高糖对成骨细胞MC3T3-E1凋亡和氧化应激的影响

目的评价高糖环境对成骨细胞MC3T3-E1凋亡和氧化应激的影响,为临床治疗糖尿病骨质疏松症提供实验基础。方法在细胞培养瓶中加入不同浓度高糖溶液(0、20、40、80 mmol/L)培养成骨细胞株MC3T3-E1,24 h后分别采用CCK-8测定其细胞存活率、细胞凋亡率,线粒体膜电位试剂盒测定其去极化程度,半胱天冬酶-3(Caspase-3)试剂盒检测其活性,DCFH-DA荧光探针检测ROS的生成。在80 mmol/L高糖环境暴露,MC3T3-E1细胞在抗氧化剂NAC作用下,采用上述方法测其线粒体膜电位和Caspase-3含量。结果与对照组相比,成骨细胞MC3T3-E1在高糖暴露下的存活率和线粒体膜电位下降,细胞凋亡率、细胞活性氧水平和Caspase-3活性增强,且都存在剂量依赖性;抗氧化剂NAC抑制高糖引起MC3T3-E1细胞线粒体膜电位降低和Caspase-3增高。结论高糖环境下,NAC通过抑制高糖引起的氧化应激,降低细胞凋亡率,保护成骨细胞MC3T3-E1。     

氢氟酸烧伤中毒对兔外周血单个核细胞凋亡与胞内钙浓度的影响

目的: 研究氢氟酸烧伤中毒对兔外周血单个核细胞(PBMC)早期凋亡百分率和胞内游离钙浓度([Ca²⁺]_i)的影响。方法: 用流式细胞仪检测兔烧伤染毒前后外周血单个核细胞的Annexin V变化, 以观察其早期凋亡百分率。用Fluo-3/Am荧光探针观察烧伤染毒前后外周血单个核细胞内Ca²⁺平均荧光强度值的变化, 以观察细胞内[Ca²⁺]_i的变化。 结果: 12只烧伤中毒兔外周血单个核细胞早期凋亡百分率显著增加, 烧伤染毒前后比较P<0.01。而12只烧伤中毒兔中8只染毒后1 h外周血单个核细胞内[Ca²⁺]_i显著降低, 烧伤染毒前后比较P<0.05。其余4只却表现[Ca²⁺]_i染毒前后比较P>0.05。 结论: 本实验氢氟酸烧伤中毒使兔外周血单个核细胞早期凋亡百分率显著增加, 外周血单个核细胞内[Ca²⁺]_i却显著降低。提示氢氟酸烧伤中毒引导的细胞凋亡并非细胞内[Ca²⁺]_i增加所引发。     

3种钙激动剂促培养的大鼠血管平滑肌细胞增殖

目的：探讨不同来源的细胞内钙离子（[Ca²⁺]i）对血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）介导的增殖反应的作用。方法：以培养的大鼠VSMCs为靶细胞,用血管紧张素II（Ang Ⅱ）剌激VSMCs跨膜Ca²⁺内流、三磷酸肌醇（IP₃）和雷尼丁（RY）剌激胞内Ca²⁺释放,[γ-³² P]-ATP掺入法和免疫印迹（Western blot）测MAPK活性及蛋白含量,氚-亮氨酸（[³H]-Leu）、氚-胸腺嘧啶（[³H]-TdR）掺入量作为VSMCs增殖的指标。结果：Ang Ⅱ、IP₃和RY均能显著增加VSMCs的[Ca²⁺]i浓度、MAPK活性及蛋白含量,并提高[³H]-Leu、[³H]-TdR掺入量,与对照组VSMCs相比差异显著（P<0.01）。结论：钙激动剂诱导的MAPK活性及含量的增加参与了VSMCs的增殖,VSMCs的肥大增殖与[Ca²⁺]i浓度增加有关,而与[Ca²⁺]i的来源无关。     

