超低温冰箱转液氮阶梯降温法与传统程序降温法保存造血干细胞的比较

背景:在造血干细胞整个冷冻保存过程中,受到降温速率、储存温度深浅、冷冻保护剂组合等因素影响,各国学者在提倡选择何种保存方法上面存在不同的主张。目的:比较-80℃低温冰箱转液氮阶梯降温法与传统程序降温法保存外周造血干细胞的效果。方法:将采集的造血干细胞分两组,第一组细胞浓度为1×1011L-1,加入10%二甲基亚砜,放入程序冷冻仪内程序设置为室温至-4℃按1℃/min的速率降温,按35℃/min快速降至-45℃,再以15℃/min升至-21℃,然后以5℃/min降至-90℃,取出冷冻管置-196℃液氮罐内。第二组细胞浓度为1×1011L-1,加入5%二甲基亚砜、3%羟乙基淀粉、4%人血白蛋白,将冷冻管置-80℃冰箱过夜后取出,置-196℃液氮罐内的气相,再过夜后置液氮罐液相内。结果与结论:两组冷冻方法保存细胞的锥虫蓝拒染率、回收率、凋亡率和死亡率差异无显著性意义(P>0.05)。结果显示用5%二甲基亚砜、4%白蛋白、3%羟乙基淀粉组成的冷冻保护剂,通过-80℃低温冰箱转液氮阶梯降温法冷冻保存造血干细胞与传统10%二甲基亚砜作为冷冻保护剂用程序降温的方法取得一样效果,操作简便易于临床应用。     

超低温冰箱转液氮阶梯降温法与传统程序降温法保存造血干细胞的比较

背景：在造血干细胞整个冷冻保存过程中,受到降温速率、储存温度深浅、冷冻保护剂组合等因素影响,各国学者在提倡选择何种保存方法上面存在不同的主张。目的：比较-80℃低温冰箱转液氮阶梯降温法与传统程序降温法保存外周造血干细胞的效果。方法：将采集的造血干细胞分两组,第一组细胞浓度为1×1011L-1,加入10%二甲基亚砜,放入程序冷冻仪内程序设置为室温至-4℃按1℃/min的速率降温,按35℃/min快速降至-45℃,再以15℃/min升至-21℃,然后以5℃/min降至-90℃,取出冷冻管置-196℃液氮罐内。第二组细胞浓度为1×1011L-1,加入5%二甲基亚砜、3%羟乙基淀粉、4%人血白蛋白,将冷冻管置-80℃冰箱过夜后取出,置-196℃液氮罐内的气相,再过夜后置液氮罐液相内。结果与结论：两组冷冻方法保存细胞的锥虫蓝拒染率、回收率、凋亡率和死亡率差异无显著性意义（P〉0.05）。结果显示用5%二甲基亚砜、4%白蛋白、3%羟乙基淀粉组成的冷冻保护剂,通过-80℃低温冰箱转液氮阶梯降温法冷冻保存造血干细胞与传统10%二甲基亚砜作为冷冻保护剂用程序降温的方法取得一样效果,操作简便易于临床应用。     

不同冷冻保护剂对低温冰箱转液氮阶梯降温冷冻保存造血干细胞效果的影响

背景：非程序降温-80℃低温冰箱保存方便快捷,程序降温-196℃液氮保存可靠长久,将两者合二为一简化流程已成功用于临床。目的：观察不同冷冻保护剂对-80℃低温冰箱转液氮阶梯降温冷冻保存造血干细胞效果的影响。方法：分设10%二甲亚砜组、5%二甲亚砜联合3%羟乙基淀粉组、5%二甲亚砜联合0.25mol/L海藻糖组、5%二甲亚砜联合3%羟乙基淀粉及0.25mol/L海藻糖组。采用-80℃低温冰箱转液氮阶梯降温法对单采外周造血干细胞进行冷冻保存,通过透射电镜观察细胞超微结构变化,流式细胞仪观察Annexin-V、PI、Caspase-3水平。结果与结论：4组冷冻保存细胞的存活率、凋亡率和死亡率差异均无显著性意义（P〉0.05）。透射电镜下各组细胞超微结构变化差异不明显。单个核细胞群落冷冻保存后存活率在90%以上,含成熟细胞较多的CD45＋细胞群落凋亡发生率可达50%左右。造血干祖细胞群落中,早期细胞较晚期细胞更能耐受冷冻损伤。提示在基础冷冻保护剂二甲亚砜的基础上,加入羟乙基淀粉和海藻糖并未显示出对冷冻保存效果的增强作用。     

