血小板冻干保存的研究进展

冻干是保存血小板最理想的方法，能常温保存、占用空间小、重量轻和便于运输等，可解决目前血小板保存和运输方面存在的局限性问题。然而冻干除引起血小板膜结构损伤、蛋白质变性甚至死亡之外．还可致血小板激活损伤，冻干所致的血小板激活与膜通道脂质发生相变有关。针对损伤机制应用各种保护剂可减少冻干损伤．目前已有研究通过海藻糖的载入，在实验室成功地进行了血小板的冻干保存，冻干再水化后血小板仍具有正常生理功能和存活能力。这些研究结果表明血小板的冻干保存可应用于将来的血库和临床输血。本文综述了冷冻干燥对血小板损伤作用、保护剂在血小板冷干研究中的应用及血小板冻干保存的实验研究。     

冻干红细胞残余水的测定及其分布研究

目的建立并比较冻干红细胞残余水含量测定方法,探讨冻干红细胞残余水的分布情况。方法一次性冻干等量(500μL)的含保护剂(主要成分12%甘油)的红细胞、无保护剂的红细胞,含保护剂(同前)的血影细胞、无保护剂的血影细胞及保护剂,用热重分析法及Karl-Fisher滴定法结合卡式炉法测定其残余水含量,同时用含水量固定的标准品(水分含量4.9%-5.2%)做检验,每组样品重复测量6次;分析各组之间的差异,比较冻干血影细胞及冻干红细胞残余水含量。结果热重分析法测定残余水含量(%):冻干红细胞、无保护剂冻干红细胞、冻干血影细胞、无保护剂冻干血影细胞、单纯冻干保护剂、标准品分别为19.01±2.18、4.60±0.78、18.95±1.89、4.87±1.01、16.12±1.04、5.28±0.16;冻干保护剂及含保护剂冻干红细胞的热重(TG)曲线走势接近,无保护剂冻干红细胞与前二者曲线走势差异明显;Karl-Fisher法测定残余水含量(%):冻干红细胞、无保护剂冻干红细胞、冻干血影细胞、无保护剂冻干血影细胞、单纯冻干保护剂、标准品分别为3.21±0.23、1.22±0.09、3.16±0.26、1.25±0.07、2.63±0.41、5.14±0.13。结论热重分析法测定含保护剂的冻干品残余水含量时的结果偏高,Karl-Fisher滴定法结合卡式炉法能够准确反映冻干红细胞的残余水含量;初步判断冻干红细胞残余水主要分布于细胞膜。     

海藻糖用于血细胞冻干保存中的研究进展

冰冻干燥方法是保存血细胞最佳的方法，因为冻干的血细胞制品能在常温下保存，性能稳定，保存时间长．便于运输，保存费用低廉等优势，解决了目前血细胞保存的局限性。然而，在冻干过程中血细胞膜的损伤、细胞功能的降低是一个重要的问题。目前，研究者多以海藻糖为保护剂，将海藻糖导入血细胞内，对血细胞进行冻干。本文主要综述冻干对血细胞损伤机理，海藻糖对血细胞冻干过程中的保护机制及海藻糖在血细胞冻干保存中的研究现状。     

常用细胞冻干保护剂的特性、作用机制及应用进展

细胞冷冻干燥保存是指把组织细胞、血细胞等在低温下冻结,然后在真空条件下升华干燥、除去冰晶,待升华结束后再进行解吸干燥,除去部分结合水的干燥方法。这一方法的过程主要可分为:细胞的准备、预冻、一次干燥(升华干燥)和二次干燥(解吸干燥)、密封保存等5个步骤。该方法的预期目标是,按上述方法冻干后的细胞可在室温下避光长期贮存,需要使用时,加特制的悬浮液即可恢复到冻干前的状态。由于绝大多数细胞对低温非常敏感,冷冻或解冻过程中细胞膜及细胞器可能会受到不可逆转的伤害,因此为了保护细胞的活性,通常在冻干液中添加活性物质保护剂,这…     

