人胎盘与骨髓源性间充质干细胞体外培养及生物学特性对比

背景:组织工程修复大块组织缺损需要高浓度、大量的细胞接种,骨髓间充质干细胞是种子细胞的主要来源,但存在数量上的局限性及长期传代后细胞功能老化的问题.目的:体外分离培养、扩增人胎盘源性间充质干细胞与人骨髓间充质干细胞,并对其生物学性状进行比较.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2008-09/2009-02在东直门医院实验室完成.材料:胎盘由解放军空军总医院妇产科提供,骨髓来源于健康成人献髓者.方法:采用密度梯度离心法从胎盘中分离、纯化和传代培养人胎盘源性间充质干细胞;骨髓肝素抗凝后,采用密度梯度离心法分离、纯化和传代培养入骨髓基质干细胞.主要观察指标:用倒置相差显微镜观察两种细胞形态及细胞生长情况,流式细胞仪分析检测第5代细胞表面标志的表达,Von Kossa染色及油红O染色检测分化能力.结果:镜下两种细胞均为贴壁生长,形态为均一成纤维细胞样,传5代后细胞的增殖能力随传代次数的增加而有所下降,体外培养10代后细胞生长速度减慢,但人胎盘源性间充质干细胞扩增倍数较人骨髓基质干细胞平均高出两三个数量级.两种细胞具有均一的细胞衷型,均表达CD29,CD44,CD166,不表达CD34,CD45,HLA-DR.两种细胞都具有成骨、成脂分化潜能,但人胎盘源性间充质干细胞分化潜能更强.结论:人胎盘源性间充质干细胞与人骨髓基质干细胞具有相似的生物学特性,且前者具有更强的增殖能力.     

大鼠脂肪和骨髓来源间充质干细胞的生物学特性比较

背景:除骨髓外,人们已从胎盘组织、脐带血肌肉组织、脂肪组织中分离到了间充质干细胞.目的:比较大鼠脂肪和骨髓间充质干细胞生物学特性和免疫调节功能的差异.方法:脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞分别来自BN大鼠的脂肪和骨髓.体外分离、纯化脂肪和骨髓来源间充质干细胞,进行细胞形态、表面标志、生长动力学、分化潜能鉴定;混合淋巴细胞反应比较两种细胞的免疫调节特性.结果与结论:脂肪间充质干细胞与骨髓间充质干细胞光镜和透射电镜下形态相似,第3代的脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞均高表达CD29,CD90,低表达CD34,CD45,CD11b;第3,4,5代脂肪间充质干细胞增殖速度明显快于骨髓间充质干细胞;两者都具有低免疫原性,可以抑制异基因抗原引起的T淋巴细胞增殖,且这种抑制作用与细胞数目成正相关,等量脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞抑制作用差异无显著性意义.结果证实脂肪间充质干细胞具有和骨髓间充质干细胞同样的低免疫原性和免疫调节功能.     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

背景:培养出生长状态良好、数量足够多的大鼠骨髓间充质干细胞是其作为种子细胞在组织工程等领域广泛应用的重要前提.目的:寻求快捷有效的大鼠骨髓间充质干细胞体外培养条件,观察培养的间充质干细胞生物学特性.方法:全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,免疫荧光分析细胞骨架,MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测其表面标记.结果与结论:分离培养的细胞呈长梭形或多边形;细胞生长曲线呈S形;微丝免疫荧光染色结果显示,培养的骨髓间充质干细胞具有良好的细胞骨架系统.第3代骨髓间充质干细胞CD29、CD44、CD71、CD90均呈阳性表达,而CD13、CD34、CD45、CD133呈阴性.提示,经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学和细胞表面标志物表达方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为骨髓间充质干细胞,其第3代活性最佳,可用于后续实验.     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化

背景:骨髓中的间充质干细胞含量极少,每1×104～1×105个单核细胞中约有1个骨髓间充质干细胞,需要在体外分离、纯化、扩增后才能满足体内移植要求.目的:观察体外分离培养的骨髓间充质干细胞生物学特性及多向分化潜能.设计、时间及地点;细胞学体外观察,于2007-10/2008-12在福建医科大学附属协和医院泌尿外科研究室完成.材料:清洁级雄性近交系SD大鼠30只,由上海斯莱克实验动物有限公司提供.方法:通过全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,待细胞融合至80%～90%胰蛋白酶消化传代.取传至第3代细胞,分别向成骨、成脂方向诱导分化.主要观察指标:倒置相差显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测其表面标记,茜素红染色检测其成骨能力,油红O染色检测其成脂能力.结果:原代及传代的骨髓间充质干细胞均呈长梭形成纤维细胞样,连续传代10代以上,细胞始终保持旺盛的生长及扩增能力.第3代骨髓间充质干细胞CD90,CD44,CDl06均呈阳性表达,而CD34,CD45,CD11b呈阴性.成骨诱导21 d后,可见大量橘红色矿化结节形成.成脂诱导2周后,可见细胞的胞浆内出现大量红染脂滴. 结论:全骨髓贴壁培养法可大量分离纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能.     

