衰老模型骨髓基质细胞抑制造血细胞增殖分化

目的研究衰老骨髓基质细胞对骨髓造血细胞增殖分化能力的影响,为阐述机体造血微环境衰老对造血干/祖细胞增殖的影响提供实验依据。方法全骨髓贴壁法体外培养大鼠骨髓基质细胞,分为对照组和衰老组。衰老组:常规培养基内加入30 mg/m L D-半乳糖作用48 h。CCK-8法测定BMSCs增殖;流式细胞术分析细胞周期;β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色观察衰老BMSCs百分率;Western blot检测P16、P21和P53蛋白表达。骨髓造血细胞与BMSCs共培养,集落计数检测髓系多向性造血祖细胞(CFU-Mix)增殖分化。ELISA检测BMSCs培养上清液中IL-1β、GM-CSF和SCF含量;DCFH-DA流式荧光检测BMSC活性氧簇(ROS)水平;酶学法检测BMSCs内过氧化物丙二醛(MDA)含量和总超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果与对照组相比,D-半乳糖诱导BMSCs衰老,细胞阻滞于G0/G1期(P0.01),增殖能力显著下降,SA-β-Gal染色阳性率升高(P0.01);衰老相关蛋白P16、P21和P53表达明显上调(P0.01)。与衰老BMSCs共培养的骨髓造血细胞增殖分化能力减弱。衰老BMSCs内ROS、MDA氧化损伤指标上升,SOD抗氧化指标下降(P0.01);BMSCs培养上清液IL-1β、GM-CSF和SCF含量明显下降(P0.01)。结论衰老骨髓基质细胞抑制造血细胞增殖、分化能力,其机制可能与骨髓基质细胞氧化损伤,分泌活性因子改变有关。     

骨髓基质细胞衰老对造血细胞衰老的影响

目的探讨骨髓基质细胞(BMSCs)衰老对骨髓造血细胞衰老的影响及其可能的机制。方法贴壁培养大鼠骨髓基质细胞,传代BMSCs至P3代时分组。对照组:常规培养;衰老组:常规培养基础上加入D-半乳糖(D-Gal)诱导BMSCs衰老,两组细胞分别培养48h。收集培养上清液,ELISA法检测细胞因子:粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干细胞因子(SCF)、白细胞介素(IL)-6、IL-1β,IL-2和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量,CCK-8检测细胞增殖能力,衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测BMSCs衰老。分离提取正常骨髓单个核细胞(BMMNCs),在衰老组与对照组BMMSCs上种植正常BMMNCs共培养24h,收集上层悬浮BMMNCs。CCK-8法测定细胞增殖能力;多向造血祖细胞集落(CFU-Mix)半固体培养法检测细胞增殖及分化能力;SA-β-Gal染色观察衰老细胞百分率;流式细胞术分析细胞周期与细胞凋亡;DCFH-DA荧光染色检测细胞活性氧簇(ROS)水平;酶学法检测细胞内丙二醛(MDA)含量和总超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果衰老组BMSCs增殖能力显著下降,SA-β-Gal染色阳性细胞百分率增加,细胞分泌GM-CSF、SCF、IL-6、IL-1β水平明显降低,IL-2、TNF-α水平显著升高。与衰老BMSCs共培养后,BMMNCs的增殖能力显著下降,SA-β-Gal染色阳性细胞百分率显著上升,BMMNCs形成CFUMix集落数量明显降低,细胞周期呈现阻滞且细胞凋亡率上升,细胞内ROS、MDA含量上升,SOD含量下降。结论本实验中D-Gal成功复制了BMSCs衰老,衰老的BMSCs可诱导骨髓造血细胞衰老,其机制可能与BMSCs导致造血细胞氧化损伤有关。     

