆细胞色素C、caspase-3、9蛋白质表达。结果肾脏缺血30min／再灌注18h后大鼠SCr明显升高[(106．9±19．4)μmol／Lvs(56．5±7．1)μmol／L,P<0．05],肾小管上皮细胞凋亡数目显著增加[(20．14±3．70)％vs(0．99±0．17)％,P<0．05],肾组织胞浆细胞色素c、caspase-3、9表达增加(P<0．05);CsA能显著降低SCr[(87．5±18．5)μmol／L],减轻肾小管上皮细胞凋亡[(14．61±3．39)％],下调胞浆细胞色素C、caspase-3、9表达(P<0．05)。结论小剂量CsA能抑制大鼠缺血性急性肾衰竭引起的线粒体通透性转运,从而减轻肾小管上皮细胞凋亡,保护肾功能。     

缺氧复氧后肾小管上皮细胞MCP-1表达及N-乙酰半胱氨酸对其的干预研究

目的:研究缺氧复氧后肾小管上皮细胞MCP-1的表达及N-乙酰半胱氨酸(NAC)对其的影响.方法:选用人肾小管上皮细胞(HK2)建立缺氧复氧损伤模型,设正常对照组、单纯缺氧复氧组、不同浓度NAC干预组.流式细胞术检测细胞内氧化应激水平,ELISA法检测细胞上清MCP-1蛋白表达,RT-PCR法测定细胞MCP-1 mRNA表达.结果:缺氧复氧后HK2细胞内氧化应激水平提高,MCP-1蛋白和mRNA表达上调,随缺氧时间的延长,细胞内氧化应激水平逐渐升高,MCP-1蛋白和mRNA表达逐渐增强;NAC呈剂量关系抑制细胞内氧化应激水平,呈剂量关系抑制MCP-1蛋白和mRNA表达的上调.结论:缺氧复氧诱导细胞内氧化应激的产生,诱导MCP-1表达上调;NAC可以通过抑制细胞内氧化应激抑制MCP-1的上调.     

C57BL/6小鼠心肺复苏后心肌细胞线粒体自噬及细胞凋亡的相互作用与调节机制的研究

目的:探讨在心搏骤停心肺复苏系统性缺血再灌注损伤过程中,C57BL/6小鼠心室肌细胞线粒体自噬与细胞凋亡之间的相互作用和调控机制。方法:80只健康雄性C57BL/6小鼠应用高钾合并窒息法制备心搏骤停心肺复苏模型。其中6只复苏前组,74只小鼠造模。造模小鼠中有50只自主循环恢复(ROSC),将其随机分为复苏后2、12、24、48h组。应用透射电镜检测心肌细胞线粒体形态;应用Western blot检测线粒体自噬蛋白表达和蛋白磷酸化表达,检测与线粒体相关的细胞凋亡信号通路的蛋白表达和蛋白磷酸化表达。结果:C57BL/6高钾心搏骤停心肺复苏小鼠模型在复苏后48h内线粒体自噬特异性信号蛋白LC3-II表达持续显著增加,启动线粒体自噬的蛋白ULK1表达也持续增加。在复苏后12、24、48hC57BL/6小鼠通过mTOR磷酸化ULK1抑制线粒体自噬过度增加。C57BL/6小鼠在复苏后2、12h凋亡信号caspase-9蛋白活化增加,复苏后24、48h caspase-9蛋白激活逐步减少。心肺复苏后抑制凋亡因子Bcl-2未被明显激活。蛋白细胞色素C(Cyt c)和Smac/Diablo是线粒体释放的促进细胞凋亡的信号。C57BL/6小鼠在复苏后48h内线粒体释放的Smac/Diablo未见显著增加,线粒体释放的Cyt c在复苏后12h达到峰值。结论:免疫功能正常的C57BL/6小鼠心肌细胞在心搏骤停心肺复苏系统性缺血再灌注损伤过程中,激活线粒体自噬,清除受损的线粒体。在复苏后24h抑制线粒体自噬的信号通路也被激活,提示体内的调控机制发挥作用,防止线粒体过度自噬。线粒体释放促进细胞凋亡的信号蛋白Cyt c在复苏后12h达到峰值。Cyt c与procaspase-9/Apaf 1交联,促使caspase-9活化。     

