大鼠眼外肌成肌细胞的增殖及分化特征

目的:完善眼外肌成肌细胞体外培养、鉴定的方法及观察其生物学特性。方法:实验于2005-02/08在青岛大学医学院附院中心实验室(省级实验室)完成。取出生后3～7d的大鼠,通过大鼠眼外肌细胞的取材、分离、消化、培养等技术,观察细胞的形态、生长曲线、细胞融合率,观察大鼠眼外肌卫星细胞的增殖与分化能力,利用成肌细胞标记物α-横纹肌肌动蛋白、中间丝结蛋白免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定。结果:①成肌细胞的生长情况:在生长培养基作用下,细胞增殖旺盛;在分化培养基条件下,细胞分化良好,可融合成肌管。②成肌细胞融合率:在24h和48h融合率提高明显,72h达高峰,之后不再变化。③细胞免疫化学检测结果:α-横纹肌肌动蛋白和中间丝结蛋白免疫细胞化学染色阳性。结论:体外培养的大鼠眼外肌卫星细胞具有良好的增殖与分化能力,其生物学特征同骨骼肌卫星细胞。     

当归多糖对体外造血微环境中肌卫星细胞增殖的影响

背景: 肌卫星细胞是造血功能重建最有希望的种子细胞来源.当归多糖对造血干细胞和造血祖细胞的增殖分化存在显著的促进作用,也可以有效改变肌卫星细胞的生长特性.目的: 观察当归多糖对不同培养条件下乳鼠骨骼肌卫星细胞增殖的影响.方法: 分离小鼠肌卫星细胞,培养5 d后采用a一肌动蛋白免疫细胞化学鉴定.将细胞接种于96孔板培养24 h,使细胞同步化;将细胞分为空白对照组,骨髓基质细胞培养上清组,加入含50,100,200,300,400 mg/L当归多糖的DMEM/F12培养基实验组及经50,100,200,300,400 mg/L当归多糖干预后骨髓基质细胞条件培养基组.经实验处理后采用MTT法检测各组细胞的增殖活性.结果与结论: 分离培养的骨骼肌卫星细胞呈α-肌动蛋白染色阳性,通过MTT法检测发现,经不同浓度当归多糖干预后的骨髓基质细胞条件培养基培养的各组肌卫星细胞增殖显著.且经当归多糖干预的骨髓基质细胞条件培养基可以有效改变肌卫星细胞的生长特性,并呈剂量依赖性.     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染对鼠眼外肌成肌细胞生物学行为的影响

背景:实验证明外源性的碱性成纤维细胞生长因子可以增强骨骼肌成肌细胞的生长及成活,内源性碱性成纤维细胞生长因子对肌肉修复也有明显作用。但如将其基因转染到眼外肌中也有相同的效果吗?目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子基因转染对鼠眼外肌成肌细胞生物学行为的影响。设计:单一样本观察。单位:青岛大学医学院附属医院眼科。材料:原代大鼠眼外肌成肌细胞为前期培养得到,纯度大于90%,并成功构建人PEGFP-N3-bFGF真核表达载体(另文发表)。方法:实验于2005-09/2006-12在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。①实验干预及分组:实验分为试验组:用重组PEGFP-N3-bFGF转染的细胞;对照组1:空载PEGFP-N3转染的细胞;对照组2:培养皿中只加入F-10培养基(体积分数为0.1的胎牛血清)培养的细胞。采用脂质体转染技术,将重组PEGFP-N3-bFGF质粒转染体外培养的大鼠眼外肌成肌细胞中。③实验评估:用免疫组织化学法观察碱性成纤维细胞生长因子表达;用荧光显微镜检测转染效率;在培养的第1,3,5,7,9,11,13,15,21,28天采用ABC-ELISA法检测各组成肌细胞碱性成纤维细胞生长因子蛋白的分泌;采用四甲基偶氮唑盐法检测各组眼外肌成肌细胞增殖情况;根据已知一定浓度标准品的A值计算各组细胞肌酸激酶活性。主要观察指标:①观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染体外培养的大鼠眼外肌成肌细胞的效率;转染后的表达情况。②转染后碱性成纤维细胞生长因子蛋白的分泌情况;对大鼠眼外肌肌原细胞生长和分化的影响。结果:①碱性成纤维细胞生长因子基因转染体外培养的大鼠眼外肌成肌细胞的转染率达(42.8±1.2)%。②免疫组织化学检测试验组呈现阳性反应。③转染细胞能够分泌碱性成纤维细胞生长因子蛋白,第5天最高达662.935ng/L。④转染细胞增殖活性明显提高,其A值均比同一时相点的对照组明显增高(P<0.05)。⑤转染后细胞从第5天始至终,肌酸激酶值高于对照组(P<0.01)。结论:碱性成纤维细胞生长因子基因转入大鼠眼外肌的成肌细胞中,能够使大鼠眼外肌的成肌细胞分泌碱性成纤维细胞生长因子,具有促进细胞增殖,提高其成活率,促进其分化能力。     