骨髓基质细胞衰老对造血细胞氧化应激的影响

目的探讨骨髓基质细胞衰老对骨髓造血细胞氧化应激的影响。方法取6~8周雄性健康C57小鼠,全骨髓贴壁法培养骨髓基质细胞(BMSCs),建立衰老骨髓基质细胞体外模型。实验分为常规对照组和衰老组。对照组:常规培养基培养48h;衰老组:常规培养基内加入30g/L D-半乳糖,作用48h。衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测衰老骨髓基质细胞百分率;流式细胞术分析骨髓基细胞周期。骨髓单个核细胞(BMNCs)与骨髓基细胞共培养,锥虫蓝计数BMNCs活细胞数;流式细胞术检测骨髓基细胞周期;髓系多向性造血祖细胞(CFU-Mix)半固体培养集落计数;DCFH-DA荧光染色流式检测BMNCs和骨髓基细胞的活性氧簇(ROS)水平;激光扫描共焦显微术半定量检测骨髓基细胞连接蛋白43(Cx43)表达。结果 D-半乳糖体外诱导骨髓基细胞衰老,骨髓基细胞SA-β-Gal染色阳性率显著上升,细胞周期G1期阻滞。BMNCs与衰老组骨髓基细胞共培养48h,锥虫蓝计数BMNCs活细胞数量下降;细胞周期阻滞;CFU-Mix集落形成数量较对照组显著下降。衰老组骨髓基细胞胞内ROS含量增加,Cx43表达明显下调;与衰老骨髓基细胞共培养的BMNCs胞内ROS含量较与常规对照骨髓基细胞共培养的BMNCs胞内ROS含量上升。结论衰老骨髓基质细胞抑制骨髓造血细胞增殖分化,其机制可能与衰老骨髓基质细胞氧化应激增强,缓解造血细胞氧化应激能力下降有关。     

D-半乳糖诱导大鼠骨髓基质细胞衰老及其机制

目的构建大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)体外和体内衰老模型,观察BMSCs衰老生物学特性。方法体外对照组:常规培养大鼠骨髓BMSCs,取第三代(P3)细胞继续培养48 h;体外衰老组:在对照组基础上加入D-半乳糖(D-Gal,终浓度30 g/L),作用48 h;体内衰老组:大鼠皮下注射D-Gal(120 mg/kg·d),qd×42 d;体内对照组:注射等时等量0.9%氯化钠溶液,模型完成第2天,分离培养BMSCs,取P3细胞进行实验。检测:CCK-8测定细胞增殖;流式细胞术分析周期和凋亡率;β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色观察BMSCs衰老百分率;DCFH-DA荧光流式细胞术检测活性氧簇(ROS)水平,酶学法检测过氧化物丙二醛(MDA)含量和总超氧化物歧化酶(SOD)活性;Western blot检测P16、P21、P53、CDK2和cyclin D表达。结果 D-Gal体外与体内致衰老组BMSCs增殖能力下降;细胞G0/G1期比例增高、S期比例降低(P0.05);SA-β-Gal染色阳性百分率上升(P0.05);胞内ROS、MDA上升,SOD下降(P0.05);P16、P21、P53表达上调,CDK2、cyclin D下调(P0.05)。结论 D-Gal在体内与体外均能构建BMSCs衰老模型,其机制与D-Gal诱导BMSCs氧化损伤和激活衰老信号途径相关。     

氧化低密度脂蛋白通过氧化应激诱导小鼠造血干细胞衰老

 目的 探讨氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）体外诱导造血干细胞(HSCs)衰老的可能机制。方法 用免疫磁性分选法分离纯化小鼠HSC,与ox-LDL共培养,采用β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色检测衰老HSC,流式细胞术检测HSC细胞周期分布,混合集落培养(CFU-Mix)检测HSC混合集落形成能力。流式细胞术和免疫荧光检测HSC产生活性氧（ROS）的量,酶学比色法检测HSC培养上清液超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）及丙二醛（MDA）含量。Southern blot和TRAP-PCR法检测HSC端粒长度和端粒酶活性。结果 ox-LDL诱导HSC呈现典型的衰老生物学表现：SA-β-Gal染色阳性细胞率显著增高（P <0.01）; G0/G1 期比例明显增加,S 期显著减少（P <0.01） ;CFU-Mix数量显著减少（P <0.01）。衰老HSC端粒缩短（P <0.05）,端粒酶活性降低（P <0.05）。衰老HSC ROS含量显著增加（P <0.01）,细胞培养上清液中SOD、GSH-Px活力下降、 MDA含量增加（P <0.05）。 结论 ox-LDL能通过氧化应激诱导HSC衰老,其机制可能与ROS的蓄积及抗氧化酶活性受抑引起端粒功能异常有关。     