丹参改善烧伤大鼠肠黏膜上皮细胞线粒体功能的亚细胞水平观察

背景严重烧伤时缺血、缺氧、再灌注造成的氧自由基损伤及感染会对肠黏膜造成损伤.目的从亚细胞水平观察丹参能否改善大鼠烧伤后肠黏膜上皮细胞线粒体呼吸功能及减少氧自由基的产生,从而保护肠黏膜.设计单一样本,随机对照动物实验.单位解放军第三医院烧伤科.材料实验于2001-12/2002-02在解放军第三医院外科研究所完成.选用清洁级SD大鼠96只,随机数字表法分为3组,正常对照组24只,烧伤模型组和丹参治疗组各36只.1 mL丹参注射液含丹参生药1.5 g.方法①烧伤模型组和丹参治疗组大鼠建立烧伤模型,造成20%总体表面积Ⅲ度烫伤.②正常对照组不致伤.③丹参治疗组造模后立即经股静脉缓慢注射丹参注射液1 mL/kg,正常对照组和烧伤模型组注射等量生理盐水.④烧伤模型组、丹参治疗组分别于造模后1,2,6 h各处死12只大鼠,正常对照组分别于对应时间点各处死8只.⑤采集小肠标本,检测肠黏膜上皮细胞线粒体细胞色素aa3、细胞色素C、能荷水平和超氧化物歧化酶的活力.主要观察指标造模后1,2,6 h各组肠黏膜上皮细胞线粒体内细胞色素aa3、细胞色素C、能荷水平及超氧化物歧化酶活力的变化.结果实验选用96只SD大鼠,均进入结果分析.①造模后不同时间点各组肠黏膜上皮细胞线粒体内细胞色素aa3水平的测定与正常对照组比较,烧伤模型组、丹参治疗组造模后2 h内肠黏膜上皮细胞线粒体内细胞色素aa3水平均无明显变化(P均＞0.05),造模后6 h均明显低于正常对照组(P均＜0.05),且丹参治疗组显著高于烧伤模型组[(3.16±0.13),(2.56±0.15)μkat/g,P＜0.05].②造模后不同时间点各组肠黏膜上皮细胞线粒体内细胞色素C、能荷水平、超氧化物歧化酶活力的测定与正常对照组比较,烧伤模型组在造模后1,2,6 h肠黏膜上皮细胞线粒体内细胞色素C、能荷水平、超氧化物歧化酶活力均明显下降(P＜0.05或0.01);而丹参治疗组在各时间点以上指标均显著高于烧伤模型组(P＜0.05或0.01).结论丹参能显著提高烧伤大鼠肠黏膜上皮细胞线粒体细胞色素aa3、细胞色素C及能荷水平,明显减少氧自由基的产生,从而改善大鼠烧伤后肠黏膜上皮细胞线粒体的呼吸功能.     

丹参对烧伤大鼠肝细胞线粒体呼吸功能的影响

目的:探讨丹参对烧伤大鼠肝细胞线粒体呼吸功能及氧自由基的影响。方法:将96只SD大鼠按随机数字表法分为正常对照组(A)、模型组(B)和丹参组(C);B组和C组造成20%总体表面积Ⅲ度烫伤。在伤后1、2和6 h动态检测肝细胞线粒体内细胞色素aa3、细胞色素C、能荷和超氧化物歧化酶(SOD)水平。结果:①伤后2 h内,B、C组肝细胞线粒体内细胞色素aa3水平均无显著降低(P均>0.05)。伤后6 h,B、C组肝细胞线粒体内细胞色素aa3水平显著低于A组(P均<0.05);同时C组显著高于B组(P<0.05)。②伤后1 h开始,肝细胞线粒体内细胞色素C水平、能荷和SOD活性下降;且C组显著高于B组(P均<0.05)。结论:丹参能显著提高肝细胞线粒体内细胞色素aa3、细胞色素C、能荷和SOD水平;明显改善大鼠烧伤后肝细胞线粒体呼吸功能,减少氧自由基的产生。     