不同冷冻保护剂对低温冰箱转液氮阶梯降温冷冻保存造血干细胞效果的影响

背景:非程序降温-80 ℃低温冰箱保存方便快捷,程序降温-196 ℃液氮保存可靠长久,将两者合二为一简化流程已成功用于临床.目的:观察不同冷冻保护剂对-80 ℃低温冰箱转液氮阶梯降温冷冻保存造血干细胞效果的影响.方法:分设10%二甲亚砜组、5%二甲亚砜联合3%羟乙基淀粉组、5%二甲亚砜联合0.25 mol/L海藻糖组、5%二甲亚砜联合3%羟乙基淀粉及0.25 mol/L海藻糖组.采用 -80 ℃低温冰箱转液氮阶梯降温法对单采外周造血干细胞进行冷冻保存,通过透射电镜观察细胞超微结构变化,流式细胞仪观察Annexin-V、PI、Caspase-3水平.结果与结论:4组冷冻保存细胞的存活率、凋亡率和死亡率差异均无显著性意义(P > 0.05).透射电镜下各组细胞超微结构变化差异不明显.单个核细胞群落冷冻保存后存活率在90%以上,含成熟细胞较多的CD45+细胞群落凋亡发生率可达50%左右.造血干祖细胞群落中,早期细胞较晚期细胞更能耐受冷冻损伤.提示在基础冷冻保护剂二甲亚砜的基础上,加入羟乙基淀粉和海藻糖并未显示出对冷冻保存效果的增强作用.     

阶梯降温冷冻保存的自体外周血造血干细胞移植的临床研究

目的:观察低温冰箱转液氮阶梯降温冷冻保存的自体外周血造血干细胞移植治疗恶性血液病的效果,并分析造血干细胞移植后患者生存情况。方法:使用3%羟乙基淀粉、4%白蛋白和5%二甲亚砜(DMSO)组成的冷冻保护剂保护自体造血干细胞,后置于-80℃低温冰箱,再置-196℃液氮罐长期储存,然后用于自体移植。2002年1月至2016年12月98例恶性血液病患者,其中包括急性淋巴细胞白血病10例,非急性髓系白血病24例,多发性骨髓瘤11例,恶性淋巴瘤53例的自体移植。对患者造血恢复时间、总生存率(overall survival,OS)、无进展生存率(progression-free survival,PFS)进行了统计分析。结果:除1例因颅内出血死亡未成功植入外,余97例患者均获得造血重建。中性粒细胞计数≥0.5×10~9/L所需时间平均为9.24±1.89 d,连续3 d不输血小板且血小板≥20×10~9/L所需时间平均为11.04±1.84 d。中位生存时间为47.6 (1-80)个月。1、3和5年总生存率分别为(97.2±1.9)%、(84.2±4.6)%和(77.8±5.6)%。3和5年PFS分别为(74.4±5.1)%和(61.2±6.2)%。结论:通过低温冰箱转液氮阶梯降温法冷冻保存造血干细胞自体移植,可以达到和传统的程序降温冷冻保存法一样的临床移植效果,且移植后并发症发生率无增多。     

阶段降温冷冻保存淋巴瘤患者自体造血干细胞临床应用观察

目的探讨阶段降温对外周血干细胞活性和临床应用的影响。方法应用自体血浆40%,CPD20%、DMSO终浓度为10%作为冷冻保护剂冷冻自体造血干细胞,-86℃过夜,转到-196℃液氮中保存至使用前,冷冻前后计数活细胞数、CD34+细胞比例和细胞计数,并计算回收率;同时评价回输后干细胞植活时间。结果共对18名患者的31份自体干细胞进行了深低温冷冻保存,解冻后活细胞数为(75.47±15.57)%(58%-95%)、CD34细胞回收率80.28%±24.37%(62%-92%)。回输后的干细胞全部植活,其中白细胞植活的时间为(13.8±3.85)d(9-22d),血小板植活的时间为(22.4±4.79)d(11-25d)。结论应用的阶段降温法可能造成的细胞丢失,但是28份回输患者植活证明,对于不具备程序降温设备的情况采用阶段降温法保存造血干细胞是可行的。     