三丁基过氧化氢诱导Sca-1+造血干/祖细胞衰老与P16INK4a表达的关系

目的:探讨三丁基过氧化氢(t-BHP)诱导Sca-1+造血干/祖细胞(HSC/HPC)衰老与调控P16INK4a表达的关系,为寻找延缓HSC/HPC衰老方法提供理论和实验依据.方法:免疫磁性分选法分离纯化小鼠Sca-1+ HSC/HPC.用t-BHP诱导Sca-1+ HSC/HPC6h建立体外细胞衰老模型,通过衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色、细胞周期测定和造血祖细胞混合集落(CFU-Mix)培养观察t-BHP诱导Sca-1+ HSC/HPC衰老的生物学作用;逆转录聚合酶链反应检测衰老相关基因p16INK4a mRNA的表达;蛋白免疫印迹检测P16INK4a蛋白的表达.结果:免疫磁性分选法分离纯化的Sca-1+ HSC/HPC纯度可达87.33%±1.25%.衰老组细胞SA-β-Gal染色阳性率和G1期细胞比例高于对照组,生成CFU-Mix数低于对照组,衰老组P16INK4a mRNA及蛋白的表达水平较对照组上调.结论:t-BHP能有效诱导Sca-1+ HSC/HPC衰老,其机制可能与调节P16INK4a mRNA及蛋白的表达有关.     

当归多糖对小鼠衰老造血干细胞细胞周期蛋白的调控

目的观察当归多糖(ASP)对小鼠造血干细胞(HSC)细胞周期调控蛋白表达的影响,探讨ASP调控HSC衰老的可能机制。方法 C57BL/6J小鼠随机分为对照组、衰老组、ASP干预对照组和ASP干预衰老组,衰老组采用X线全身均匀照射,建立小鼠HSC衰老模型;ASP干预衰老组在照射期间给予ASP灌胃;对照组和ASP干预对照组分别给予NS和ASP灌胃。免疫磁珠分离HSC,β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色和混合集落培养(CFU-Mix)观察HSC生物学特性变化;流式细胞术分析细胞周期;Western blot检测P16、P21、CDK2、CDK6、CyclinD及CyclinE表达。结果与对照组比较,X线能显著增加衰老对照组HSC SA-β-Gal染色阳性率、G1期比例及P16、P21表达;降低CFU-Mix、S期比例及CDK6、CyclinD和CyclinE表达。与衰老组比较,ASP能显著抑制衰老HSC SA-β-Gal染色阳性率、G1期比例及P16和P21表达的增加;抑制S期比例、CFU-Mix、CDK6、CyclinD及CyclinE表达的减少;而对CDK2表达无影响。结论 ASP可能通过调节P16、P21、CDK6、CyclinD及CyclinE表达延缓小鼠HSC衰老。     

氯化锂激活Wnt/β-catenin信号通路致小鼠造血干/祖细胞衰老及其机制

目的探讨氯化锂(Li Cl)激活Wnt/β-catenin信号通路致小鼠Sca-1+造血干/祖细胞(Sca-1+HSC/HPC)衰老及其机制。方法免疫磁珠法分离纯化小鼠Sca-1+HSC/HPC。纯化后细胞分为:正常对照组,常规培养;Li Cl组,正常对照组基础上,加入Li Cl(终浓度10mmol/L);D-半乳糖致衰组,正常对照组基础上,加入D-半乳糖(终浓度166mmol/L),各组培养48h。造血祖细胞混合集落(CFU-Mix)培养检测Sca-1+HSC/HPC多向分化潜能,细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测Sca-1+HSC/HPC增殖能力,衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测细胞衰老,免疫细胞化学染色和Western blotting检测细胞内β-catenin、糖原合成激酶3β(GSK-3β)、P53、P21蛋白表达,ELISA检测细胞胞质内8羟基脱氧鸟苷(8-OH-d G)含量。结果与正常对照组相比,Li Cl组与D-半乳糖致衰组Sca-1+HSC/HPC增殖能力下降,形成CFU-Mix数量下降,SA-β-Gal染色阳性细胞百分率增加,β-catenin、P53、P21蛋白表达上调,GSK-3β蛋白表达下调,细胞内8-OH-d G水平升高。结论 Li Cl可通过激活Wnt/β-catenin信号通路,使细胞DNA氧化损伤,上调P53/P21途径,这可能是导致小鼠造血干/祖细胞衰老的机制之一。     