缺氧与氧化损伤后肾小管上皮细胞能量代谢及细胞骨架的改变

目的:观察缺氧、氧化损伤后培养的人肾小管上皮细胞能量代谢及细胞骨架改变之间的关系。方法:实验于2002-09/2003-09在解放军第三军医大学西南医院实验动物中心完成。①将人肾小管上皮细胞株HK-2细胞分为正常组、缺氧组、氧化损伤组3组:正常组中加入无血清RMPI1640培养液;缺氧组加入含0.1μmol/L抗霉素A的无血清无底物RMPI1640培养液;氧化损伤组加入含0.1mmol/LH2O2的无血清RMPI1640培养液。②观察各组细胞生长状况和形态及细胞存活率;测定细胞外液乳酸脱氢酶比活性代表肾小管上皮细胞膜通透性变化;采用ATP酶(Na ,K 和Ca2 -ATP)试剂盒直接测定各组细胞能量代谢改变,采用细胞免疫荧光化学方法检测各组细胞细胞骨架改变。结果:①正常组细胞生长状况良好,折光性强;缺氧、氧化损伤组细胞皱缩、突起减少,细胞存活率明显低于正常组[(56.2±2.3)%,(62.5±2.6)%,(96.5±3.2)%,P<0.01]。②缺氧、氧化损伤组乳酸脱氢酶比活性显著高于正常组(P<0.01)。③Na -K -ATP酶和Ca2 -ATP酶活性正常组明显高于缺氧、氧化损伤组[(9.61±0.53),(3.68±0.27),(5.10±0.19)nkat/g;(7.97±0.66),(3.12±0.24),(4.56±0.32)nkat/g,P<0.01],而缺氧组、氧化损伤组之间比较差异不显著(P>0.05)。④免疫荧光标记细胞内细胞骨架(微管、微丝、中间丝)显示正常TEC微管、微丝、中间丝表达丰富,在胞浆内呈均匀一致分布;缺氧、氧化损伤后细胞骨架破坏、塌陷,网络结构和支架作用消失。结论:缺氧、氧化损伤能量代谢障碍可造成细胞骨架破坏,最终导致肾小管上皮细胞的坏死和凋亡。     

TLR4基因小干扰RNA对缺氧复氧诱导肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的研究Toll样受体4(TLR4)基因小干扰RNA(siRNA)对体外缺氧复氧条件下诱导肾小管上皮细胞分泌TNF-α的抑制作用。方法 Wistar大鼠原代肾小管上皮细胞(PTECs)置于六孔培养板培养,随机分为A组(正常培养组)、B组(缺氧复氧+TLR4-siRNA转染组)、C组(缺氧复氧组)、D组(缺氧复氧+对照siRNA转染组)共4组。其中B组、C组和D组细胞缺氧3h,随后复氧24h,RT-PCR方法和Westernb lot检测TLR4 mRNA和蛋白表达情况;流式细胞仪检测细胞凋亡情况,ELISA方法检测各组上清液中TNF-α含量。结果经缺氧复氧处理后,B组、C组和D组的TLR4 mRNA、蛋白水平较A组均显著上调(P<0.01),各组上清液TNF-α含量较A组也显著升高(P<0.01):而B组TLR4 mRNA、TLR4蛋白表达量和上清液TNF-α含量较C组和D组均显著下调(P<0.01);D组与C组相比,各项检测指标表达无显著变化(P>0.05)。结论针对TLR4 mRNA的siR-NA可以有效地抑制缺氧复氧诱导的肾小管上皮细胞的凋亡和炎症反应。     

小檗碱影响AMPK/PGC-1信号途径改善糖尿病胰岛素抵抗和线粒体功能的研究

目的探讨小檗碱改善糖尿病鼠糖代谢及胰岛素抵抗作用及对骨骼肌线粒体功能的影响和机制。方法采用db/db小鼠为研究对象,以野生型小鼠为对照组。给予小檗碱(5 mg·kg-1·d-1)腹腔注射3周,观察食量、体重和空腹血糖水平;第3周末处死,留取血标本分离血清,检测胰岛素水平并计算胰岛敏感指数,留取附睾脂肪垫并称重;提取腓肠肌线粒体,检测细胞色素C氧化酶活性和ATP定量,Western blot检测腓肠肌AMPK/PGC-1α表达。结果小檗碱给药3周后,db/db小鼠的体重和脂肪垫重量均显著降低,血糖水平下降,胰岛素敏感指数改善;但给药前后的胰岛素释放水平无明显改变。小檗碱可一定程度地升高骨骼肌线粒体COX活性水平,明显提高ATP含量,并使AMPK磷酸化水平显著激活,PGC-1α转录活性增强。结论小檗碱具有明显的降糖、降脂、改善胰岛素抵抗作用,其降糖作用与刺激胰岛素释放水平无关,而与激活AMPK/PGC-1α信号途径,提高线粒体能量代谢有关。     