不同来源骨髓间充质干细胞对CD34+细胞增殖的影响

背景:作者前期研究显示,银屑病患者与正常人骨髓间充质干细胞的生物学特性、免疫学反应及抗原提呈功能有明显差异,而与流产胎儿骨髓间充质干细胞无明显差异.目的:观察不同来源骨髓间充质干细胞对正常人骨髓CD34+细胞增殖的影响.方法:密度梯度离心法分离银屑病患者和流产胎儿骨髓单一核细胞并培养、传代,传至第2代72 h后收集培养上清液,流式细胞仪鉴定骨髓CD34+细胞及骨髓间充质干细胞纯度.倒置显微镜下观察培养细胞的生长状态,细胞磁珠分选仪分选出的正常人骨髓CD34+细胞加入骨髓间充质干细胞培养上清液培养24 h 后,四甲基偶氮唑盐比色法检测骨髓CD34+细胞的增殖活性.结果与结论:CD34+细胞加入银屑病患者和流产胎儿骨髓间充质干细胞培养上清培养24 h后,细胞形态无差别.银屑病患者和流产胎儿骨髓间充质干细胞培养上清液对正常人骨髓CD34+细胞增殖的影响差异无显著性意义(P > 0.05).     

体外扩增传代对骨髓间充质干细胞归巢相关因子的影响

背景：间充质干细胞移植后在体内的归巢能力,会随着供体细胞在体外的培养传代而下降,从而严重影响了间充质干细胞对靶组织的修复作用。
　　目的：探讨体外扩增传代对人骨髓来源间充质干细胞归巢相关因子的影响。
　　方法：应用 Ficol 密度梯度离心法将间充质干细胞自骨髓中分离出来,利用其贴壁生长的特性加以纯化,在常规培养条件下培养至第7代,观察原代及第3,5,7代细胞的形态学特点。采用MTT法检测第3,5,7代间充质干细胞的生长增殖特性,并绘制生长曲线。Real-time PCR法检测第3,5,7代间充质干细胞中归巢相关因子CXCR4、CXCR6、CXCL12(SDF-1)、CD44的表达,以2-△△Ct计算各代细胞目的基因的相对表达量,比较不同代次间充质干细胞中各细胞归巢因子表达的差异。
　　结果与结论：采用密度梯度离心法自骨髓获得单个核细胞,将其贴壁培养传至第3代,可获得纯度较高的间充质干细胞。其在体外的增殖能力较强,但随着传代扩增次数增加,形态从细长梭形逐渐缩短变宽,增殖速率、总体扩增倍数以及CXCR4、CXCR6、CXCL12、CD44等细胞归巢因子的表达亦随传代培养而呈下降趋势。结果显示,间充质干细胞的归巢能力随扩增传代而逐渐下降,其机制可能与CXCR4、CXCR6、CXCL12、CD44等归巢相关因子在间充质干细胞中的表达水平下降有关。     

人胎盘源与人骨髓源间充质干细胞的生物学性状比较

背景:人骨髓源间充质干细胞具有很好的临床应用价值,但数量和取材都有限,而人胎盘源间充质干细胞则相反,目前已成为再生医学的重要细胞来源和最具临床应用前景的功能干细胞.目的:比较人胎盘源间充质干细胞和人骨髓源间充质干细胞体外分离培养、扩增及生物学性状的差异.方法:采用胶原酶消化法分离人胎盘组织,密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,分别加入体积分数10%胎牛血清的LG-DMEM 培养液,待细胞汇合至90%后消化传代.分别取第3代的人胎盘和骨髓间充质干细胞,按1×106 浓度接种,当细胞达70%~80%融合时,换成成脂细胞诱导分化培养液,诱导16 d.结果与结论:胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞均成贴壁生长、形态均一的成纤维样细胞梭形外观,但后者体积略小.两种细胞均高表达CD29、CD44,不表达CD34、CD106.二者均可分化为脂肪细胞.可见,从胎盘和骨髓中培养出的间充质干细胞在细胞形态、生长特性等方面基本相似,在体外均可有效扩增并成脂肪分化,均可作为组织工程的另一成体干细胞来源,而胎盘源间充质干细胞具有更好的应用前景.     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