衰老调控因子SIRT6在人参皂苷Rg1延缓造血干/祖细胞衰老中的作用

目的探讨SIRT6在人参皂苷Rg1延缓造血干/祖细胞(HSC/HPC)衰老中的作用。方法三丁基过氧化氢(t-BHP)诱导Sca-1+HSC/HPC衰老,构建HSC/HPC衰老体外模型,Sca-1+HSC/HPC连续移植3代,构建HSC/HPC衰老体内模型。给予体内外衰老模型Rg1预防和治疗衰老。造血祖细胞混合集落(CFU-Mix)培养,细胞周期分析和衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色,分析Rg1体内外调控Sca-1+HSC/HPC衰老的作用。荧光定量PCR及Western blot检测衰老调控因子SIRT6 mRNA及蛋白的表达。结果与体内外衰老模型组相比,Rg1治疗及预防衰老处理后Sca-1+HSC/HPC G0/G1期细胞比例、SA-β-Gal染色阳性率下降(P0.05),CFU-Mix数量升高(P0.05);SIRT6 mRNA及蛋白表达上调(P0.05);Rg1预防衰老组各指标变化均较Rg1治疗衰老组明显。结论Rg1在体内外均可通过调控SIRT6发挥其延缓Sca-1+HSC/HPC衰老的作用。     

人参皂苷Rg1在造血干/祖细胞连续移植中对延缓细胞衰老的作用与去乙酰化酶6/核因子-κB信号轴的关系

目的探讨人参皂苷Rg1在造血干/祖细胞(HSC/HPC)连续移植中对抗细胞衰老的作用与去乙酰化酶6/核因子-κB(SIRT6/NF-κB)信号轴的关系。方法免疫磁性分选法分离纯化雄性供体小鼠干细胞抗原阳性(Sca-1+)HSC/HPC,连续移植3代构建HSC/HPC衰老体内模型。60Coγ射线致死剂量辐射雌性受体鼠后分4组,照射对照组;衰老模型组;Rg1治疗衰老组;Rg1预防衰老组。造血祖细胞混合集落(CFU-Mix)培养,细胞周期分析和衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色分析Rg1体内调控Sca-1+HSC/HPC衰老的作用。实时定量PCR及Western blotting检测衰老调控分子SIRT6、NF-κB mRNA及蛋白的表达。结果连续移植后受体鼠Sca-1+HSC/HPC出现细胞衰老特征,随移植代数的增加,Sca-1+HSC/HPC G0/G1期细胞比例及SA-β-Gal染色阳性率增高,CFU-Mix数量下降。与同代衰老模型组相比,Rg1治疗衰老组及Rg1预防衰老组受体鼠Sca-1+HSC/HPC G0/G1期细胞比例、SA-β-Gal染色阳性率下降,CFU-Mix数量升高;SIRT6 mRNA及蛋白表达上调,NF-κB mRNA及蛋白表达下调;Rg1预防衰老组各指标变化均较Rg1治疗衰老组明显。结论 Rg1可能通过调控SIRT6/NF-κB信号轴发挥其对抗连续移植过程中Sca-1+HSC/HPC衰老的作用。     

当归多糖对衰老模型大鼠骨髓造血功能的影响及其机制

目的 探讨当归多糖（ASP）对衰老模型大鼠骨髓造血功能的影响及其机制。方法 6~8周雄性SD大鼠40只,随机分为正常组（n=10）、ASP正常组（n=10）、衰老模型组（n=10）和ASP衰老模型组（n=10）。药物注射完成第2天,取眼球血检测外周血常规,取股骨测定每根股骨骨髓单个核细胞（BMNCs）总数;CCK8测定BMNCs增殖能力;流式细胞术检测BMNCs增殖周期与活性氧簇（ROS）含量;造血祖细胞混合集落（CFU-Mix）培养检测BMNCs形成集落能力;衰老β半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色观察衰老BMNCs百分率;酶学法检测细胞总抗氧化能力（T-AOC）;Western blotting检测P53和P21蛋白表达;激光扫描共焦显微镜检测P53蛋白表达及定位。 结果 与衰老模型组比较,ASP衰老模型组外周血红细胞、血小板和白细胞总数下降得到抑制;股骨BMNCs细胞数升高;增殖能力提高;形成CFU-Mix数增加;SA-β-Gal染色阳性BMNCs百分率显著降低; G₁期细胞比例降低,S期细胞比例升高,细胞内ROS含量显著降低; T-AOC升高: P53和P21表达显著上调。 结论 ASP能延缓或拮抗D-半乳糖致大鼠骨髓造血细胞衰老,其机制可能与ASP抑制氧化应激,下调p53/p21通路有关。     