丹参改善烧伤大鼠肠黏膜上皮细胞线粒体功能的亚细胞水平观察

背景：严重烧伤时缺血、缺氧、再灌注造成的氧自由基损伤及感染会对肠黏膜造成损伤。 目的：从亚细胞水平观察丹参能否改善大鼠烧伤后肠黏膜上皮细胞线粒体呼吸功能及减少氧自由基的产生，从而保护肠黏膜。 设计：单一样本，随机对照动物实验。 单位：解放军第三医院烧伤科。 材料：实验于2001-12／2002-02在解放军第三医院外科研究所完成。选用清洁级SD大鼠96只，随机数字表法分为3组，正常对照组24只，烧伤模型组和丹参治疗组各36只。1mL丹参注射液含丹参生药1．5g。 方法：①烧伤模型组和丹参治疗组大鼠建立烧伤模型，造成20％总体表面积Ⅲ度烫伤。②正常对照组不致伤。③丹参治疗组造模后立即经股静脉缓慢注射丹参注射液1mL/kg，正常对照组和烧伤模型组注射等量生理盐水。④烧伤模型组、丹参治疗组分别于造模后1，2，6h各处死12只大鼠，正常对照组分别于对应时间点各处死8只。⑤采集小肠标本，检测肠黏膜上皮细胞线粒体细胞色素aa3、细胞色素C、能荷水平和超氧化物歧化酶的活力。 主要观察指标：造模后1，2，6h各组肠黏膜上皮细胞线粒体内细胞色素aa3、细胞色素C、能荷水平及超氧化物歧化酶活力的变化。 结果：实验选用96只SD大鼠，均进入结果分析。①造模后不同时间点各组肠黏膜上皮细胞线粒体内细胞色素aa3水平的测定：与正常对照组比较，烧伤模型组、丹参治疗组造模后2h内肠黏膜上皮细胞线粒体内细胞色素aa3水平均无明显变化（P均〉0．05），造模后6h均明显低于正常对照组（P均〈0．05），且丹参治疗组显著高于烧伤模型组[（3．16&;#177;0．13），（2．56&;#177;0．15）μkat／g，P〈0．05]。②造模后不同时间点各组肠黏膜上皮细胞线粒体内细胞色素C、能荷水平、超氧化物歧化酶活力的测定：与正常对照组比较，烧伤模型组在造模后1，2，6h肠黏膜上皮细胞线粒体内细胞色素C、能荷水平、超氧化物歧化酶活力均明显下降（P〈0．05或0．01）；而丹参治疗组在各时间点以上指标均显著高于烧伤模型组（P〈0．05或0．01）。 结论：丹参能显著提高烧伤大鼠肠黏膜上皮细胞线粒体细胞色素aa3、细胞色素C及能荷水平，明显减少氧自由基的产生，从而改善大鼠烧伤后肠黏膜上皮细胞线粒体的呼吸功能。     

AMPK在七氟烷致H4细胞凋亡中的作用研究

目的:探讨AMPK是否会影响七氟烷引起的细胞凋亡,为研究吸入麻醉药致神经毒性的机制提供新的靶点和思路。方法:用4.1%七氟烷处理H4人脑神经胶质瘤细胞6 h,建立七氟烷细胞毒性模型。建模前予以AMPK激动剂(二甲双胍)或AMPK抑制剂(Compound C)进行预处理。运用Westernblot检测AMPK、p AMPK、full-length caspase-3以及caspase-3 fragment的表达情况。结果:在七氟烷致H4细胞凋亡的模型中,通过AMPK激动剂进一步增加七氟烷所致的p AMPK上调,能够减少细胞凋亡。结论:在七氟烷致H4细胞凋亡的模型中,激活AMPK具有细胞保护作用。     