背景：培养出生长状态良好、数量足够多的大鼠骨髓间充质干细胞是其作为种子细胞在组织工程等领域广泛应用的重要前提。目的：寻求快捷有效的大鼠骨髓间充质干细胞体外培养条件,观察培养的间充质干细胞生物学特性。方法：全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,免疫荧光分析细胞骨架,MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测其表面标记。结果与结论：分离培养的细胞呈长梭形或多边形;细胞生长曲线呈S形;微丝免疫荧光染色结果显示,培养的骨髓间充质干细胞具有良好的细胞骨架系统。第3代骨髓间充质干细胞CD29、CD44、CD71、CD90均呈阳性表达,而CD13、CD34、CD45、CD133呈阴性。提示,经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学和细胞表面标志物表达方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为骨髓间充质干细胞,其第3代活性最佳,可用于后续实验。     

P53-P21蛋白通路对5-氮杂胞苷诱导的大鼠骨髓间充质干细胞增殖和凋亡的影响

背景:5-氮杂胞苷是诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的有效化学试剂.目的:观察P53特异性抑制剂PFT-α阻断P53-P21蛋白通路对5-氮杂胞苷诱导的大鼠骨髓间充质干细胞增殖和凋亡的影响.方法:分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代细胞分为4组,即正常对照组、5-氮杂胞苷组、PFT-α组、PFT-α+5-氮杂胞苷组.观察骨髓间充质干细胞培养传代过程中细胞形态变化,应用流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞表面抗原,MTT法测定诱导后各组骨髓间充质干细胞增殖能力,以流式细胞仪检测诱导后各组细胞凋亡率,采用Western blot法测定诱导后P53、P21蛋白表达情况.结果与结论:原代培养的骨髓间充质干细胞2周形成集落,传代细胞体积变大,呈长梭形,排列趋一致.骨髓间充质干细胞表面抗原CD44,CD45阳性表达率分别为(89.98±1.29)%,(2.14±0.22)%.MTT结果显示,当PFT-α浓度≤20 μmol/L时,对骨髓间充质干细胞的增殖有一定促进作用;而当其浓度达到40 μmol/L时,PFT-α则可明显抑制骨髓间充质干细胞的增殖.培养第5,7天时,与其他3组比较,5-氮杂胞苷组对骨髓间充质干细胞增殖表现出明显抑制(P < 0.01).流式细胞仪结果显示,5-氮杂胞苷组骨髓间充质干细胞凋亡率显著高于其他3组(P < 0.01).Western blot结果显示,各组均有P53、P21蛋白的表达,以5-氮杂胞苷组表达量明显增多.提示通过P53特异性抑制剂PFT-α阻断P53-P21蛋白通路,能显著减少5-氮杂胞苷诱导的骨髓间充质干细胞的凋亡,促进5-氮杂胞苷诱导的骨髓间充质干细胞增殖.     

长期培养人脐带间充质干细胞的生物活性及其限制性

背景:间充质干细胞具有多向分化能力、免疫调节能力,并可在体外进行长期培养扩增,但其体外长期培养的生物学活性变化特点及其限制性仍不十分清晰。目的:观察体外长期培养人脐带间充质干细胞的生物活性变化特点及其限制性。方法:无菌收集剖宫产新生儿脐带,经胶原酶Ⅱ消化后,用黏附生长选择法获取人脐带间充质干细胞,胰酶消化传代;取第3代细胞进行流式分析,脂肪和成骨诱导鉴定;收集不同代的细胞分别用MTT法、流式细胞仪和爬片分析法检测细胞增殖活性、细胞周期、凋亡率及黏附能力。结果与结论:人脐带间充质干细胞的细胞表型CD105+/CD29+/CD44+/CD31-/CD34-/CD45-/HLADR-,可诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞;传代培养第3～23代细胞形态无明显变化,生长曲线基本一致,第28代后细胞增长缓慢;流式分析发现第33代细胞较第3代G0/G1减少17.9%、S+G2/M增加103.4%、细胞凋亡率增加316.7%,差异均有显著性意义(P<0.01),第3～18代细胞间G0/G1、S+G2/M、细胞凋亡率和黏附细胞数差异均无显著性意义(P>0.05)。提示在体外长期培养环境中,随着传代次数的递增,人脐带间充质干细胞的增殖及黏附能力下降,细胞凋亡率增加,总的生物活性呈逐渐下降趋势,其最佳生物活性期出现在培养第3～18代之间。     