骨髓单个核细胞－80℃保存

骨髓单个核细胞－８０℃保存范华骅马庆柏乃庆秦兰娣骨髓细胞的体外长期保存一般采用１０％二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）低温保护剂，程序降温后贮存在液氮中，这种方法需要程序降温仪、液氮罐等价格昂贵的低温保存设备，且比较复杂、费时。自８０年代后，国外开始尝试用新型的...     

骨髓细胞液氮长期冻存后间充质干细胞活力研究

目的研究骨髓细胞(BMC)液氮长期冻存后间充质干细胞(MSC)活力。方法从98人份经加低温保护剂、程控降温仪降温、液氮冻存23—25年的BMC中,取20人份复温,复温BMC体外行MSC初始和传代培养,传代细胞再行成骨和神经细胞诱导。检测培养全过程细胞的形态、增殖数量、细胞化学、免疫组化染色和抗原表达,计贴壁细胞回收率、相对增殖率和MSC相对回收率。结果 BMC冻存细胞,初始培养d10时旋涡状生长,d14时成纤维样细胞为(88.2±4.3)%;P1—P5传代培养时,d7旋涡状生长,传至P5时细胞扩增>60倍;P3时,成纤维样细胞为(94.7±3.6)%,细胞高表达CD29、CD90、CD44、CD71、CD73、CD105、CD166和HLA-A/B/C,低表达CD34、CD45和HLA-DR。P3细胞成骨诱导后ALP和茜素红染色强阳性,细胞内ALP含量明显增高;P3细胞神经细胞诱导后神经元烯醇化酶和巢蛋白染色阳性。细胞增殖和周期未发生改变。贴壁细胞回收率、相对增殖率和MSC相对回收率的结果分别为(52.1±5.6)%、(98.1±1.1)%和(48.5±8.6)%。结论用传统降温、液氮冻存骨髓细胞,至少在23—25年时,细胞内MSC性质不变、活力良好,达到了长期冻存的目的 。     

-80℃条件下不同时间外周血干细胞冻存效果的观察

目的 观察外周血干细胞在-80℃条件下保存时间与细胞活性的关系.方法 采用一种简便的-80℃干细胞冻存方法,其干细胞保护剂终浓度为5%二甲基亚砜(DMSO),3%羟乙基淀粉(HES)和4%人血白蛋白(HAS),不经程序降温,直接-80℃冰箱冻存,并调整细胞浓度为(2～4)×107/mL,分别对冻存1、3、6、9、12个月干细胞活性进行检测,观察台盼蓝拒染率和MNC、CD34+细胞的回收率.结果 干细胞活性在12个月内均无明显下降,其台盼蓝拒染率和MNC、CD34+ 细胞的回收率都在80%以上.不同时间冻存的干细胞活性比较无明显统计学差异(P＞0.05).结论 5% DMSO、3% HES 和4% HAS作为干细胞冷冻保护剂直接在-80℃冰箱冻存外周血干细胞的方法能有效地保护外周血干细胞活性.     

以二甲亚砜及羟乙基淀粉为保护剂冻存骨髓细胞

采用二甲亚砜(Me_2SO)及羟乙基淀粉(HES)联合冷冻保护骨髓细胞,-80℃冰箱降温,液氮储存,其有核细胞计数,台盼蓝柜染率及CFU—GM回收率与采用传统冻存法相似。该法冻存的骨髓细胞回输后病人临床副仅应轻,并能加快高剂量治疗后其造血功能的恢复。     

