应用mRNA差异显示技术筛选大鼠小脑颗粒神经元凋亡模型中差异表达基因

目的： 应用mRNA差异显示技术对大鼠小脑颗粒神经元凋亡模型中差异表达基因进行筛选，克隆以及鉴定。方法: 大鼠小脑颗粒神经元的分离和原代培养；对大鼠小脑颗粒神经元凋亡逆转模型进行荧光mRNA差异显示逆转录PCR（FDDRT-PCR,fluorescent differential display RT-PCR）；EST片段亚克隆入pGEM-T EasyTM，克隆后测序并进行序列同源性检索；反Northern杂交重鉴定与筛选。结果: 通过DDRT-PCR获得164 个在小脑颗粒神经元凋亡模型中差异表达的ESTs；对其中的17个ESTs进行了克隆并测序；通过反Northern杂交的初步筛选初步鉴定出5个阳性片段。结论: 阳性差异表达EST的筛选、克隆以及鉴定为神经元凋亡与保护分子机制研究奠定基础。     

“低钾”诱导神经元凋亡过程中ARNT2上调表达的分析

目的：观察“低钾”诱导大鼠神经元凋亡过程中ARNT2的表达变化，探讨ARNT2与神经元凋亡的关系。 方法： 建立“低钾”诱导神经元凋亡模型，应用RT-PCR分析ARNT2在凋亡过程中mRNA的表达变化，Western blotting分析蛋白质的表达变化，间接免疫荧光与激光共聚焦确定亚细胞定位。 结果： “低钾”诱导30 min后大鼠小脑颗粒神经元ARNT2 mRNA表达水平即明显上调，1h后上调表达最明显，并持续至“低钾”诱导后12 h左右，ARNT2蛋白质水平的表达变化与 mRNA水平的表达变化相似，免疫荧光结合激光共聚焦分析显示ARNT2蛋白定位于正常大鼠小脑颗粒神经元细胞核内。 结论： ARNT2分布于正常大鼠小脑颗粒神经元细胞核内，在“低钾”诱导的凋亡过程中ARNT2 mRNA与蛋白均上调表达。     

大鼠小脑部分表达序列标签的鉴定

目的:为了获取大鼠小脑特异表达的cDNA序列,筛选新的EST基因片段,以便进一步获取有意义的cDNA全基因。方法:以大鼠大脑、脑干mRNA逆转录cDNA作为driver(驱动)cDNA,大鼠小脑mRNA逆转录cDNA作为tester(测试)cDNA,经消减杂交法,消除与大脑及脑干相同的cDNA,并富集低丰度基因,从而获得大鼠小脑特异表达基因片段,以及低表达基因片段,克隆制备成大鼠小脑特异表达cDNA文库。结果:共挑选出32个阳性克隆质粒,测序得到34个不同基因片段的序列。最后用反Northern杂交去除假阳性,筛选出8个有意义的差异表达cDNA基因片段。同时,将测序结果与Genbank进行同源性比较,发现13个新的EST序列,并申请获得基因序列号(AW288461-AW288474)。结论:抑制消减杂交法是一种筛选特异表达基因的有效方法。本结果可为研究脑功能的分子机制提供有益的资料。     

小脑发育过程中Atoh1时空表达模式

目的 探究小脑发育过程中转录因子Atoh1 mRNA及其蛋白的时空表达模式。方法 取不同发育阶段的小鼠小脑冷冻切片，RNA scope技术分析Atoh1 mRNA在小脑中的时空表达模式，每组n=3。同时，使用Atoh1转基因和基因敲入两种不同遗传学策略的报告小鼠，采用免疫荧光染色技术分析Atoh1在蛋白水平的时空表达，每组n=3。结果 Atoh1 mRNA在胚胎小脑菱唇和外颗粒细胞层中呈高表达；Atoh1-3^*V5-P2A-tdTomato/+基因敲入小鼠染色结果显示，Atoh1主要表达在菱唇和有增殖能力的外颗粒细胞层的外层；Atoh1-Cre; tdTomato/+转基因小鼠显示，Atoh1阳性细胞在菱唇和整个颗粒细胞发育过程中包括外颗粒细胞层和内颗粒细胞层中均呈高表达。结论 小脑发育过程中，Atoh1 mRNA和蛋白在胚胎期的菱唇和出生后的外颗粒细胞层中高丰度表达；但在蛋白水平上，基因敲入小鼠和转基因小鼠Atoh1在菱唇和外颗粒细胞层中的表达略有不同。     