人凝血因子Ⅷ几种冻干保护剂的比较

目的探讨不同冻干保护剂对人凝血因子Ⅷ(FⅧ)制品在冻干及干热(100℃,30min)过程中的作用。方法同批次人FⅧ样品在相同冻干条件及一定保护剂(0.3%甘氨酸、1.5%蔗糖、1.0%白蛋白)组成的基础上,改变甘氨酸、蔗糖、白蛋白、木糖醇和精氨酸5种冻干保护剂的含量或种类,组合成6组配方,对不同配方冻干及干热后FⅧ制品外观、复溶后澄清度及FⅧ活性等进行分析比较。结果Ⅰ组(3%甘氨酸):冻干和干热后制品成形最好,但复溶后均有少量絮状物;Ⅱ组(5%蔗糖):冻干和干热后制品均萎缩,冻干过程部分制品水份未抽干,冻干后澄清度较好,干热后部分有少量絮状物;Ⅲ组(2%白蛋白):冻干和干热后制品成形较好,但复溶后均有絮状物;Ⅳ组(5%木糖醇):冻干后制品萎缩,复溶后澄清度最好,干热后膨胀,复溶后有大量絮状物;Ⅴ组(1.2%精氨酸):冻干和干热后制品萎缩,但复溶后澄清度均较好;Ⅵ组(5%木糖醇+1.2%精氨酸):冻干后制品膨胀,复溶后澄清度较好,干热后进一步膨胀,复溶有大量絮状物。各组冻干后FⅧ活性≥9.3 IU/ml,回收率均较高(≥84.2%);干热后差别明显,其中Ⅲ组(2%白蛋白)FⅧ活性≥9.3 IU/ml,回收率最高(≥90.4%),而Ⅳ组(5%木糖醇)和Ⅵ组(5%木糖醇+1.2%精氨酸)FⅧ活性≤0.94 IU/ml,回收率极低(≤9.8%)。结论在冻干及干热过程中不同冻干保护剂作用差异较大,甘氨酸赋形作用较好,精氨酸对制品中蛋白稳定作用明显,白蛋白对FⅧ活性保护作用最佳;较高浓度的蔗糖不利于冻干过程中水份的去除,木糖醇不适于作为需100℃干热处理的人FⅧ冻干保护剂。     

冻干重组人三突变型低氧诱导因子-1α腺病毒的制备

目的:研制冻干重组人三突变型低氧诱导因子-1α(HIF-1α)腺病毒。方法:将重组人三突变型HIF-1α腺病毒与不同配比的保护剂按适当比例混合,进行冻干,根据冻干后外观、病毒滴度测定、热稳定性试验、PCR、基因测序等结果,筛选冻干保护剂并评价冻干品质量。结果:冻干腺病毒所携带的目的基因信息无丢失或变异;以10%海藻糖、0.5%明胶、3%山梨醇等成分配制的保护剂作用较好,冻干后腺病毒感染性滴度下降0.33LgPFU/mL;37℃放置3周,滴度下降0.8LgPFU/mL。结论:以合适的保护剂制备冻干重组人三突变型HIF-1α腺病毒能达到较满意的效果。     

人红细胞冻干保护剂配方及浓度的优化

本研究探讨不同红细胞冻干保护剂配方及浓度的变化对红细胞冻干-复水后回收率的影响。应用一系列不同浓度的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、海藻糖及不同渗透性保护剂组成的红细胞冻干保护剂保护冻干红细胞并检测冻干红细胞复冰后红细胞及血红蛋白的回收率．结果显示：荷载海藻糖的红细胞在添加不同浓度保护剂保护下各组的红细胞损失率差异具有显著性（P〈0．05或P〈0．01），其中以有PVP360的保护液组中的细胞损失最大（0．24％），含有PVP40且胞外海藻糖浓度为150mmol／L时，红细胞的损失最小（0．02％）．海藻糖浓度为150mmol／L与海藻糖浓度为50mmol／L的保护剂组之间存在统计学差异（P〈0．01）。冻干红细胞在添加不同PVP40浓度的冻干保护剂作用再水化后红细胞和血红蛋白回收率也不相同。15％PVP40＋150mmol／L海藻糖＋2％BSA在红细胞冻干中的保护效果最好，红细胞和血红蛋白回收率分别为（61．29±4．93）％，（62．49±5．91）％，与其它各组间存在显著差异（P〈0．01）。含有甘油的冻干保护液对红细胞冻干过程中的保护效果最好，红细胞和血红蛋白回收率分别为（65．97±4．52）％和（67．24±5．94）％，与其它渗透性保护剂组相比存在显著性差异（P〈0．01）。结论：红细胞冻干保护剂为0．8mol／L甘油＋15％PVP40＋150mmol／L海藻糖＋2％BSA是最佳保护剂浓度配方。     