冷冻预处理温度对胎兔许旺细胞活性的影响

背景：许旺细胞作为周围神经损伤修复的重要桥接材料,其活性对临床修复周围神经损伤成功与否具有重要影响。目的：观察不同维持温度冷冻预处理超深低温保存对胎兔许旺细胞活性的影响。方法：设计胎兔许旺细胞冷冻维持温度为-30～-70℃,每间隔-5℃为一组,以10%二甲基亚砜为低温保护剂,对胎兔许旺细胞进行上述温度冷冻预处理,液氮中保存48h,快速复温后继续培养48h,透射电镜观察细胞超微结构改变,MTT法和3H-TdR掺入法检测细胞活性。结果与结论：透射电镜下见-45℃处理的细胞超微结构良好,其余各温度组细胞均出现细胞器肿胀、坏死等轻重不同的冷冻损伤表现。MTT法和3H-TdR检测结果均显示-45℃冷冻预处理对许旺细胞的生长抑制率最低,分别为（3.83±0.56）%、（4.41±0.71）%,和其余各温度组之间相比,差异有显著性意义（P〈0.05）。提示-45℃是胎兔许旺细胞冷冻预处理的最佳维持温度值,对细胞活性影响最小,可较好保持其生物学活性。     

冰冻血小板制备研究

[目的]探讨冰冻单采血小板制备的可行性,为其临床应用提供可靠依据.[方法]通过认真选择献血员,单采血小板,并对40袋新鲜血小板进行计数等质控,用二甲基亚砜（DMSO）作冰冻保护剂,-80℃深低温保存1年内,解冻后观察外观,分别进行计数、计算回收率、测定PH值、粘附率、无菌试验,并且与新鲜血小板进行比较.[结果]-80℃保存冰冻单采血小板1年内血小板计数、pH值、粘附率与冻前新鲜血小板进行比较差异无显著性（P〉0.05）;血小板平均体积、血小板体积分布宽度冰冻前后差异有显著性（P〈0.01）,保存1年内平均回收率为90.49% , 无菌实验无细菌生长.[结论]-80℃深低温保存冰冻血小板质量达到标准要求,可以应用于临床.     

吉西他滨对慢性粒细胞白血病患者骨髓细胞G-CSFR及bcr/abl mRNA的影响

为了观察吉西他滨对慢性粒细胞白血病(CML)患者骨髓粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)及bcr/ablmRNA的作用,收集CML慢性期、急变期患者的及骨髓象正常的非血液病患者骨髓液,分为吉西他滨组(加入吉西他滨,调整浓度为10μg/ml)和对照组,培养48小时后收集细胞。采用流式细胞术检测各组标本骨髓G-CSFR的表达率;采用RT-PCR技术检测各组标本bcr/abl mRNA的表达。结果表明:吉西他滨组CML慢性期、急变期患者及骨髓象正常者骨髓G-CSFR的表达率分别为(50.72±8.57)%、(36.32±4.25)%和(59.42±7.62)%。对照组CML慢性期、急变期患者及骨髓象正常者骨髓粒系G-CSFR的表达率分别为(45.42±6.52)%、(30.58±5.68)%和(58.56±5.54)%。两组CML患者骨髓G-CSFR的表达率分别与骨髓象正常组比较,差异有显著性(p0.05),CML慢性期患者与急变期比较,差异有显著性(p0.05)。吉西他滨组CML患者G-CSFR的表达率与未加药组相应组别比较,差异有显著性(p0.05)。吉西他滨组CML慢性期、急变期患者bcr/abl mRNA表达水平比较,差异无显著性(p0.05)。吉西他滨组与对照组、CML慢性期、急变期患者G-CSFR表达率与bcr/abl mRNA表达水平呈负相关(p0.05)。结论:在体外培养下,吉西他滨可以提高CML慢性期、急变期患者骨髓G-CSFR的表达率,对bcr/abl mRNA表达的作用不明显,CML慢性期、急变期患者G-CSFR表达率与bcr/abl mRNA表达水平呈负相关。     