大鼠骨髓间充质干细胞分离与培养：第3代细胞增殖快纯度高

背景：进行组织工程研究的首要环节是培养出大量生物活性好、增殖速度快、细胞纯度高的种子细胞。目的：分析全骨髓贴壁法培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性。方法：采用全骨髓贴壁法分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞,绘制第3代细胞生长曲线,观察各代细胞形态学变化,流式细胞分析法测定第2代、第3代细胞表面标志物（CD29、CD90、CD34、CD45）的表达。结果与结论：经全骨髓贴壁法培养3代以内骨髓间充质干细胞均具有典型成纤维样细胞形态而且贴壁生长;第2代骨髓间充质干细胞表型CD29、CD90、CD34、CD45表达分别为91.5%,96.2%,1.3%,8.0%,第3代骨髓间充质干细胞分别为98.2%,98.1%,0.6%,2.0%;细胞生长曲线结果表明,以细胞浓度8×107L-1接种,细胞增殖速度快,获得的细胞总数多。综合形态学及细胞鉴定结果,第3代大鼠骨髓间充质干细胞活性好、增殖速度快、细胞纯度高,适合作为组织工程研究的种子细胞。     

兔下颌骨来源骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学特性

背景：以往研究表明骨髓间充质干细胞的获取来源主要是股骨或髂骨,但下颌骨来源骨髓间充质干细胞的研究至今少有报道。目的：观察兔下颌骨来源的骨髓间充质干细胞体外分离、培养及其生物学特性。方法：体外分离培养兔下颌骨骨髓间充质干细胞,取第2或3代检测。MTT法检测细胞增殖,克隆形成试验检测细胞的克隆形成率变化,并对其进行成骨和成脂肪诱导分化。结果与结论：MTT法检测细胞增殖,细胞生长曲线显示下颌骨骨髓间充质干细胞经历潜伏期、对数生长期和平台期。细胞克隆形成实验显示,细胞呈成纤维集落形成单位外观。茜素红、油红O染色结果显示,成骨诱导、成脂诱导后形成钙结节及脂滴。结果证实,兔下颌骨分离出的骨髓间充质干细胞有强大的自我复制及增殖能力,具有多向诱导分化的潜能。     

胎盘间充质干细胞传代后的增殖能力

背景：胎盘间充质干细胞的增殖能力比骨髓间充质干细胞增殖能力强,但是否每个代次胎盘间充质干细胞的增殖能力都相同尚无定论。目的：分析不同代次胎盘间充质干细胞的增殖能力。方法：采用酶消化法分离人胎盘间充质干细胞,并利用流式细胞仪检测干细胞表面标志物,并进行成脂成骨诱导分化。采用细胞计数和BrdU方法检测细胞的增殖能力,根据倍增时间公式计算倍增时间,并进行长期传代。结果与结论：胎盘间充质干细胞阳性表达CD44、CD90和CDl05,阴性表达CDl4、CD34和CD45;成脂诱导21d后油红O染色镜下可见红色脂肪滴,成骨诱导35d茜素红染色镜下可见钙盐结节。细胞从第1代开始计数,直到第15代共获得3．5×10^11个细胞。P5代比P10和P15代胎盘间充质干细胞的增殖能力强,倍增时间短。长期传代,胎盘间充质干细胞传代到第25代时,其中3例标本细胞形态完全发生改变,呈铺路石样;另外2例标本几乎无贴壁细胞。提示胎盘间充质干细胞可以长期传代到第25代,不同代次的胎盘间充质干细胞增殖能力不同,P5代增殖能力明显高于P10和P15代,临床应用应以P5代之前为宜。     

体外培养人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化及表皮细胞角蛋白的表达

背景:动物实验已经证实骨髓间充质干细胞体外诱导可分化为表皮细胞.目的:观察体外培养条件下人骨髓间充质干细胞向表皮细胞的分化及表皮细胞角蛋白表达.方法:采用Ficoll-Paque密度梯度离心法提取人胚胎骨髓间充质干细胞,以免疫细胞化学及流式细胞仪测定细胞表面CD33、CD34标记物进行鉴定.取第3代骨髓间充质干细胞以30%条件培养基诱导其向表皮细胞分化,免疫细胞化学染色观察诱导后细胞形态与细胞角蛋白水平变化.结果与结论:采用密度梯度离心法从人胚胎骨髓中分离培养得到细胞成分均一的骨髓间充质干细胞.骨髓间充质干细胞经体外诱导后,出现细胞角蛋白19表达阳性细胞,说明骨髓间充质干细胞在体外诱导后可能发生向表皮细胞分化.     

