人IP-10融合蛋白表达载体的构建和表达及活性鉴定

目的：构建人His标记的IP-10 (interferon-γ-inducible protein 10)融合蛋白表达载体并在原核细胞中表达、纯化，获得有活性的IP-10蛋白，为进一步研究其在炎症过程中的作用机制及寻找新的抗炎途径提供基础。 方法： 从人肺cDNA文库中PCR扩增无信号肽的IP-10基因编码序列，构建重组载体pET-14b/IP-10；重组质粒经酶切、测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株；经异丙基β-D-硫代半乳糖（IPTG）诱导后，用镍离子亲和层析柱纯化融合蛋白，以THP-1细胞进行微室跨膜迁移（transwell）实验鉴定融合蛋白活性。 结果： 酶切、测序鉴定重组载体pET-14b/IP-10构建正确，并纯化得到高纯度的IP-10融合蛋白。而且该蛋白具有诱导单核细胞THP-1跨膜迁移活性。 结论： 成功构建了人IP-10融合蛋白表达载体，并纯化得到具有活性的IP-10融合蛋白，为进一步研究IP-10的功能提供了重要的实验材料。     

人源抗狂犬病毒二硫键稳定抗体在大肠杆菌中的融合表达

目的在大肠杆菌pMAL-P2x系统中表达anti-rabiesMBP-ScdsFv融合蛋白,酶切获得目的蛋白ScdsFv,进行纯化、鉴定及简单活性分析。方法利用DNA重组技术,将全长的ScdsFv蛋白基因克隆至原核表达载体pMAL-p2x中,重组质粒转化大肠杆菌E.coliER2566,IPTG诱导表达。表达产物经Xa酶切后,经Ni柱、AmyloseResin亲和层析进行纯化,SDS-PAGE和Western blot对其进行鉴定,ELISA检测其结合活性。结果成功地构建了重组质粒pMAL-ScdsFv,经诱导表达、蛋白酶切、亲和纯化后获得目的蛋白。ELISA检测其具有抗原特异结合活性,其热稳定性有显著提高。结论抗狂犬病毒ScdsFv蛋白具有良好的结合活性和生物学活性稳定性,可作为候选分子用于狂犬病的防治研究。     

人肿瘤抑素相关T21RGD肽的表达与纯化

目的 构建引入RGD序列人肿瘤抑素相关21肽（T21RGD）―内含肽―几丁质结合蛋白融合表达载体，实现目的肽的几丁质珠亲和层析一步纯化。方法 人工设计合成T21RGD肽基因， 经重组定向克隆插入到原核表达载体pTYB2，酶切和测序鉴定正确后转化入大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导其融合表达，对表达蛋白进行几丁质珠亲和层析，DTT诱导柱上裂解以获得T21RGD肽。经Trcine-SDS-PAGE和反相高效液相色谱(RP-HPLC)对纯化产物进行鉴定。结果 质粒酶切和测序结果显示，含T21RGD肽基因按正确方向和序列插入质粒,融合蛋白表达量达菌体蛋白总量的50％以上，Trcine-SDS-PAGE显示了T21RGD肽目的条带与预期相符，反相高效液相色谱测定峰纯度达97％。结论 成功构建T21RGD肽融合表达载体，实现了融合蛋白在大肠杆菌中高效表达和T21RGD肽几丁质珠亲和层析一步纯化，为进一步研究T21RGD肽抗肿瘤活性和作用机理奠定基础。     

人survivin蛋白的原核表达、纯化及抗原活性鉴定

目的 构建人肿瘤抗原survivin的原核表达载体,优化在大肠杆菌中的表达条件,并对survivin/His融合蛋白进行纯化和抗原活性鉴定.方法 设计针对survivin基因序列的特异引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增人survivin全长基因序列(538 bp)克隆至原核表达载体pET28a(+),构建重组表达载体pET28 a-survivin,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达survivin/His融合蛋白,并采用Ni亲和层析凝胶纯化重组蛋白.纯化后的重组蛋白经Western blot法、ELISA鉴定其抗原活性.结果 重组表达载体经BamH Ⅰ和HindⅢ鉴定正确;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析表明获得了相对分子质量(Mr)24000大小的重组蛋白;纯化后的蛋白纯度达到90％.Western blot法和ELISA检测证实纯化的survivin蛋白能够与特异性抗体发生反应,表明其具有良好的抗原活性.结论 成功构建了原核表达载体pET28 a-survivin,利用大肠杆菌表达系统实现了融合蛋白的可溶性表达并进行纯化,纯化后survivin蛋白经鉴定具备较高的抗原活性.     

2型猪链球菌中国强毒株znuA基因的原核表达及免疫学活性分析

目的克隆2型猪链球菌高亲和力锌吸收蛋白(High-affinity zinc uptake system protein,ZnuA)编码基因并进行原核表达,研究ZnuA蛋白的免疫学活性。方法采用PCR法,从2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组扩增基因znuA,构建重组表达质粒pET32a::znuA,转化E.coli BL21(DE3),筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物;His亲和层析柱纯化重组蛋白;Western blot检测ZnuA蛋白的免疫原性;重组蛋白免疫新西兰兔后收集多抗血清,间接ELISA检测多抗血清效价。结果构建的重组质粒在宿主菌中可高效表达,His亲和层析柱纯化获得较高纯度的重组蛋白;Western blot结果表明ZnuA蛋白具有良好的免疫原性;重组蛋白免疫新西兰兔后获得高效价的多抗血清。结论在原核系统中成功地表达了znuA基因编码的蛋白,且ZnuA重组蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究znuA基因在猪链球菌致病过程中的作用以及猪链球菌疫苗的开发奠定了基础。     