血浆制备时间和速冻方法对冷沉淀凝血因子质量的影响

目的探讨新鲜血浆的制备时间和速冻方法对冷沉淀凝血因子质量的影响,选择合适的制备时间和速冻方法。方法随机抽取制备时间分别为2 h、4 h、6 h、8 h新鲜血浆各16人(份),采用无菌接驳机平均分为A、B两实验组,分别用平板速冻机和传统低温冰箱速冻制备新鲜冰冻血浆(FFP);在相同条件下分别对两组FFP制备冷沉淀;采用凝固法检测两组冷沉淀的凝血因子Ⅷ(FⅧ)和纤维蛋白原(Fg)。结果血浆制备时间为2 h、4 h、6 h、8 h的冷沉淀FⅧ活性(IU)A组分别为78.40±22.87、74.06±23.72、71.25±19.93、70.53±18.84,B组分别为66.60±17.12、58.08±18.19、52.57±12.26、51.19±12.51。A、B组冷沉淀FⅧ随着制备时间的延长,均呈下降趋势,相同制备时相A与B组比较均有统计学差异(P<0.05);A组FⅧ活性4个制备时相间比较差异无统计学意义(P>0.05),B组2 h与6 h、8 h比较差异均有统计学差异(P<0.05)。血浆制备时间为2 h、4 h、6 h、8 h的冷沉淀中Fg含量(mg)A组分别为114.53±24.76、117.62±27.61、114.44±22.84、120.23±26.48,B组分别为113.36±23.53、116.43±25.38、115.28±23.66、117.92±25.58,Fg含量在不同制备时间和速冻方法条件均无统计学差异。结论 8 h内制备血浆2种速冻方法均能满足冷沉淀质量要求,平板式速冻机制备血浆的冷沉淀FⅧ活性显著性高于传统低温冰箱。     

糖尿病对骨髓干细胞血管新生潜能的影响

目的研究糖尿病对骨髓干细胞产生血管生长因子的能力以及向内皮细胞分化能力的影响。方法从糖尿病肥胖大鼠（实验组）和非糖尿病健康大鼠（对照组）各20只分离采集骨髓干细胞进行培养,并检测培养后骨髓干细胞的生存率、培养液中血管内皮细胞生长因子（VEGF）的浓度、以及骨髓干细胞向内皮细胞的分化率。结果实验组经培养3d后骨髓干细胞的生成率为（30.1±2.4）%,与对照组（31.9±3.8）%相比,无显著性差异（P〉0.05）;实验组经培养7d后骨髓干细胞的生成率为（18.5±3.1）%,与对照组（20.4±1.9）%相比,无显著性差异（P〉0.05）。实验组经培养3d后培养基上清液中VEGF的浓度（134.8±27.5）ng.mL^-1显著低于对照组（189.1±25.6）ng.mL^-1（P〈0.01）;实验组经培养7d后培养基上清液中VEGF的浓度为（282.7±25.2）ng.mL^-1,显著低于对照组（370.2±40.1）ng.mL^-1（P〈0.01）。实验组经培养7d后骨髓干细胞的内皮细胞分化率为（14.7±4.5）%,显著低于对照组（32.8±5.6）%（P〈0.01）。结论糖尿病可以导致骨髓干细胞产生血管生长因子的能力下降以及向内皮细胞分化的能力受损,这将可能导致用自身骨髓干细胞诱导血管新生的能力降低。     

Effects of the temperature, the duration of frozen storage, and the freezing container on in vitro measurements in human peripheral blood mononuclear cells