MPTP损伤侧猴中脑黑质组织的基因表达

目的：采用mRNA差异显示技术（mRNA differential display,mRNA DD)寻找MPTP诱导和未诱导的猴中脑黑质组织差异表达的cDNA。方法：对诱导侧及未诱导侧的黑质mRNA用3′端3个锚定引物分别与5′端30种随机引物进行逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳及硝酸银染色显示目的的条带。结果：获得一批表达差异的cDNA片段，对其克隆后作DNA序列测定，同源性比较分析发现，其中2个克隆为未知序列，已被GenBank接收，接收号为AF159161、AF159162。结论：MPTP诱导后黑质可能有效新基因的表达。     

从rds小鼠视网膜克隆视网膜色素变性相关差异片段

目的 从遗传性视网膜色素变性动物模型rds小鼠中克隆视网膜色素变性发病过程中特异表达的基因。方法 应用差异显示技术,分析rds小鼠发病过程中视网膜的mRNA。对特异性表达的mRNA片段进行克隆测序。结果 在视网膜色素变性发病过程中,rds小鼠的视网膜存在着相当明显的基因表达差异。在所测序分析的5个差异显示片段中其中一个与GenBank刚登录的功能未知的、从成年男性睾丸组织中克隆出来的cDNA序列较高同源（同一率为86％）另外4个为低同源序列。25天rds小鼠高表达的一个差异片段,与37天正常鼠表达而rds小鼠不表达的另一个片段,长度相同,177个碱基只相差两个。结论 视网膜色素变性这类慢性病变,存在着多个基因的表达及调控。     

缺乏白细胞共同抗原基因的小脑颗粒神经细胞对细胞凋亡的抑制

我们从出生4d的白细胞共同抗原基因野生型(LCAR ／ )和缺陷型(LCAR-／-)小鼠中分离小脑颗粒细胞作培养，研究了该基因在小脑颗粒细胞凋亡过程中的作用。结果表明，当小脑颗粒细胞在体外培养7d后，细胞培养液25mM氯化钾(K25 S)转变为5mM氮化钾(K5 S)后，并进一步培养24、48、72和96h，所有LCAR-／-小鼠的小脑颗粒细胞对细胞凋亡都有抑制作用。     

ATF-2基因RNA干扰表达载体的构建及鉴定

目的:构建活化转录因子2(ATF-2)基因RNA干扰的真核表达载体,观察其对HepG2肝癌细胞株增殖及凋亡的影响。方法:根据ATF-2 mRNA序列,合成两条寡聚DNA片段,退火后克隆入质粒载体PBA-siU6,DNA测序鉴定重组质粒PBA-siATF-2。脂质体介导质粒转染HepG2细胞。Westernblot法检测ATF-2蛋白表达;MTT方法检测细胞增殖率,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率。结果:ATF-2基因RNA干扰载体经测序分析证实插入64 bp序列正确无误;Westernblot法显示干扰组细胞内ATF-2蛋白表达量明显降低;ATF-2基因的下调导致HepG2细胞增殖阻滞和凋亡发生。结论:成功构建了ATF-2基因RNAi真核表达载体,下调HepG2细胞ATF-2基因表达,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

甲基丙烯酸环氧丙酯诱导人胚肺细胞恶性转化相关基因片段的克隆

本研究在建立GMA诱导的HELF体外恶性转化模型的基础上，采用mRNA差异显示（DD－PCR）技术，对恶性转化细胞同正常细胞之间基因的差异表达状况进行了比较分析，共克隆到18个差异表达cDNA片段，其中，17个DNA片段与已知基因高度同源，另外一个为新基因序列。Northern杂交证实，分别有8个和3个基因在GMA诱导的恶性转化细胞中表达增加或降低，结果提示，这些基因可能参与了GMA诱导的细胞恶性转化过程，为进一步研究GMA诱导细胞转化及其潜在致癌机理提供了新的线索。     