肌卫星细胞分化与骨骼肌纤维改变

目的:肌卫星细胞在骨骼肌的生长、发育、训练适应及损伤、移植中具有重要作用,肌卫星细胞的分化与骨骼肌纤维的肥大、萎缩以及骨骼肌纤维的转化等有着很大关系。如何有效控制肌卫星细胞的分化,使骨骼肌朝着良性发展是一个很大的课题。重点讨论肌卫星细胞增殖、分化后引起骨骼肌纤维改变,包括肌纤维质量增加,肌纤维横截面的增大和肌细胞数目的增多,以及肌纤维转化的过程。资料来源:应用计算机检索Medline springlink数据库1990-01/2007-04有关肌卫星细胞的文章,检索词为"skeletal musclesatellite cell"限定文章语言种类为English。同时计算机检索中国期刊全文数据库1990-01/2007-04期间的相关文章,检索词"肌卫星细胞,骨骼肌纤维",限定文章语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审,选取符合研究要求的有关文章找全文。纳入标准:①肌卫星细胞在骨骼肌纤维中的静止、激活和分化过程。②运动训练后肌卫星细胞的分化情况。③各种生长因子对肌卫星细胞分化的影响。排除标准:重复或类似的同一研究。资料提炼:共收集资料160篇,排除重复或类似的文章,37篇符合要求。其中有关肌卫星细胞在骨骼肌静止、激活和分化过程4篇,运动训练后肌卫星细胞的分化情况9篇,各种生长因子对肌卫星细胞的影响15篇,其他9篇。资料综合:①肌卫星细胞的形态学特征:肌卫星细胞一般处于静止状态,但在特定的应激条件下,如负重锻炼、创伤等,可以被激活进入有丝分裂期、增殖期,并进一步分化融合形成肌管参与骨骼肌的修复。②肌卫星细胞增殖与分化的调控与肌纤维改变:不同的生长因子通过不同的信号转导通路抑制或诱导成肌细胞的定向分化。成肌调节因子和各种生长因子作为内源性刺激影响着肌卫星细胞的增殖和分化,从而在某种程度上改变骨骼肌纤维组成。③展望:肌卫星细胞的分化过程受许多因素的影响,如何更好的控制这些外界条件,使肌纤维朝良好的方向发展值得研究。结论:肌卫星细胞在本身的遗传特性的基础上,有各种条件的诱导下,可以有选择性的激活、增殖及分化,从而使肌纤维发生改变。     

骨骼肌卫星细胞的培养鉴定及生物学特性

目的 :探讨骨骼肌卫星细胞体外培养、鉴定的方法及其生物学特性。方法 :采用 型胶原酶和胰蛋白酶二步消化法获取大鼠骨骼肌卫星细胞 ,进行体外原代和传代培养。观察细胞的形态 ,通过生长曲线、细胞融合率研究骨骼肌卫星细胞的增殖与分化能力 ,利用免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定。结果 :二步消化法适用于骨骼肌卫星细胞的获取。在生长培养基作用下 ,细胞增殖旺盛 ;在分化培养基条件下 ,细胞分化良好 ,可融合成肌管。 α sarcometric actin和 m yosin免疫细胞化学染色 ,骨骼肌卫星细胞呈弱阳性 ,肌管呈强阳性。结论 :体外培养的骨骼肌卫星细胞具有良好的增殖与分化能力 ,适用于组织工程和基因治疗     