叔丁基对苯二酚激活骨髓间充质干细胞蛋白酶体活性延缓复制性衰老

目的:探讨叔丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone,t BHQ)在延缓骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)复制性衰老进程中的作用,以期为细胞移植治疗提供数量充足的种子细胞。方法:30μmol/L t BHQ持续作用于体外传代晚期BMSCs 4周,化学发光法测量蛋白酶体活性;CCK-8法检测细胞活力;Brd U掺入实验检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期分布;衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-Gal)染色检测衰老细胞百分比;Western blot检测衰老相关蛋白P53表达变化。结果:30μmol/L t BHQ持续作用于传代晚期BMSCs 4周后,蛋白酶体活性较DMSO溶剂对照组上调(21.96±1.98)%(P0.05)。CCK-8法显示随t BHQ浓度增加,细胞活力逐渐升高,至40μmol/L达到平台期,且至120μmol/L未见明显细胞毒性。Brd U掺入实验显示t BHQ组阳性细胞率与DMSO溶剂对照组比较,细胞增殖能力显著提高(P0.05);t BHQ组细胞增殖指数也显著高于DMSO组(P0.05)。t BHQ组SA-β-Gal阳性率较DMSO溶剂对照组显著降低(P0.01),且衰老相关蛋白P53表达量也较对照组下降(P0.05)。结论:t BHQ能够通过提高蛋白酶体活性延缓因蛋白酶体功能障碍引起的BMSCs复制性衰老进程。     

当归多糖对衰老模型大鼠脾脏结构与功能的影响

目的 探讨当归多糖（ASP）对衰老模型大鼠脾脏结构与功能影响及其机制。 方法 SD大鼠随机分为正常对照组,ASP对照组,衰老模型组,ASP衰老模型组,每组10只。衰老模型组皮下注射D-半乳糖（120mg/kg）qd×42d;ASP衰老模型组注射D-半乳糖的剂量与时间同衰老模型组,第15天起腹腔注射ASP (100 mg/kg) qd×28d;正常对照组皮下注射等量生理盐水qd×42d;ASP对照组注射等量生理盐水qd×14d,第15天起腹腔注射ASP（同ASP衰老模型组)。药物注射完成后第2天,取脾脏测定脾指数,石蜡切片观察脾脏显微形态学;衰老β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色观察脾细胞百分率,CCK8测定脾细胞对刀豆蛋白A刺激的增殖能力;流式细胞术检测脾细胞周期与活性氧簇（ROS）含量; ELISA检测脾细胞分泌TNF-α、GM-CSF能力与丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶(SOD)含量;Western blotting 检测衰老相关蛋白P53、P21、RB蛋白表达。 结果 与正常对照组比较,D-半乳糖致衰老模型组大鼠脾指数,脾脏白髓面积比例,脾细胞对刀豆蛋白A刺激的增殖能力,S期比例及TNF-α、GM-CSF的分泌能力,SOD活性明显降低;脾细胞的SA-β-Gal阳性率,G₁期与G₂/M期细胞比例,ROS、MDA含量,P53、P21、RB蛋白表达显著增高。与衰老模型组比较,ASP使D-半乳糖致衰老模型大鼠脾指数,脾脏白髓面积比例,脾细胞对刀豆蛋白A刺激的增殖能力,S期比例与TNF-α、GM-CSF的分泌能力,SOD活性明显提高;脾细胞SA-β-Gal阳性率,G₁期及G₂/M期细胞比例,ROS、MDA含量,P53、P21、RB蛋白表达有显著抑制作用。
结论 D-半乳糖复制的衰老模型大鼠脾脏结构与功能损伤明显,当归多糖对其致衰损伤有明确的保护作用。     