一氧化氮对成纤维细胞内游离Ca2+浓度的影响

目的: 研究一氧化氮(NO)对成纤维细胞内游离Ca²⁺浓度的影响。方法: 体外培养人胚肺成纤维细胞(HLF), 给予NO前体-L-精氨酸(L-Arg)及一氧化氮合酶(NOS)抑制剂-硝基-L-精氨酸(L-NNA), 采用比色法测定细胞培养液NO水平, 采用Fura-2/AM荧光法测定细胞内游离Ca²⁺浓度, 观察NO对成纤维细胞内游离Ca²⁺浓度的影响。结果: 随着细胞培养液NO水平逐渐升高, 成纤维细胞内游离Ca²⁺浓度逐渐升高[实验组NO水平、Ca²⁺ 浓度比正常对照组NO水平、Ca²⁺浓度分别为(3.82±0.53) mol/L比(2.62±0.55) mol/L和(894.48±93.01) nmol/L比(824.56±33.22) nmol/L, P<0.05]; 但进一步升高NO水平, Ca²⁺浓度却逐渐降低[实验组NO水平、Ca²⁺浓度比正常对照组NO水平、Ca²⁺浓度分别为(5.82±0.45) mol/L比(2.62±0.55) mol/L和(162.11±68.50) nmol/L比(824.56±33.22) nmol/L, P<0.01]。结论: NO对成纤维细胞内游离Ca²⁺浓度具有双向调节作用。即低水平NO升高细胞内游离Ca²⁺浓度, 高水平NO降低细胞内游离Ca²⁺浓度。     

缺氧复氧对人心房肌细胞内钙离子浓度的影响

目的和方法:观察缺氧、复氧对人心房肌细胞内钙离子浓度的影响。急性分离人心房肌细胞,以Fluo-3作为Ca²⁺指示剂,用激光共聚焦显微镜观察细胞内Ca²⁺浓度变化。结果:人心房肌细胞在缺氧前[Ca²⁺]ⁱ为(117±48)nmol/L。在缺氧15 min时,[Ca²⁺]ⁱ即增加为(187±64)nmol/L(P<0.05,vs缺氧前)。缺氧30 min时[Ca²⁺]ⁱ为(417±139)nmol/L(P<0.01,vs缺氧前)。缺氧后复氧30 min[Ca²⁺]ⁱ为(786±238)nmol/L(P<0.01,vs缺氧前)。结论:人心房肌细胞在缺氧状态下胞内Ca²⁺浓度升高,而当其短期复氧时,胞Ca²⁺浓度继续增加。     

Caveolin-1介导流体剪切应力调控MC3T3-E1成骨细胞增殖和凋亡

背景：流体剪切应力在成骨细胞增殖和凋亡中起着重要作用。然而,Caveolin-1(Cav-1)是否参与成骨细胞中流体剪切应力诱导的增殖与凋亡过程尚不清楚。目的：探讨Cav-1在流体剪切应力调控成骨细胞增殖和凋亡中的作用。方法：选择生长状态良好的MC3T3-E1成骨细胞,加载不同时间(0,30,60,90 min)且强度为1.2 Pa的流体剪切应力,观察Cav-1蛋白的表达,筛选出时间为60 min的条件进行实验。将MC3T3-E1细胞分为：对照组、流体剪切应力组、流体剪切应力+pcDNA 3.1组(对照)、流体剪切应力+pcDNA Cav-1组(过表达质粒),分别采用流体剪切应力和过表达Cav-1等方式干预,通过q RT-PCR和Western blot检测MC3T3-E1细胞内增殖以及凋亡相关分子的表达量;通过CCK-8与Ed U实验检测MC3T3-E1细胞增殖活性;采用Hoechst 33258染色以及流式细胞术检测MC3T3-E1细胞凋亡情况。结果与结论：加载流体剪切应力后MC3T3-E1细胞中Cav-1的表达显著下调,且加载60 min表达水平最低。过表达Cav-1减弱了流体剪...     