引产儿与正常成人骨髓间充质干细胞的比较

背景：骨髓间充质干细胞是多能干细胞,同时可参与免疫调节反应,而成人及引产胎儿骨髓均是间充质干细胞的重要来源。目的：通过引产儿与正常成人骨髓间充质干细胞的细胞形态、免疫表型、增殖活性及分泌细胞因子的比较,揭示二者生物学特点的差异。方法：采用密度梯度离心法分离引产儿与正常成人骨髓单个核细胞,通过贴壁法培养骨髓间充质干细胞,收集传3代后的骨髓间充质干细胞,流式细胞术鉴定其免疫表型、MTT比色法检测其增殖活性以及用ELISA法检测细胞培养上清液中白细胞介素6、血小板源性生长因子和表皮生长因子的水平。结果与结论：引产儿组和正常成人组骨髓间充质干细胞形态相似、表型相同,分泌细胞因子水平无显著差异,但引产儿细胞增殖活性显著高于正常成人。提示引产儿与正常成人骨髓间充质干细胞除增殖活性有差异外,其余生物学特点相似,引产儿可以为间充质干细胞研究提供新的骨髓来源。     

DNA去甲基化对大鼠骨髓间充质干细胞增殖细胞核抗原的调节

背景：DNA去甲基化是一种重要的表观遗传修饰。目的：观察DNA去甲基化对骨髓间充质干细胞增殖及增殖细胞核抗原蛋白表达的影响。方法：全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,免疫组化法鉴定骨髓间充质干细胞CD44和CD45蛋白的表达,MTT法检测5-杂氮胞苷对骨髓间充质干细胞增殖的影响,免疫组化法检测5-杂氮胞苷对骨髓间充质干细胞增殖细胞核抗原蛋白表达的影响。结果与结论：①第3代骨髓间充质干细胞不表达或低表达CD45,高表达CD44。②与未加入5-杂氮胞苷组比较,5-杂氮胞苷干预48h,6,12,24μmol/L组显著促进细胞增殖活性（P〈0.05）,无浓度依赖性。③与未加入5-杂氮胞苷组比较,5-杂氮胞苷干预48h,6,12,24μmol/L组增殖细胞核抗原蛋白积分吸光度值显著增加（P〈0.05）,组间差异无显著性意义。结果显示在一定浓度范围内,5-杂氮胞苷发挥去甲基化作用,激活增殖细胞核抗原蛋白表达,从而促进骨髓间充质干细胞增殖。     

多发性骨髓瘤骨髓间充质干细胞生物学特性分析

为了研究多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）病人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）的病理生物学特性，以探讨MSC在MM骨损伤发生中的作用，取11例初治MM病人和5例正常人骨髓，用贴壁法体外分离培养MSC。应用流式细胞术分析MM骨髓MSC表型，MTT法检测MSC增殖能力，组织化学染色测定细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化能力。应用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定细胞培养上清液中白介素-6（interleukin-6，IL-6）和干细胞生长因子（stem cell factor，SCF）浓度。收集MSC培养上清作为条件培养液，按梯度浓度加入人SKO007骨髓瘤细胞系培养体系中，MTT法测定细胞增殖能力差异。结果表明：与正常人骨髓MSC比较，MM患者骨髓MSC的表型无改变，均一表达CD29、CD73、CD166和HLA-ABC，不表达CD45和CD31；MM患者骨髓MSC增殖和分化能力正常，且具有相似的成骨和成脂肪分化功能；MM骨髓MSC分泌IL-6和SCF的水平均明显高于正常；MM来源的MSC培养上清显著促进SKO007细胞的增殖。结论：MM患者骨髓MSC的增殖分化功能正常，MM时骨损伤可能与MSC分化功能无关，而IL-6和SCF高表达为骨髓瘤细胞提供了必要的生存信号。     