CD73对骨髓间充质干细胞增殖与衰老的影响

目的探讨CD73对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖与衰老的影响。方法培养小鼠BMSCs,构建慢病毒CD73过表达载体和CD73 RNAi干扰载体,分别转染BMSCs,实验分组:CD73过表达组(OE组)、CD73RNAi干扰组(RNAi组)和对照组(CON组)。衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测细胞的衰老情况;MTT法检测细胞增殖能力变化;流式细胞术检测细胞周期变化;透射电子显微镜观测转染后细胞的超微结构;非损伤细胞功能分析仪检测细胞生长曲线。结果慢病毒转染BMSCs后72 h和168 h,衰老细胞数量RNAi组CON组OE组(P0.05);转染后3~4d BMSCs的增殖能力为OE组较RNAi组和CON组细胞增殖速度快(P0.05);转染后3d各组细胞周期的变化是:OE组、RNAi组和CON组的G1期细胞所占比例分别为25.9%、44.1%和51.7%;S期细胞所占比例分别为48.8%、30.9%和26.9%;G2期细胞所占比例分别为25.2%、25.0%和21.4%;透射电子显微镜观察结果显示,OE组细胞质内粗面内质网和核糖体增多;细胞生长曲线显示OE组高于CON组和RNAi组。结论 CD73促进BMSCs增殖且抑制BMSCs衰老。     

硫化氢通过调节Sirt1/eNOS信号通路延缓人脐静脉内皮细胞衰老

目的:我们既往研究已证实外源性硫化氢能够延缓内皮细胞衰老,本研究拟进一步探讨沉默信息调节因子1(Sirt1)与内皮型一氧化氮合酶(e NOS)系统对硫化氢抗内皮细胞衰老作用的影响。方法:建立葡萄糖(33 mmol/L)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)衰老模型,根据细胞活力、衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色阳性率和纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)的表达水平评估HUVECs衰老;同时采用RNA干扰技术抑制Sirt1蛋白表达,检测e NOS表达及衰老相关指标。结果:HUVECs经高糖处理后,细胞活力减低,SA-β-Gal阳性细胞比例增加,PAI-1表达增高,Sirt1及e NOS表达均明显减少(P0.05);与高糖处理组比较,100μmol/L硫氢化钠(硫化氢供体)处理组的细胞活性增加,SA-β-Gal染色阳性细胞比例及PAI-1蛋白表达显著下降,Sirt1及e NOS蛋白表达增加,NO含量增加(P0.05)。与硫化氢处理组比较,Sirt1 siRNA处理后e NOS表达减少,PAI-1表达增加,SA-β-Gal染色阳性细胞数目增多,NO含量减少(P0.05或P0.01)。结论:硫化氢通过上调Sirt1、增加e NOS表达而促进NO的合成,从而抵抗高糖诱导的HUVECs衰老。     

Ectopic bone regeneration by human bone marrow mononucleated cells, undifferentiated and osteogenically differentiated bone marrow mesenchymal stem cells in beta-tricalcium phosphate scaffolds

Tissue engineering approaches using the combination of porous ceramics and bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) represent a promising bone substitute for repairing large bone defects. Nevertheless, optimal conditions for constructing tissue-engineered bone have yet to be determined. It remains unclear if transplantation of predifferentiated BMSCs is superior to undifferentiated BMSCs or freshly isolated bone marrow mononucleated cells (BMNCs) in terms of new bone formation in vivo. The aim of this study was to investigate the effect of in vitro osteogenic differentiation (β-glycerophosphate, dexamethasone, and l-ascorbic acid) of human BMSCs on the capability to form tissue-engineered bone in unloaded conditions after subcutaneous implantation in nude mice. After isolation from human bone marrow aspirates, BMNCs were divided into three parts: one part was seeded onto porous beta-tricalcium phosphate ceramics immediately and transplanted in a heterotopic nude mice model; two parts were expanded in vitro to passage 2 before cell seeding and in vivo transplantation, either under osteogenic conditions or not. Animals were sacrificed for micro-CT and histological evaluation at 4, 8, 12, 16, and 20 weeks postimplantation. The results showed that BMSCs differentiated into osteo-progenitor cells after induction, as evidenced by the altered cell morphology and elevated alkaline phosphatase activity and calcium deposition, but their clonogenicity, proliferating rate, and seeding efficacy were not significantly affected by osteogenic differentiation, compared with undifferentiated cells. Extensive new bone formed in the pores of all the scaffolds seeded with predifferentiated BMSCs at 4 weeks after implantation, and maintained for 20 weeks. On the contrary, scaffolds containing undifferentiated BMSCs revealed limited bone formation only in 1 out of 6 cases at 8 weeks, and maintained for 4 weeks. For scaffolds with BMNCs, woven bone was observed sporadically only in one case at 8 weeks. Overall, this study suggests that ectopic osteogenesis of cell/scaffold composites is more dependent on the in vitro expansion condition, and osteo-differentiated BMSCs hold the highest potential concerning in vivo bone regeneration.     