甘油浓度对红细胞冻干保存效果的影响

目的探讨甘油浓度浓度对红细胞冷冻干燥保存的回收率、溶血率及残余水含量的关系。方法以甘油浓度分别为3%、6%、9%、12%、15%、18%、21%(w/v)的冻干保护剂处理红细胞,冻干,用显微镜观察细胞形态、血细胞计数仪检测细胞数、分光光度计测定游离血红蛋白量,分析细胞复水后红细胞计数、溶血情况。用热重法测定冻干红细胞水分含量,分析不同保护剂组红细胞的水分含量变化情况。结果复水后红细胞形态正常,甘油浓度为9%、12%、15%时,红细胞回收率分别为(77.08±9.41)%、(84.37±3.42)%、(80.21±9.20)%,红细胞溶血率分别为(19.82±2.23)%、(17.66±1.17)%、(15.86±2.23)%,相应的冻干红细胞残余水分含量为(19.43±1.36)%、(22.89±1.57)%、(26.17±1.09)%。结论保护剂中甘油浓度影响红细胞冻干保存的效果;甘油浓度为(9-15)%时对冻干保存的红细胞损伤较小;冻干红细胞残余水分含量随保护剂中甘油浓度的增高而增高。     

冻干血小板制备技术的研究要点

本文介绍了近年来冻干血小板制备过程中几个关键问题的研究进展,包括冻干前预处理时不同保护剂、激活抑制剂,冻干过程中参数和冻干后复水方式的技术要点,及冻干血小板在应用方面的初步进展。     

内毒素血症小鼠巨噬细胞膜脂的改变及其对炎症介质产生的影响

目的：研究内毒素血症小鼠腹腔巨噬细胞膜脂的改变及其对炎症因子产生的影响。方法：建立小鼠内毒素血症模型，观察内毒素（LPS）对小鼠腹腔镜巨噬细胞膜脂成分，膜流动性及细胞分泌炎症因子的影响。并观察磷脂脂质体对细胞膜的保护作用。结果：LPS作用1h，巨噬细胞膜主要的磷脂成分降解（P＜0．05）；细胞膜荧光偏振度（ρ）、微粘度（η）和分子排列有序性系数（γ）增加（P＜0．05）；培养细胞上清中炎症因子血栓素B2（TXB2），6－k-前列腺素F1α（6-k-PGF1α）含量明显增加（P＜0．05）。经磷脂脂质体预处理后，膜损伤及炎症损伤减轻，结论：内毒素血症小鼠腹腔巨噬细胞膜磷脂降解，细胞膜从相对比较流动变为相对固化，与膜脂有关的炎症介质浓度增加，磷脂脂质体有修复膜磷脂结构，减少炎症介质的作用。     

血小板保存和被激活期间血小板膜的完整性

背景 从23℃冷却到4℃,血小板膜似乎要经历一段相转换过程。这一阶段的转换将泄露细胞物质并导致不可逆的细胞损伤。在冷却及干燥过程中已知的保护细胞膜及蛋白的保护剂是否可以保护血小板需要研究。通过检测周围介质中荧光素的释放对细胞溶质成分的外泄进行检测。研究设计与方法 新鲜血小板悬浮于5％二甲基亚砜(DMSO)或浓度为5mM的下述的保护剂:葡萄糖、海藻糖、蔗糖、甘油、乙烯基乙二醇,1,2-propanedioc,或L-脯氨酸。用10nM荧光素双醋酸盐(FD)负载血小板,4℃冷藏24小时或以每分钟1℃速率降温至-70℃,迅速升温至37℃离心,检测悬浮物中的荧光素。通过瑞斯丁素凝集作用,凝血酶和ADP集聚,血小板诱导凝结反应,以使P-选择蛋白表达     