枸杞多糖含药血清对MC3T3-E1细胞内Ca2+及Ⅰ型胶原蛋白合成的影响*

背景：前期实验发现枸杞多糖对成年去势雌性大鼠骨质疏松有明显的骨质改善作用。 目的：观察含枸杞多糖大鼠血清对成骨细胞株MC3T3-E1细胞内Ca2+及Ⅰ型胶原蛋白合成的影响。 方法：将20%空白血清(对照组),5%,10%,20%含枸杞多糖血清分别加入成骨细胞株MC3T3-E1细胞培养液中,通过MTT法测定细胞增殖,激光扫描共聚焦显微镜测定胞内游离钙离子浓度,免疫细胞化学方法检测Ⅰ型胶原蛋白表达。 结果与结论：与对照组比较,5%,10%含枸杞多糖血清可明显促进成骨细胞株MC3T3-E1细胞增殖(P < 0.05,P < 0.01);10%,20%含枸杞多糖血清组成骨样细胞株MC3T3-E1内细胞内Ca2+水平及Ⅰ型胶原蛋白合成明显升高(P < 0.05,P < 0.01)。说明含枸杞多糖血清可能通过影响细胞内Ca2+水平及Ⅰ型胶原蛋白合成防治骨质疏松症。关键词：枸杞多糖;骨质疏松;成骨细胞;Ⅰ型胶原蛋白;组织构建与中医药 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.20.030     

miR-455-3p靶向HIPK2调控高糖环境下成骨细胞的增殖和凋亡

文题释义： 糖尿病性骨病：糖尿病可导致骨代谢发生改变,表现为骨形成缺陷、成骨细胞数量减少、骨基质形成不足。高糖环境下以成骨细胞功能改变最为显著,高糖诱导成骨细胞是研究糖尿病性骨病的常用细胞模型。 成骨作用：指成骨细胞移至将要合成骨组织的部位,分泌、合成骨胶原及骨蛋白纤维,将钙、磷吸收到纤维孔隙中进行沉淀结晶,形成骨组织的过程。 背景：以往研究表明多种miRNA在骨形成中发挥作用,miR-335-5p可保护成骨细胞免受氧化应激,对枸橼酸铁铵诱导的成骨细胞具有保护作用,但miR-335-5p对高糖环境下成骨细胞增殖和凋亡的影响尚未可知。 目的：探讨miR-455-3p靶向HIPK2对高糖环境下成骨细胞增殖和凋亡的影响。 方法：双荧光素酶报告基因分析法验证miR-455-3p对HIPK2的靶向作用。体外用高糖诱导MC3T3-E1细胞,分为空白组、高糖组、高糖+miR-control组、高糖+miR-455-3p组、高糖+si-control组、高糖+si-HIPK2组、高糖+miR-455-3p+pcDNA组和高糖+miR-455-3p+pcDNA-HIPK2组。qRT-PCR检测miR-455-3p和HIPK2 mRNA的表达,MTT法检测细胞存活率,流式细胞检测细胞凋亡,Western blot检测HIPK2、p-STAT3和STAT3蛋白的表达。 结果与结论：①HIPK2是miR-455-3p的靶基因,miR-455-3p可负性调控HIPK2的表达;②高糖处理可抑制miR-455-3p的表达,促进HIPK2的表达;③过表达miR-455-3p或抑制HIPK2表达均可促进高糖条件下MC3T3-E1细胞的存活和抑制凋亡;④过表达HIPK2可部分逆转miR-455-3p对高糖条件下成骨细胞的存活促进和凋亡抑制作用;⑤miR-455-3p通过调控HIPK2抑制成骨细胞中p-STAT3的表达;⑥结果表明,miR-455-3p通过靶向下调HIPK2抑制高糖诱导的成骨细胞凋亡,促进成骨细胞增殖,这可能与抑制STAT3信号通路有关。 ORCID: 0000-0001-7129-8455(匡嘉兵) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程     