自身免疫性肝炎大鼠模型外周血淋巴细胞体外培养与褪黑素的影响

目的:观察褪黑素对体外培养淋巴细胞增殖及促进细胞因子分泌的作用。方法:实验于2004-10/2006-10在解放军第一二三医院南京军区肝病中心实验室完成。①实验材料:Wistar大鼠,雄性,3月龄,体质量(230±20)g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。褪黑素:美国Sigma公司产品。②实验方法:采用弗氏完全佐剂加肝细胞特异性脂蛋白法建立自身免疫性肝炎大鼠模型。分别抽取正常大鼠及模型大鼠的外周血,实验室常规培养,并将其分为3组:褪黑素组培养基中加褪黑素使终浓度为2mg/L;促肝细胞生长素组培养基中加促肝细胞生长素使终浓度为2mg/L;空白对照组培养基中不加任何细胞分裂刺激剂。③实验评估:培养48h后,对外周血淋巴细胞进行常规计数并采用液体闪烁计数仪记录1min计数结果值。用于观察褪黑素与促肝细胞生长素促进外周血淋巴细胞增殖的效果。并检测培养上清液中的各细胞因子浓度,用于观察褪黑素与促肝细胞生长素促进外周血淋巴细胞分泌细胞因子的作用。结果:①褪黑素对正常大鼠外周血淋巴细胞有促进增殖作用,细胞数与1min计数值较空白对照组明显升高(P<0.05),促肝细胞生长素无促进外周血淋巴细胞增殖作用。②褪黑素对模型大鼠外周血淋巴细胞有促进增殖作用,细胞数与1min计数值较空白对照组明显升高(P<0.05),促肝细胞生长素无促进外周血淋巴细胞增殖作用。③在褪黑素作用下,正常大鼠Th1细胞因子IL-2和IFN-γ水平明显高于空白对照组和促肝细胞生长素组(P<0.01),Th2细胞因子IL-6明显升高(P<0.05),IL-4水平与空白对照组比较,差异不显著(P>0.05),促肝细胞生长素组Th1和Th2细胞因子与空白对照组无明显差异(P>0.05)。④在褪黑素作用下,模型大鼠Th1细胞因子IL-2和IFN-γ水平较空白对照和促肝细胞生长素组明显升高(P<0.05),Th2细胞因子IL-4和IL-6水平与空白对照和促肝细胞生长素组无明显差异(P>0.05)。结论:褪黑素对自身免疫性肝炎大鼠外周血淋巴细胞有较强的刺激分裂作用。     

骨骼肌卫星细胞的体外培养与生物学特性(英文)

目的:建立理想的骨骼肌卫星细胞体外培养方法,探讨其生物学特性,以达到应用于组织工程和基因治疗的目的。方法:采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶二步消化法获取大鼠骨骼肌卫星细胞,进行体外原代和传代培养。观察细胞的形态,通过生长曲线、细胞融合率研究骨骼肌卫星细胞的增殖与分化能力,利用免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定。结果:二步消化法适用于骨骼肌卫星细胞的获取。在生长培养基作用下,细胞增殖旺盛;在分化培养基条件下,细胞分化良好,可融合成肌管。α-sarcometric肌动蛋白和肌球蛋白细胞免疫化学染色,骨骼肌卫星细胞弱阳性,肌管强阳性。结论:体外培养的骨骼肌卫星细胞具有良好的增殖与分化能力,适用于组织工程和基因治疗。     

外源性碱性成纤维细胞生长因子对大鼠肌源性干细胞增殖的影响

背景:肌源性干细胞在体外培养过程中存在纯化、扩增、定向分化等难题,碱性成纤维细胞生长因子作为生物活性因子的一员,因其生物活性的多效性而备受关注.目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子对大鼠肌源性干细胞体外增殖的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-04/07在沈阳医学院完成.材料:健康雄性Wister大鼠5只,由沈阳医学院实验动物中心提供.碱性成纤维细胞生长因子为珠海生物制品有限公司产品.方法:无菌条件下取大鼠左前肢肱三头肌,采用酶消化法分离肌源性干细胞,应用密度梯度离心法和差速贴壁法进行纯化.取第2代肌源性干细胞,分别用终浓度为6.25,12.50,25.00,50.00,100.00μg/L碱性成纤维细胞生长因子进行干预;以单纯加入200 μL生长培养基作为空白对照组,以加入200μL生长培养基+肌源性干细胞作为阴性对照组.分别于培养24,48,72,96 h加入MTT溶液.主要观察指标:免疫细胞化学法鉴定大鼠肌源性干细胞,MTT比色法检测细胞增殖情况.结果:肌源性干细胞多呈Sca-1阳性反应,少数呈Desmin阳性反应.①不同浓度碱性成纤维细胞生长因子对肌源性干细胞的促增殖效应:与阴性对照组比较,各浓度碱性成纤维细胞生长因子组对肌源性干细胞均有明显的促增殖效应(P<0.05);浓度为6.25-50.00 μg/L时促增殖作用随其质量浓度升高而显著增强(P<0.01),至50.00 μg/L时其促增殖作用接近顶峰.②碱性成纤维细胞生长因子在不同培养时间点对肌源性干细胞的促增殖效应:随培养时间的延长肌源性干细胞明显增殖,与阴性对照组比较,碱性成纤维细胞生长因子组出现显著促增殖效应(P<0.01)的时间为培养96 h.结论:碱性成纤维细胞生长因子可促进体外培养的大鼠肌源性干细胞增殖,且呈浓度一时间依赖性增加,50.00 μg/L与96 h为较佳的体外培养质量浓度和时间.     