用mRNA差异显示方法寻找小鼠胸腺基质细胞差异表达基因

目的 寻找并初步分析小鼠胸腺基质细胞差异表达基因。方法 来源于小鼠胸腺基质细胞系的两株亚克隆细胸4（5）和4（12）,前者可诱导前体T细胞的进一步成熟,分别提以该两株细胞的总RNA,利用mRNA差异显示方法（DD－PCR）筛选4（5）细胞特异表达的基因片段。结果 得到了17个4（5）细胞特异表达的基因片段（expressed sequences tag,EST）,其中14个代表了尚未登录的小鼠新基因,另外3个则分别与小鼠的cytochrome Coxidase,Hsp65,Eps8基因高度同源。结论 DD－PCR方法是一种优良的寻找新基因的方法,小鼠胸腺基质细胞可能分泌或表达更多的新因子或分子。     

cDNA代表性差异分析法分离鼻咽癌上皮细胞株HNE1表达差异cDNA序列的初步研究

目的寻找鼻咽癌中差异性表达基因，包括与鼻咽癌发病相关的候选抑瘤基因。方法应用ｃＤＮＡ代表性差异分析法（ＲＤＡ），分离原代培养的正常人鼻咽上皮细胞与鼻咽癌细胞株ＨＮＥ１中差异表达的ｃＤＮＡ序列，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交被用来分析差异性表达产物的来源，最后，将这些序列克隆到ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ载体中，并用链终止法测序。结果在第４轮杂交及扩增反应后，获得４条差异性条带。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交证明，这些差异性片段来自作为“检测”扩增子的正常人鼻咽上皮，在鼻咽癌细胞株ＨＮＥ１中不表达或表达降低。序列分析这些差异性片段的克隆，发现一些序列是与已知基因高度同源的基因，包括一些看家基因；另有一些基因则为新基因序列。结论鼻咽癌的发生是一个多基因参与的过程，所获得的差异性片段中，与之同源的一些已知基因具有抑瘤功能。     

Liprin-alpha2 gene,protein tyrosine phosphatase LAR interacting protein related gene,is downregulated by androgens in the human prostate cancer cell line LNCaP

Prostate cancer is one of the most common neoplasms in the USA and Europe. We used differential display PCR (DD-PCR) to identify androgen-regulated genes in prostate cancer. The RNA of LNCaP cells treated with dihydrotestosterone (DHT) was analyzed for differentially expressed genes. Using DD-PCR, we identified a down-regulated cDNA fragment by DHT in LNCaP cells. This fragment was cloned and expressions of this fragment in prostate cancer cell lines were analyzed by RT-PCR. Sequence analysis revealed that a cDNA fragment is identical to protein tyrosine phosphatase LAR related gene, liprin-alpha2. liprin-alpha2 was downregulated by dihydrotestosterone (DHT) in LNCaP cells in a time- and androgen concentration-dependent manner. Downregulation by DHT was not inhibited by the protein synthesis inhibitor cycloheximide. This liprin-alpha2 gene was not expressed in androgen independent prostate cancer cell lines PC-3 and DU-145 at the mRNA level. And also, we first revealed here that liprin-alpha2 mRNA is expressed in LNCaP cells as well as human prostate cancer tissues and normal prostate tissues. These data suggest that liprin-alpha2 might play a role in androgen responsive human prostate cancer cell line as well as human prostate cells, and the loss of this gene expression might be associated with the androgen independent characteristics of prostate cancer.     

差异显示技术对变异链球菌生物膜基因表达差异的分析

目的 对生物膜和浮游状态下的变异链球菌细胞进行比较研究,采用限制性酶切差异显示技术比较分析两者的基因表达谱.方法 分别收集变异链球菌浮游菌细胞与贴壁的生物膜细胞,分离纯化总RNA,对于逆转录获得的cDNA进行限制性酶切差异显示PCR技术（RFDD-PCR）比较分析两者的表达谱,对于获得的差异表达片段通过克隆测序并于BLAST比对获得这些片段的基因信息,进而推断其功能.结果 通过对差异片段的分析,确证其中4条片段分属结构基.fruA、SMU.438c、SMU.751与adhB/C.结论 限制性酶切差异显示技术可用于分析生物膜形成过程中基因表达的差异.     