红景天甙对缺氧/缺糖损伤的SH-SY5Y细胞线粒体膜电位的影响

目的:观察红景天甙对SH-SY5Y 细胞缺氧/缺糖损伤时细胞内[Ca²⁺]i、细胞凋亡率、细胞线粒体膜电位和活性的变化,探讨其对神经细胞线粒体膜电位的影响。方法:应用细胞培养,四唑盐比色实验( MTT )检测细胞线粒体活性,流式细胞术检测细胞内[Ca²⁺]i、细胞凋亡百分率和线粒体膜电位。结果: SH-SY5Y细胞缺氧/缺糖损伤2、4、6、12 h后,细胞内[Ca²⁺]i和细胞凋亡百分率明显高于对照组, 均有显著差异(P<0.01);细胞经缺氧/缺糖处理后,线粒体膜电位和活性明显低于对照组,2 h时分别为29.17%(P<0.01),38.80% (P<0.01), 12 h时分别为56.72%(P<0.01), 63.58% (P<0.01);红景天甙能显著降低细胞内[Ca²⁺]i,抑制细胞凋亡的发生,提高线粒体膜电位和活性,与缺氧/缺糖损伤组相比均有显著差异(P<0.05,P<0.01)。结论:红景天甙可抑制缺氧/缺糖损伤所致的线粒体膜电位和活性的降低,从而具有稳定线粒体膜电位的作用,抑制细胞凋亡的发生,这种作用可能与其能抑制神经细胞内钙超载有关。     

不同时间局灶性脑缺血/再灌损伤时活体脑片Ca2+的变化

目的:通过检测不同时间局灶性脑缺血 /再灌损伤时活体脑片Ca²⁺ 的变化,希望揭示Ca²⁺ 在体水平脑缺血 /再灌损伤机制。方法:用插线法制作局灶性脑缺血 /再灌损伤模型,激光扫描共聚焦显微镜观察活体脑片细胞内Ca²⁺ 的分布及动态变化。结果:①随着缺血时间的延长,皮质及纹状体区域脑片细胞内Ca²⁺ 含量逐渐增加;②缺血1h后再灌注10min可引起脑片纹状体区域细胞内Ca²⁺ 含量明显增加,但将再灌时间延长至 3h,Ca²⁺ 含量较灌注10min为低;③缺血 6h皮质及纹状体区域脑片细胞内Ca²⁺ 含量明显多于缺血1h,再灌注 3h后,细胞内Ca²⁺ 含量有所下降,但仍高于假手术组;④纹状体对缺血 /再灌注损伤比皮质敏感。结论:在脑缺血再灌注损伤中,皮质、纹状体部位的Ca²⁺ 起重要作用.     

焦亡介导高糖引起的小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1炎症与损伤

目的:探讨细胞焦亡(pyroptosis)能否介导高糖(HG;45 mmol/L葡萄糖)引起的小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1炎症和损伤。方法:应用细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测成骨细胞活力;Western blot测定成骨细胞的核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)和胱天蛋白酶1(CASP1)的表达水平;ELISA法测定细胞培养上清液中白细胞介素18(IL-18)和IL-1β的水平;2',7'-二氯二氢荧光素二乙酯染色荧光显微镜照相法检测胞内活性氧(ROS)水平;罗丹明123染色荧光显微镜照相法测定线粒体膜电位(MMP)水平;碱性磷酸酶(ALP)试剂盒测定成骨细胞早期标志物ALP的活性;茜素红染色观察成骨细胞晚期标志物矿化结节的形成。结果:HG处理MC3T3-E1细胞24 h可明显促进NLRP3和CASP1的表达,引起IL-18和IL-1β的分泌增多,同时可使细胞活力降低,ROS生成和MMP丢失增加,成骨细胞分化与矿化功能下降(表现为ALP活性降低和矿化结节数量减少)。利用siRNA沉默CASP1表达可显著减轻HG引起的上述成骨细胞炎症和损伤。结论:焦亡可介导HG引起的MC3T3-E1细胞炎症和损伤。     

没食子儿茶素没食子酸酯对1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导的大鼠PC12细胞凋亡的作用