血小板生成素通过PI3K/AKT通路防止CoCl_2诱导内皮细胞凋亡

目的:研究血小板生成素(TPO)对化学性缺氧模拟剂氯化钴(CoCl_2)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡的作用及其机制。方法:实验分为4组,体外培养的未经处理的HUVEC为对照组,CoCl_2与HUVEC共培养的为CoCl_2组,在加入CoCl_2前用TPO预处理HUVEC为TPO+CoCl_2组,TPO单独处理HUVEC为TPO组。使用CCK-8法检测各组细胞的细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡率、凋亡蛋白酶Caspase-3的表达以及线粒体膜电位的变化。Western blot检测TPO对AKT通路磷酸化水平表达的影响。结果:CoCl_2可以明显抑制HUVEC的生长,细胞存活率随着CoCl_2的浓度的升高逐渐下降(r=-0.997);与对照组相比较,CoCl_2组的细胞凋亡率明显升高(P0.001),而TPO+CoCl_2组的细胞凋亡率较前者明显下降(P0.001),提示TPO对HUVEC有保护作用。TPO还能减少细胞凋亡蛋白酶Caspase-3的表达和抑制细胞线粒体膜电位的降低,以及刺激HUVEC PI3K/AKT通路的活化。结论:TPO具有防止化学性缺氧所致的细胞凋亡作用,其机制可能是通过活化PI3K/AKT通路,从而减少细胞凋亡蛋白酶Caspase-3的活化表达和稳定线粒体膜电位来发挥细胞保护作用。     

缺氧条件下维生素E对视网膜色素上皮细胞生长的影响

目的:自行设计细胞模型并观察缺氧条件下维生素E对培养视网膜色素上皮细胞生长的影响。方法:实验于2006-10/2007-03在南京医科大学生理实验室完成。①实验操作:取对数生长期的细胞,以正常条件为对照(常规培养和体积分数为0.95的空气,体积分数为0.05的CO2),建立人视网膜色素上皮细胞的缺氧模型(缺氧培养,体积分数为0.95的N2和体积分数为0.05的CO2混合气体,测氧仪测氧浓度<1%,24h),作用于细胞的维生素E浓度分别为0.1,0.2,0.3mol/L。②实验评估:四甲基偶氮唑盐法检测24h细胞活力(以吸光度A值表示);激光共聚焦显微镜检测细胞内活性氧水平;黄嘌呤氧化酶法测定细胞内超氧化物歧化酶活性。结果:①四甲基偶氮唑盐检测细胞生长活力:缺氧组细胞活力低于对照组(P<0.01),缺氧 维生素E组细胞活力有所提高,与缺氧组相比,差异显著(P<0.05)。随着维生素E浓度的提高,活力逐渐升高。②细胞内活性氧水平:与对照组比较,缺氧组细胞内活性氧的产生明显增多;与缺氧组比较,缺氧 维生素E组抑制视网膜色素上皮细胞内活性氧的产生。③超氧化物歧化酶活力检测:与对照组比较,缺氧组超氧化物歧化酶的活力降低;与缺氧组比较,缺氧 维生素E组超氧化物歧化酶活力升高,差异均具有显著性意义(P<0.05)。结论:缺氧引起视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤,维生素E抑制了缺氧情况下视网膜色素上皮细胞的损伤作用,维生素E主要通过提高超氧化物歧化酶活性来发挥抗氧化损伤作用,其抗氧化损伤作用有剂量依赖性。     

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白对缺氧/复氧肾小管上皮HK-2细胞自噬作用的影响

摘要：目的：观察中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）对缺氧/复氧肾小管上皮细胞HK-2自噬水平的影响,探讨NGAL在肾小管上皮细胞缺氧/复氧过程中发挥的作用。 方法：构建高表达NGAL的载体pcDNA3.1(-)/myc-His B-NGAL,并转染HK-2细胞。将HK-2细胞分为未转染组和转染组,每组再分为缺氧/复氧处理组和未处理组。用western blot法检测转染后NGAL蛋白表达水平和缺氧/复氧后细胞自噬微管相关蛋白轻链3-Ⅱ（LC-3-Ⅱ）表达水平,并用CellTiter Blue细胞活性检测系统检测细胞活力。 结果：成功构建高表达NGAL的载体pcDNA3.1(-)/myc-His B-NGAL,转染HK-2细胞后,细胞NGAL蛋白表达水平高于未转染组（t=8.959,P<0.05）。缺氧1 h/复氧24 h后,转染组细胞LC-3-Ⅱ表达水平高于未转染组（t=21.721,P<0.05）,而细胞活力低于未转染组（t=－6.238,P<0.05）。 结论：在HK-2细胞缺氧/复氧状态下,NGAL能增强细胞自噬水平,导致细胞损伤加重甚至死亡。     