实验性脑脓肿组织中G蛋白信号系统相关基因的克隆

目的 筛选和克隆实验性脑脓肿的早期相关基因，研究脑组织对病原菌的免疫反应过程中所涉及的分子机制。方法通过脑组织内直接注射金黄色葡萄球菌获得大鼠脑脓肿，利用mRNA荧光差异显示PCR技术比较脑脓肿组脑组织中mRNA的表达与正常对照组、手术对照组之间的差异，获得的差异表达cDNA片段经克隆、测序及BLAST软件进行同源性比较分析，并采用Noahem杂交和RT-PCR进行鉴定。结果共获得25条差异表达的cDNA条带，经Noahem杂交和RT-PCR鉴定其中17条为阳性（阳性率为68％）。克隆和测序结果显示其中3个差异表达片段与G蛋白相关的细胞信号传导系统有关：片段G18-1代表的鸟苷二磷酸解离抑制因子3（GD13）、片段G20-1代表的交集素（ITSN）以及片段C2-1代表的Ras相关蛋白（Rap1）。结论在实验性脑脓肿早期GD13、ITSN和Rap1差异表达，推导G蛋白信号系统的激活可能与脑脓肿的发病相关。     

卵巢癌相关基因的克隆

目的：筛选和克隆卵巢上皮癌相关基因。方法：用3种锚定引种和8种随机引物,共24种组合进行PCR扩增,通过DD－RTPCR分析正常卵巢上皮和卵巢上皮癌mRNA的基因表达差异,将差异片段分离出来,并回收,克隆和进行斑点杂交鉴定、DNA序列测定,并通过国际互联网张检索GenBank进行同源性分析。结果：获得30个差异表达的片段,经斑点杂交初步筛选,克隆11个差显示的阳性片段。选取其中的5个进行序列分析。结论计算机同源性分析表明,5个均为新基因片段,已收录GenBank。     

Identification of differentially expressed transcripts in the human pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis by differential display.

Paracoccidioides brasiliensis is a dimorphic human pathogenic fungus that is the causal agent of paracoccidioidomycosis, a systemic disease that predominantly affects rural communities in South and Central America. Dimorphism is a common characteristic of systemic human pathogenic fungi. Here we describe the use of differential display (DD) to isolate and identify differentially expressed genes of P. brasiliensis, in the two cell types, yeast (Y) and mycelium (M), as well as at different time intervals during temperature-induced M to Y transition. Using two oligo-deoxythymidine-anchored primers combined with 10 arbitrary ones, we were able to detect the presence of at least 20 differentially transcribed cDNA fragments. Some of these fragments were further analysed by reverse-northern blot and northern blot in order to confirm their differential expression. The M32, M51 and M73 cDNA fragments were specific for the mycelial form of P. brasiliensis. Furthermore, we found two cDNA fragments (M-Y1 and M-Y2) that were upregulated during M-Y transition. This method was efficient and useful in the detection of differentially expressed genes in P. brasiliensis.     

骨质疏松症骨组织cDNA差减文库的构建

目的构建人抑制差减文库,为筛选骨质疏松骨相关基因奠定基础。方法分别从正常骨和骨质疏松症骨组织分离mRNA并反转录成cDNA,酶切后骨质疏松cDNA分成两组,分别与不同的接头连接。经过两轮差减杂交和两次抑制性PCR后得到两者之间差异表达的cDNA挑取克隆进行PCR扩增鉴定。结果成功地构建了骨质疏松相关的的差减cDNA文库,获得的正、反向差减文库分别含652、345个重组子;插入片段的平均大小为526bp。结论该差减cDNA文库的建立为进一步在分子水平上阐明骨质疏松症的分子机制奠定了基础。