目的： 探讨没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)抑制1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）诱导大鼠PC12细胞凋亡及其抗氧化作用、调节胞浆钙离子稳态与其抑制细胞凋亡作用之间的关系。方法: 培养大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株PC12细胞,给予MPP+诱导细胞凋亡。EGCG（10、50及100 μmol·L-1）预处理0.5 h,再加入MPP+使其终浓度为900 μmol·L-1处理24 h后,MTT法检测细胞存活率,Annexin V-PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡,荧光酶标仪测定细胞内活性氧,激光共聚焦荧光显微镜通过检测细胞内钙的荧光强度、检测细胞胞浆［Ca2+］i的变化,透射电镜观察凋亡细胞线粒体结构形态变化,并测定细胞内超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的含量。结果: MPP+呈剂量依赖性损伤PC12细胞,诱导细胞凋亡发生率达到31.0％。与模型组比较,EGCG处理后,明显提高细胞活力,降低凋亡细胞率,同时增强SOD活性、减少MDA和ROS的含量,降低胞浆［Ca2+］i浓度,减轻MPP+诱致的细胞线粒体改变。结论: EGCG具有抑制MPP+诱导的PC12细胞凋亡的作用,其作用机制可能与其提高细胞抗氧化能力和减少胞浆［Ca2+］i有关。     

波动性葡萄糖对胰岛细胞凋亡及PTEN表达的影响

目的:研究细胞凋亡是否与PTEN表达升高相关,并探讨PTEN表达升高是否通过活性氧簇(ROS)进行调控。方法:细胞分为5组:恒定低糖组(L组)、恒定高糖组(H组)、葡萄糖波动组(F组)、高糖后低糖组(HL组)及波动后低糖组(FL组)。检测各组ROS水平、细胞凋亡率、细胞内钙离子浓度、胰岛素水平和PTEN蛋白的表达。结果:F组较H、L组钙离子浓度升高,胰岛素分泌减少,ROS水平升高,PTEN蛋白表达增加,细胞凋亡增多(P0.05)。HL组较H组钙离子浓度、ROS水平、PTEN蛋白表达和凋亡率有所下降,但仍高于L组(P0.05)。FL组较F组钙离子浓度、ROS水平、PTEN蛋白表达和凋亡率有所下降,但仍高于低糖组(P0.05)。结论:波动性葡萄糖较恒定高糖更易导致胰岛细胞凋亡,可能与细胞内钙离子浓度变化,加重氧化应激促进PTEN表达增加有关。葡萄糖浓度恢复可一定程度解除氧化应激,使PTEN表达减少,细胞损伤减轻。     

SeO2诱导白血病细胞凋亡过程中对细胞内活性氧和Ca2+水平影响

目的：研究SeO2对急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4、红白血病细胞K562、急性粒细胞白血病细胞株HL-60的增生、凋亡、活性氧(ROS)及Ca2+水平等的影响。 方法： 采用不同浓度SeO2（3-30 μmol/L）分别处理3种白血病细胞，用流式细胞术测定细胞凋亡率、细胞中ROS和Ca2+的水平。 结果： 10和30 μmol/L SeO2能抑制3种细胞增生，30 μmol/L SeO2作用48 h能使54.0%的NB4细胞、46.5%的K562细胞和49.6%的HL-60细胞发生凋亡。同时下调细胞内ROS和Ca2+水平。NB4和HL-60细胞中ROS阳性细胞比例随SeO2浓度增加而减少，K562中只有30 μmol/L SeO2才能使ROS出现明显下降。10、30 μmol/L SeO2能使NB4和HL-60细胞内Ca2+水平逐步下降。K562中只有30 μmol/L SeO2才能使细胞内Ca2+水平出现明显下降。 结论： SeO2对3种白血病细胞均有诱导凋亡作用，在凋亡过程中涉及细胞内ROS及Ca2+水平下降。     