腺苷对血小板体外激活的抑制作用

本研究的目的主要是研究腺苷对血小板的体外激活抑制作用,为血小板冻干前处理过程筛选血小板功能保护剂提供依据.采用流式细胞术（FCM）测定血小板膜表面CD62P和PAC-1的表达,应用APACT-2聚集仪测定瑞斯托菌素（restocetin）、凝血酶（thrombin）、二磷酸腺苷（ADP）和没食子酸（propyl gallate）诱导的血小板聚集率.研究结果表明,冻干预处理后血小板膜表面CD62P表达显著增加,腺苷浓度为0.75 mmoL/L时可抑制CD62P表达,且呈剂量效应;腺苷可抑制没食子酸诱导的血小板聚集反应,但对瑞斯托霉素诱导的血小板聚集无抑制作用,腺苷浓度≥1.0 mmol/L对凝血酶诱导的聚集有显著抑制作用.因此,腺苷可抑制体外处理导致的血小板激活,对瑞斯托霉素和凝血酶诱导血小板聚集反应无明显抑制.结论：腺苷可作为血小板体外激活抑制剂及冻干前处理的功能保护剂.     

钴~(60)-γ射线辐照法消毒冻干免疫球蛋白的效果观察

目的探讨钴60-γ射线辐照消毒法处理冻干免疫球蛋白的可行性。方法采用病毒定量检测方法,观察钴60-γ射线辐照法对免疫球蛋白中病毒灭活效果。结果含病毒的免疫球蛋白经30kGy剂量钴60辐照处理,对含不同蛋白保护剂的冻干IgG制品中辛德比斯病毒灭活对数值≥5.5TCID50。经30kGy剂量辐照灭菌处理,冻干IgG制品外观未见明显改变,各处理组之间的pH值与未处理组结果相近。蛋白电泳Native-PAGE分析各保护剂组之间无明显差别,保护剂浓度高低对试验结果无明显影响;SDS-PAGE分析,各处理组中的IgG经还原后其重链和轻链仍清晰可见,各保护剂组结果间无明显差别。高效液相色谱法检测结果显示,三种保护剂对IgG分子的保护效果较好,分子聚合和断裂峰明显减少。冻干IgG经辐照处理后抗原含量与对照相比均达80%以上,各保护剂组之间抗原含量基本一致。结论冻干血浆蛋白制品IgG经γ-射线照射后能够保持一定的结构和功能的完整性。     

Box-Behnken设计-响应面法优化猪源纤维蛋白原冻干保护剂

目的通过Box-Behnken设计—响应面法优化猪源纤维蛋白原的冻干保护剂配比。方法以蔗糖、精氨酸和白蛋白为自变量,以粘合力和弹力的总评"归一值"作为因变量,通过对自变量各水平进行多元线性回归及二项式拟合,采用响应面法优选保护剂配方配比,并进行预测分析。结果精氨酸对纤维蛋白粘合剂力学性能的影响最为显著,其次是白蛋白。最优保护剂配方比为:蔗糖含量15.87 g·L-1、精氨酸含量7.87 g·L-1、白蛋白含量3.62 g·L-1。结论模型预测的粘合力值与真实值能较好的拟合,具有较高的精确度,说明该模型能有效地预测纤维蛋白胶体力学性能,优化所得的纤维蛋白原冻干处方工艺稳定可行。     

硫酸铵法提取血吸虫感染兔血清IgG初探

目的探索硫酸铵法提取血吸虫感染兔血清IgG用于制备阳性参考品的可行性。方法采用饱和硫酸铵溶液对感染兔血清中IgG进行沉淀分离,IHA试剂测定分离前后、冻干前后的抗体滴度以及冻干IgG复溶后的稳定性。结果滴度为1:320的血吸虫感染兔血清经硫酸铵沉淀法提取IgG,经透析、浓缩至原体积后抗体滴度为1:320,粗提IgG以阴性兔血清和蔗糖为冻干保护剂,冻干前、后滴度均为1:160;冻干IgG复溶0d、3d、6d和8d抗体滴度分别为1:160、1:80、1:40和1:40。结论硫酸铵沉淀法提取、冻干IgG不引起滴度改变,冻干保护剂的加入会使抗体滴度下降,冻干IgG复溶3d后滴度出现下降。因此,硫酸铵沉淀法可用于提取血吸虫感染兔血清IgG。     