老化相关的自发荧光可作为细胞衰老的标志物

目的 观察衰老的脑组织内自发荧光的波长特点,探讨如何合理地利用和消减老化相关的自发荧光。方法 选取3月龄和24月龄自然老化的C57BL/6J雌、雄性小鼠。以衰老相关β-半乳糖苷酶染色（SA-β-Gal）和脂褐素的沉积评估老年鼠脑组织衰老的程度。以激光共焦显微镜分析老化相关自发荧光的波长特点,免疫组织化学和免疫荧光的方法标记星形胶质细胞。结果 老年鼠海马和下丘脑第三脑室室周旁出现强SA-β-Gal染色、脂褐素的聚集及自发荧光。老化相关的自发荧光发射波长介于500～565nm,下丘脑第三脑室室周旁的星形胶质细胞不仅高表达SA-β-Gal,而且出现很强的自发荧光。采用针对脂褐素的自发荧光消除剂处理脑组织后,老化相关的自发荧光几乎完全消失。 结论 老化相关的自发荧光可以作为特定表型细胞衰老的标志物;恰当的处理老化相关的自发荧光,可极大的提高衰老脑组织免疫荧光检测的特异性。     

当归多糖对人白血病干细胞体外增殖与体内移植模型的影响

目的 探讨当归多糖(ASP)对人白血病干细胞(LSCs)增殖及体内移植的影响。 方法1. ASP对CD34⁺CD38^-人LSCs体外增殖的影响。免疫磁性法分选正常人和髓系白血病患者骨髓中CD34⁺CD38^-细胞,分为正常CD34⁺CD38^-对照组、CD34⁺CD38^-LSCs对照组、正常CD34⁺CD38^-ASP组和CD34⁺CD38^-LSCs ASP组,后两组在常规培养基础上加入ASP（终浓度40 mg/L）。流式细胞术检测CD34⁺CD38^- 细胞纯度;锥虫蓝染色检测细胞存活率;细胞计数试剂盒8（CCK-8）和混合集落形成单位（CFU-Mix）检测CD34⁺CD38^-LSCs增殖分化能力;RT-PCR 检测衰老相关基因表达水平。2. ASP对人LSCs移植小鼠模型的影响。体内移植LSCs建立CD34⁺CD38^- LSCs小鼠移植模型,随机分为ASP移植模型组［腹腔注射ASP,200 mg/kg,（1次/d）×14 d］和移植模型组（注射等时、等量生理盐水）。药物注射完成第2天,计数白细胞总数和分类计数,观察血细胞形态;免疫荧光细胞化学法检测受体鼠骨髓中CD34⁺CD38^-LSCs;衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色检测染色阳性骨髓单核细胞（BMMCs）百分率;流式细胞术检测BMMCs细胞周期分布;CFU-Mix培养检测BMMCs集落形成能力。 结果 分选后CD34⁺CD38^-细胞纯度达到（91.14±1.02）%,细胞存活率为（95.42±3.5）%;CD34⁺CD38^-LSCs对照组细胞增殖与集落形成能力显著高于正常CD34⁺CD38^-对照组;CD34⁺CD38^-LSCs ASP组细胞增殖能力与集落形成能力明显低于CD34⁺CD38^- LSCs对照组;CD34⁺CD38^-LSCs ASP组细胞高表达p16^INK4a、p19Arf、p53、p21^Cip1/Waf1基因。移植CD34⁺CD38^-LSCs后小鼠骨髓中存在人源性LSCs。移植模型组小鼠白细胞总数增加,中性粒细胞比例升高,淋巴细胞比例降低;注射ASP可明显降低白细胞总数和中性粒细胞比例,淋巴细胞比例有所升高;处于G₀/G₁期中的BMMCs数量增加,S期细胞数量减少;SA-β-Gal染色阳性细胞百分率明显提高;CFU-Mix集落形成数显著减少。 结论ASP在体内与体外均能抑制CD34⁺CD38^-LSCs增殖,推测其可能机制与ASP调节细胞衰老相关基因表达密切相关。