长春新碱诱导的自噬性凋亡与细胞内游离Ca~(2+)浓度的相关性研究

目的　研究长春新碱 (VCR)诱导的L 0 2细胞自噬性凋亡时细胞内游离钙离子浓度 ([Ca2 +]i)的变化 ,以及自噬特异性抑制剂 3 methyladenine(3MA)对此自噬性凋亡和 [Ca2 +]i的影响。方法　应用已建立的VCR诱导L 0 2细胞自噬性凋亡模型 ,使用电镜、流式细胞术检测细胞凋亡 ;用Fluo 3/AM荧光探针经流式细胞仪测定L 0 2细胞平均 [Ca2 +]i。结果　电镜及流式细胞术检测证实VCR诱导L 0 2细胞发生了自噬性凋亡 ,此凋亡过程中 [Ca2 +]i明显升高 ,以凋亡早期更为明显 :3MA可显著抑制VCR所致的 [Ca2 +]i升高并能降低凋亡细胞比例。结论　在体外条件下VCR可以诱导L 0 2细胞自噬性凋亡 ,其发生可能与VCR导致 [Ca2 +]i升高有关 ;3MA可能通过抑制 [Ca2 +]i升高而抑制自噬及VCR所致的自噬性凋亡。     

Tmed2促进体外小鼠前成骨细胞MC3T3-E1增殖

 摘要：目的 研究Tmed2基因对小鼠前成骨细胞增殖的影响。 方法 1.分别在小鼠MC3T3-E1细胞中过表达和抑制Tmed2,检测细胞增殖情况。2. 用雌激素处理细胞后,检测细胞的增殖及Tmed2基因的表达量。荧光实时定量PCR检测mRNA水平,MTS法检测细胞活力和增殖,流式细胞术检测细胞周期,Western blot法检测蛋白水平。结果 过表达Tmed2使MC3T3-E1细胞的增殖速度加快,细胞周期中S期细胞比例明显增加,且Cyclin A 的表达升高。而抑制Tmed2基因表达使MC3T3-E1细胞的增殖速度减慢。雌激素处理使细胞增殖速度加快的同时,Tmed2基因的表达显著增高。结论 Tmed2通过上调Cyclin A 的表达,使S期细胞比例增加,加快小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的增殖。此外,Tmed2的表达受雌激素的调控,可能参与雌激素促进MC3T3-E1细胞增殖的作用。     

纳米壳聚糖对MC3T3-E1成骨细胞生长的影响

背景：已有体内急性毒理实验证实,壳聚糖纳米微囊的半数致死量高于2 000 mg/kg,但其具体致病机制目前尚不明确。 目的：分析纳米壳聚糖作为骨替代材料对MC3T3-E1成骨细胞生长及大鼠肝、肾等器官生理功能的影响。 方法：将MC3T3-E1成骨细胞分别在含0(对照)、10 mg/L、100 mg/L、1 g/L、10 g/L纳米壳聚糖的DMEM培养液中培养,检测各组细胞A值。透射电镜观察10 g/L纳米壳聚糖溶液培养MC3T3-E1成骨细胞24 h后的细胞形态变化。采用PBS制备10 g/L纳米壳聚糖悬浮液,分别以166.67,16.67 mg/kg经腹腔注射至SD大鼠体内4周,每周3次,正常对照组注射等量生理盐水,血清生化指标分析大鼠肝、肾功能,病理切片观察组织形态学改变、炎症细胞浸润情况。 结果与结论：与对照组比较,10 mg/L、100 mg/L、1 g/L、10 g/L的纳米壳聚糖溶液均抑制MC3T3-E1细胞的生长(P < 0.05)。透射电镜见团聚的壳聚糖存在于MC3T3-E1细胞浆中,细胞表面的伪足形成,细胞膜呈波浪状起伏,细胞核变性、碎裂及固缩。与正常对照组比较,注射纳米壳聚糖悬浮液两组大鼠血尿素氮、Na+水平均有明显升高(P < 0.05),高剂量组K+水平明显降低(P < 0.01);肝脏、肾脏均出现组织细胞凋亡现象,高剂量组凋亡更加明显。表明纳米壳聚糖可导致细胞凋亡,超过一定剂量可造成肾功能受损,对机体生理功能造成影响。