肝细胞生长因子在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体作用下对原代肝星状细胞增殖及凋亡的影响

背景:活化的肝星状细胞是肝纤维化的关键因素,研究表明肝细胞生长因子能促进星状细胞凋亡,其具体机制可能与增强肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导星状细胞凋亡有关。目的:观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体作用下,肝细胞生长因子对原代肝星状细胞增殖、凋亡的影响并初步探讨其可能机制。方法:将SD大鼠原代肝星状细胞复苏、传代,细胞增殖明显时用于实验。实验分为4组:空白对照组为单纯肝星状细胞培养;肝细胞生长因子组:将100μg/L肝细胞生长因子作用于肝星状细胞;TRAIL组:将2mg/L的TRAIL作用于肝星状细胞;肝细胞生长因子+TRAIL组:将肝细胞生长因子预先刺激肝星状细胞24h,再加入2mg/LTRAIL。结果与结论:MTT检测显示肝细胞生长因子及TRAIL分别在50～200μg/L、0.5～1.5mg/L各浓度下对肝星状细胞增殖抑制率无影响,TRAIL在2mg/L作用下对肝星状细胞有抑制作用。流式细胞仪检测肝细胞生长因子+TRAIL组的中晚期凋亡率明显高于空白对照组及肝细胞生长因子组(P<0.05);肝细胞生长因子+TRAIL组DR5荧光强度明显高于其他3组(P<0.01)。提示在TRAIL作用下,肝细胞生长因子能促进肝星状细胞的凋亡、抑制其增殖。可能与肝细胞生长因子上调活化肝星状细胞表面DR5表达有关。     

大鼠肝卵圆细胞体外分离培养和向肝细胞的诱导分化

背景:肝卵圆细胞具有强大的自我更新复制及在一定的条件下克隆增殖并分化为成熟肝细胞的能力,既可在体外用丁构建生物人工肝的生物材料部分,也可以进行体内移植,还可为组织工程提供种子细胞,在治疗肝病方面具有广阔的前景.目的:建立成年Wistar大鼠肝卵圆细胞增殖模型,行体外分离和培养肝卵圆细胞,探索体外诱导其分化为肝细胞的可行性.设计:观察性实验.单位:南方医科大学南方医院消化病研究所.材料:实验于2003-12/2006-02在南方医院消化病研究所实验室完成.36只三四个月龄,体质量约150～200 g的健康雄性Wistar大鼠,南方医科大学实验动物中心提供.方法;将雄性Wistar大鼠行乙硫氨酸灌喂和2/3肝切除.采用两步法灌注和Percoll密度梯度离心法分离纯化肝卵圆细胞,行体外培养并添加肝细胞生长因子、肿瘤抑制因子M和成纤维细胞生长因子4诱导其分化.主要观察指标:肝卵圆细胞和诱导分化细胞的鉴定.结果:①体外分离每只模型大鼠肝脏中可获得约1.34×108L-1肝卵圆细胞,细胞为圆形、椭圆形或多角形,约为正常肝细胞1/6～1/3,核质比例大,2周后可呈克隆样增殖生长.②激光扫描共聚焦显微镜显示,肝卵圆细胞胞浆和胞膜表达干细胞标志Thy-1及C-kit.③免疫细胞化学检测其原始细胞标志甲胎蛋白呈阳性表达.肝卵圆细胞能稳定传代,肝卵圆细胞在肝细胞生长因子、肿瘤抑制因子M和成纤维细胞生长因子4刺激下细胞形态逐渐发生改变,细胞伸展且体积渐增大,贴壁能力减弱,诱导14d后分化细胞Alb明显阳性表达,且随着诱导时间的延长,其阳性率逐渐升高.④细胞化学方法显示诱导分化细胞胞浆G-6-P染色呈棕黑色沉淀,PAS染色呈红色颗粒.结论:乙硫氨酸灌喂联合2/3肝切除可复制成年Wistar大鼠的肝卵圆细胞增殖模型.胶原酶灌注结合Percoll密度梯度离心分离纯化可获得满意的肝卵圆细胞.大鼠肝卵圆细胞能在体外传代培养,在一定条件刺激下可诱导分化为肝细胞.