人近曲肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤模型的建立

目的 建立一种新的人近曲肾小管上皮细胞HK-2缺氧／复氧损伤模型。方法 本实验使用人近曲HK-2。实验分为缺氧4、12和24h及缺氧24h后复氧4、12和24h组，每个实验组均设立空白对照组。采用经高温灭菌的液体石蜡覆盖法造成缺氧环境；苔盼兰摄取法进行细胞计数及检测细胞存活率，生化法检测培养基中的乳酸脱氢酶（LDH）含量。结果 人肾小管上皮细胞经过缺氧／复氧处理后，苔盼兰摄取率显著提高，细胞存活率显著下降，LDH含量升高。说明缺血-再灌注损伤导致了细胞膜的完整性破坏，甚至细胞发生了不可逆转的损伤。结论 采用液体石蜡覆盖法建立人近曲肾小管上皮细胞缺氧／复氧损伤模型，较其他制模方法操作简单、易行、可靠。     

体外血管内皮生长因子单克隆抗体对C6胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移力的影响

目的:在体外观察血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体对C6胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移力的影响。方法:采用氯化钴(Co Cl2)模拟缺氧环境,予以0、0.1、1、10μg/m L的VEGF抗体,对常氧或缺氧条件下对C6胶质瘤细胞进行处理。通过MTT实验检测细胞增殖,Transwell实验检测细胞的侵袭和迁移能力,Western blotting检测HIF-1α蛋白、FAK/Pyk2总蛋白及磷酸化FAK-Tyr397/Pyk2-Tyr402表达水平变化。结果:200μmol/L Co Cl2明显抑制C6细胞增殖(P<0.05),10μg/m L VEGF抗体可明显抑制C6细胞增殖(P<0.05)。与常氧相比,缺氧可使C6细胞的迁移、侵袭能力增强(P<0.05)。常氧和缺氧下,VEGF抗体的干预均增强C6细胞的迁移、侵袭能力(P<0.05),且相对于常氧,缺氧可进一步增强VEGF抗体促C6细胞迁移、侵袭的作用(P<0.05)。Co Cl2干预可增加C6细胞中HIF-1α的含量;在常氧和缺氧情况下,只有1μg/m L VEGF抗体可降低FAK的总蛋白量(P<0.05);在缺氧情况下,VEGF抗体可明显增高Pyk2-Tyr402位点的磷酸化水平。结论:在缺氧情况下,VEGF抗体的干预可使Pyk2-Tyr402位点的磷酸化水平增高,引起C6细胞的侵袭迁移能力进一步增强。     

粘着斑激酶活性对气道上皮细胞增殖的影响

目的：研究粘着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）磷酸化对细胞外基质成份诱导的气道上皮细胞增殖和细胞周期演进的影响，探讨粘着斑激酶活化对气道上皮细胞损伤后修复影响的机制。方法：通过纤维连接蛋白（finbronectin，FN）诱导培养的气道上皮细胞，利用四唑盐（MTT）比色实验研究气道上皮细胞增殖情况，采用流式细胞术分析气道上皮细胞细胞周期各期分布，以Western blot和免疫共沉淀检测FAK表达水平及其酪氨酸磷酸化程度；以FAK反义寡核苷酸（ODNs）经脂质体转染细胞，观察其对FAK磷酸化、细胞增殖和细胞在细胞周期各期分布的影响。结果：FN诱导的气道上皮细胞MTT吸光度明显增强，G1期细胞数量明显减少，S期和G2期细胞数量明显增多，同时FAK表达水平及其酪氨酸磷酸化程度显著增高；经脂质体转染了反义FAK寡核苷酸的气道上皮细胞MTT吸光度值显著降低，G1期细胞数明显增多，S期和G2期细胞数显著减少，FAK表达水平及其酪氨酸磷酸化程度降低，且与Gt期细胞数量的增多成显著负相关，与S期、G2期细胞数量和MTT吸光度的减少成明显正相关。结论：FAK是细胞外基质诱导气道上皮细胞增殖的重要信号分子，其活化促进气道上皮细胞的增殖和细胞周期的演进，在气道上皮细胞损伤后修复过程中起重要作用。