全骨髓贴壁接触培养SD大鼠骨髓间充质干细胞

背景：体外分离培养出生长状态好、高纯度、增殖能力强和数量充足的大鼠骨髓间充质干细胞,是将其作为种子细胞用于组织和细胞移植的重要前提。 目的：建立简便、快速、有效的SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养方法,并观察其生物学特性。 方法：采用全骨髓法将 SD 大鼠双侧股骨和胫骨骨髓细胞进行体外分离培养,贴壁接种法进行细胞纯化、传代。观察细胞生长形态及特征,绘制细胞生长曲线,检测细胞表面标记物,采用体外诱导剂诱导细胞分别向成骨、成软骨、成脂方向分化。 结果与结论：全骨髓贴壁接种法分离培养的骨髓间充质干细胞生长旺盛、纯度高,细胞生长形态呈长梭形,极性排列,细胞生长呈S形生长曲线,群体倍增时间为29 h,细胞在连续传10代后仍具有较强的增殖能力。第3代骨髓间充质干细胞的表面标记物CD44、CD29、CD90均呈阳性表达,CD45、CD34、CD11b则呈阴性表达。第3代骨髓间充质干细胞分别经成骨、成软骨、成脂诱导剂诱导后,茜素红染色、碱性磷酸酶染色、von-kossa矿化结节染色、甲苯胺蓝染色和油红O染色均呈阳性。结果验证全骨髓贴壁接种法是一种简便可靠的体外分离培养方法,能获得纯度较高的骨髓间充质干细胞,经实验鉴定第3代骨髓间充质干细胞生物活性最佳,且具有多向诱导分化能力,适合作为后续实验的种子细胞。     

全骨髓细胞贴壁法分离与培养大鼠骨髓间充质干细胞的多向分化能力

背景：分离培养纯度较高的骨髓间充质干细胞是对其进行深入研究的前提。目的：观察全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特征。方法：选取体质量为80-100g雄性SD大鼠,采用全骨髓细胞贴壁培养法获取骨髓间充质干细胞。在取材过程中需严格掌握大鼠处死至将细胞悬液放入培养箱内的时间,一般控制在40min以内。使用基础培养基冲洗骨髓腔时力度适中且在骨髓腔内旋转数次,可使骨髓细胞充分脱落,保证骨髓细胞的获得量。结果与结论：原代骨髓间充质干细胞为贴壁生长的成纤维样细胞,传代后的细胞形态均一,呈漩涡状排列;第3代骨髓间充质干细胞的生长曲线呈S形,经历3个生长时期：潜伏期、对数生长期和停滞期;流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面抗原结果示：CD29＋99.45%、CD34＋1.45%、CD44＋99.52%、CD45＋1.41%;成骨、成脂诱导分化后,矿化结节被茜素红染成橘红色,脂滴被油红O染成红色。说明骨髓间充质干细胞能向成骨、成脂分化,具有多向分化潜能,符合国际细胞治疗学会间充质及组织干细胞委员会提出的鉴定动物来源骨髓间充质干细胞的最低标准。     

人骨髓间充质干细胞体外扩增的生物学评估

本研究旨在对骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）进行移植前增殖分化能力测定，病毒学检查，核型分析，PCR-STR和甩A的检测，以便为临床应用提供安全、可靠的移植细胞。采用贴壁法分离骨髓MSC，在相同条件下分别考察各代细胞形态、生长、表面标记、成骨、成脂分化能力的变化情况，并进行不同生长时期的核型分析，利用札A—SBT技术检测4个不同供者来源的MSC的HLA-I和HLA—II位点的高分辨分型；应用PCR—STR技术检测4个不同供者来源的MSC基因遗传标记。并且利用ELISA方法检测HIV，HBV，HCV和TP，使用PCR方法检测支原体污染。结果表明：随着传代次数增加，MSC的增殖能力、成骨能力均有所下降。在扩增过程中，MSC始终保持较高的纯度，CD29、CD44、CD105、CD166、CD73均表达阳性，CD14、CD34、CD45、CD80和CD86均表达阴性。在8代以前未发现核型变异。4个不同供者来源的MSC的札A高分辨分型和STR基因分型结果为MSC3的TP表达阳性，MSC2在5代出现支原体污染。结论：在体外培养过程中MSC干细胞特性逐渐丢失，其中向成骨方向的分化潜能降低。MSC在8代以前可作为实验研究及临床应用的良好对象。