Background: Bone marrow, peripheral blood, and umbilical cord blood have been used to prepare autologous and allogeneic pluripotential mononuclear cells for use in the repopulation of bone marrow. Study Design and Methods: The purpose of this study was to evaluate how the temperature and duration of frozen storage of human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), as well as the freezing container, affected the in vitro recovery and viability of the mononuclear cells and their growth in colony-forming unit-granulocytic-erythroid-monocytic- megakaryocytic (CFU-GEMM) tissue culture assay. PBMCs were isolated from ficoll-hypaque-treated cellular residue obtained during the plateletpheresis of blood from 15 healthy donors. The PBMCs were treated with dimethyl sulfoxide (DMSO) to achieve a final DMSO concentration of 10 percent. Each unit was then separated into six aliquots: one stored in a polyvinylchloride (PVC) plastic bag, one in a polyolefin plastic bag, and four in polyethylene cryostorage vials. Each aliquot was frozen in a -80 degrees C mechanical freezer at a freezing rate of 2 to 4 degrees C per minute. The frozen PBMCs in PVC bags were stored in a -80 degrees C mechanical freezer and those in polyolefin bags in a -135 degrees C mechanical freezer. Each of the four frozen samples in a vial was stored at a different temperature: one in the -80 degrees C freezer, one in the -135 degrees C freezer, one in the vapor phase of liquid nitrogen at -150 degrees C, and one in liquid nitrogen at -197 degrees C. Some of the frozen PBMCs were stored for periods of 1 to 1.5 years and others for 2 to 2.4 years, after which they were thawed, washed, and tested. Results: The samples stored in PVC bags and those stored in polyolefin bags exhibited in vitro recoveries that were 90 percent of the recovery of fresh PBMCs and viabilities of 90 percent after 2.4 years of frozen storage. The PBMCs stored in PVC bags exhibited no loss of CFU-GEMM activity after 1 to 1.5 years, but a 40-percent loss of activity was observed after 2 to 2.4 years. PBMCs stored in polyolefin bags, however, exhibited no loss of CFU-GEMM activity, even after 2 to 2.4 years of storage. In vitro recovery was significantly lower in PBMCs stored in vials at -80 degrees C or -135 degrees C than in cells stored in PVC or polyolefin bags at these temperatures, both in the 1- to 1.5-year and the 2- to 2.4-year time frames. In vitro recovery and viability were similar in PBMCs stored in vials at -80 degrees C, -135 degrees C, -150 degrees C, and -197 degrees C. The growth patterns in the CFU-GEMM assay in PBMCs stored in vials were significantly lower after storage at -80 degrees C than after storage at -135 degrees C, -150 degrees C, or -197 degrees C. Conclusion: PBMCs isolated by leukapheresis and ficoll-hypaque treatment can be frozen with 10-percent DMSO in a -80 degrees C mechanical freezer. When a PVC bag is used for freezing and storage of PBMCs at -80 degrees C, the duration of frozen storage should not exceed 1.5 years, whereas PBMCs frozen in a polyolefin bag can be stored in a -135 degrees C freezer for as long as 2.4 years. When these guidelines were followed, in vitro recovery was 90 percent that of fresh PBMCs, viability was 90 percent, and growth in the CFU-GEMM tissue culture assay was similar to that of fresh PBMCs. The PBMCs frozen and stored in PVC or polyolefin bags exhibited satisfactory results, whereas those stored in cryostorage vials did not.     

新型骨髓干细胞富集材料富集骨髓细胞的效果

背景：骨髓干细胞富集材料是目前研究热点,制备并筛选一种新型骨髓干细胞富集材料对于组织工程学发展及临床应用至关重要。目的：制备并筛选一种骨组织工程新型骨髓干细胞富集材料,应用选择性细胞滞留技术观察其富集骨髓细胞的效果。方法：用预先制备的人脱钙骨基质与不同体积分数（0.01%,0.05%,0.1%,0.5%,1%）的多聚左旋赖氨酸复合制备多聚左旋赖氨酸-脱钙骨基质材料,应用选择性细胞滞留技术富集骨髓干细胞进行实验。激光显微共聚焦拉曼光谱分析、红外光谱分析鉴定材料成分;三维视频显微镜、扫描电镜观察富集材料孔径、孔隙率、表面及横断面超微结构;对富集前后骨髓有核细胞、纤维母细胞集落形成单位和血小板进行计数分析。结果与结论：多聚左旋赖氨酸-脱钙骨基质富集材料孔隙率高,孔隙内部有大量孔隙相互连通,材料内外表面有乳白色均匀致密的多聚左旋赖氨酸涂层覆盖,并在天然孔隙内形成更小、孔径较均匀的网孔结构。体积分数0.1%多聚左旋赖氨酸制备的富集材料对人骨髓有核细胞、纤维母细胞集落形成单位和血小板的浓度富集倍数分别为（3.18±0.31）、（5.25±1.40）和（3.88±0.68）倍,相应的黏附率分别达（53±12）%,（73±13）%和（34±10）%,对纤维母细胞集落形成单位的选择率为1.41±0.34。结果证实,实验制备并筛选的经多聚左旋赖氨酸修饰的脱钙骨基质具有天然骨海绵状支架网孔结构,对骨髓细胞的选择性滞留率高,是一种较理想的骨髓干细胞富集材料。