贮存红细胞膜氧化损伤与抗氧化酶的保护作用

对过氧化引起红细胞膜损伤进行了实验研究。结果表明:红细胞经超氧化物阴离子氧化后,其损伤表现为高分子蛋白质交联聚合物形成,共轭二烯水平增加,红细胞贮存损伤亦呈类似特征。抗氧化酶可阻抑蛋白质交联聚合物的形成并对膜损伤有一定的保护作用。     

内毒素血症小鼠巨噬细胞膜脂质改变对炎症介质产生的影响

目的 研究LPS及磷脂脂质体对小鼠腹腔巨噬细胞膜脂质成分，膜流动性及细胞分泌炎症因子的影响。方法 以小鼠内毒素血症为模型目的。结果 发现LPS作用lh，巨噬细胞膜主要的磷脂成分显降解；细胞膜荧光偏振度(ρ)、微粘度(η)和分子排列有序性系数(γ)显增加；培养细胞上清中炎症因子TXB2，6—κ—PGHlα含量明显增加。且随时间延长，各损伤程度加重。结论 经磷脂脂质体预处理后，膜损伤及炎症损伤减轻。     

冻干血小板保护液优化的实验研究

目的优化冻干血小板保护液,减少冻干过程对血小板的损害,有效保护其功能。方法采用3因素3水平的正交设计法,对血小板膜保护剂、血小板激活抑制剂、蛋白质类保护剂的3类成分组成的保护液进行优选。检测血小板最大聚集率、血小板活化标志PAC-1、CD62P的阳性表达率和血小板回收率,通过比较其差异,筛选出本实验的最优冻干血小板保护液。以优化保护液对血小板处理后进行冻干,并以此为实验组,与新鲜血小板和原保护液处理后冻干血小板进行比较验证,验证指标与优选指标相同,比较3者4项指标之间的差异。结果正交设计试验结果显示:血小板最大聚集率组间最高(74.33±24.01)%,血小板活化标志PAC-1和CD62P低于9组平均水平,血小板回收率高于9组平均水平。以主要体现血小板功能的血小板最大聚集率为优先指标,结合其余3项检测指标进行综合分析,在原保护液的基础上,筛选出添加了2%DMSO、第2信使调节剂、2 mmol/L维生素B6,75%的PPP保护液组为最优组合。验证实验结果显示,优化保护液组血小板最大聚集率(76.12±6.02)%,与原保护液组相比,差异有统计学意义(P0.05),与新鲜血小板组相比,差异没有统计学意义(P0.05)。最优保护液组血小板激活标志PAC-1和CD62P阳性表达率分别为(3.23±0.49)%和(36.83±8.21)%,2者与原保护液组、新鲜血小板组相比,差异无统计学意义(P0.05);最优保护液组冻干血小板复水化后血小板回收率为(85.90±2.24)%,与原保护液组相比,差异无统计学意义(P0.05)。结论本实验优化的血小板保护液优于原保护液,明显提高了冻干血小板复水化后最大聚集率,能更好地保护血小板的功能,但对血小板冻干过程的保存损害问题没有得到更好的改善,有待下一步深入研究。     

水通道蛋白与神经系统疾病关系的研究进展

水通道蛋白是细胞膜上具有高度选择性的自由水分子跨膜转运通道蛋白,在生理情况下可调节细胞内外水及电解质的平衡;在各种病因的作用下,其与病理损害及水肿形成有关,同时对诊断视神经脊髓炎有重要意义。调节或阻遏水通道蛋白的表达以减轻各种病理损伤和脑水肿,将为,临床疾病的诊治提供新的思路和方法。该文就水通道蛋白与神经系统疾病关系的研究进展进行了综述。     

甘油含量对冷冻干燥保存红细胞的作用

目的分析甘油含量对冷冻干燥保存红细胞的作用。方法应用不同浓度甘油（5%、10%、20%、30%和40%）作为红细胞冷冻干燥保存的保护剂,研究冷冻干燥红细胞复水后红细胞形态以及复水后完整红细胞回收情况。结果甘油预处理的红细胞冷冻干燥后复水红细胞结构完整、形态正常,尤以40%甘油最佳,复水后红细胞回收率最高。结论研究为使用甘油作红细胞冻干保存的保护剂提供了初步的理论依据。