大鼠重组骨桥蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达和纯化

目的 构建包含大鼠骨桥蛋白(OPN)的真核表达载体,获得稳定表达重组蛋白的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株并对蛋白进行纯化,为OPN在大鼠模型实验中的进一步功能学研究奠定基础.方法 通过脂质体lipofectamine 2000将重组质粒pLVX-OPN转染到CHO细胞中,嘌呤霉素筛选出稳定克隆细胞.Real-time PCR法检测转染后CHO细胞中OPN的mRNA表达水平,酶联免疫吸附实验法(ELISA)检测上清中OPN分泌水平.取CHO细胞72 h无血清培养上清进行镍柱亲和层析纯化,ELISA法和Western blot法分别检测产量和纯度.结果 pLVX-OPN表达载体经DNA琼脂糖电泳鉴定为阳性,且质粒测序成功.经质粒pLVX-OPN转染的CHO细胞中OPN mRNA表达水平是转染前的上千倍,上清分泌蛋白水平较转染前增加.上清分泌的OPN蛋白通过镍柱亲和层析纯化后纯度有所提高,产量在30％以上.结论 pLVX-OPN真核表达载体的成功构建和在CHO细胞中的稳定表达及纯化为OPN的功能学研究提供了有效工具.     

ZZ亲和肽-碱性磷酸酶融合蛋白的制备与初步应用

目的:构建、表达ZZ亲和肽与碱性磷酸酶(AP)融合蛋白,并研究其生物学活性。方法:将ZZ亲和肽基因与AP基因重组,构建原核表达载体p EZZ-AP并利用大肠杆菌表达,金属离子亲和层析纯化目的蛋白,Western blot鉴定ZZ-AP生物学活性并初步应用于免疫细胞化学。结果:所构建重组质粒p EZZ-AP经E.coli DH5α表达,SDS-PAGE结果显示目的蛋白相对分子量为62 k D,与理论值相近。Western blot结果表明ZZ-AP融合蛋白既具有兔Ig G抗体结合活性,又具有碱性磷酸酶活性,在细胞免疫组化应用中与AP标记的羊抗兔二抗显色模式与效果相似。结论:ZZ-AP融合蛋白构建成功,该融合蛋白具有兔Ig G抗体结合活性和碱性磷酸酶活性,细胞免疫组化应用结果表明该融合蛋白在免疫分析中具有潜在的应用价值。     

一种重组β-内酰胺酶的原核表达,纯化及其活性检测

目的:利用原核表达系统诱导表达一种可以用于肿瘤生物治疗ADEPT(单抗导向酶活化前药)的重组蛋白RGD4CβL,并对该蛋白进行纯化以及活性检测。方法:对合成的DNA序列进行测序,将重组载体pColdII-RGD4CβL转化入大肠杆菌E.coli BL(DE3),在大肠杆菌细胞中诱导表达目的蛋白,用His标签纯化树脂Ni-NTA纯化目的蛋白,以流式细胞术(FCM)检测纯化所得蛋白的活性。结果:合成的DNA全长为1125bp,其在E.coli BL(DE3)中经IPTG诱导后表达出相对分子质量(Mr)约为42000的目的蛋白,经纯化后获得了产率和纯度均很高的重组蛋白RGD4CβL,流式细胞检测证明该蛋白具有很好的肿瘤细胞靶向性。结论:成功地对重组蛋白RGD4CβL进行了诱导表达,得到的纯化蛋白具有较好的肿瘤细胞靶向性,该重组蛋白将可能成为一种免疫原性更低的新型双功能蛋白用于ADEPT。     

新型重组人内毒素结合肽突变体的构建及原核表达纯化

目的 构建新型人内毒素结合肽(a new endotoxin binding peptide consisting of 25 amino acid residues,EBP_(25))及其突变体(mutant of EBP_(25),mEBP_(25))的原核表达重组质粒,并在大肠埃希菌中诱导表达.方法 采用PCR法,扩增EBP_(25)基因,构建pET-30-EBP_(25)融合表达载体并转化E.coli DH5α扩增.重组质粒经酶切和测序鉴定后,应用快速定点突变法将EBP_(25)第2位缬氨酸和第5位谷氨酰胺所对应碱基均替换成赖氨酸所对应的碱基,突变后重组质粒再经测序鉴定后,将二者转化至E.coli BL_(21)(DE_3)PlysS后经IPTG诱导表达,表达产物采用Western印迹进行鉴定后,用His-Tag亲和层析对融合蛋白进行纯化. 结果 两次测序结果 显示人EBP_(25)和mEBP_(25)重组序列和理论设计序列完全一致后,经IPTG诱导表达获得目的融合蛋白,通过SDS-PAGE电泳、Western 印迹证实蛋白表达的特异性,并对蛋白进行纯化,获得EBP_(25)和mEBP_(25)融合蛋白. 结论 构建、表达纯化了EBP_(25)和mEBP_(25)融合蛋白,为进一步研究其中和内毒素/脂多糖活性奠定了基础.     

乳腺癌特异性转导小肽融合表达载体的构建以及目的蛋白的表达

目的构建乳腺癌特异性转导小肽PI-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白的原核表达载体,并进行目的蛋白的表达、分离和纯化。方法合成PI的DNA序列,将其定向插入到p EGFPN2中,经双酶切获取PI-EGFP的核苷酸序列,再将其克隆入原核表达质粒pET-28a(+),构建出pET-28a(+)-PI-EGFP的原核表达载体;重组质粒转化BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经IPTG诱导表达,利用His-tag对蛋白进行分离纯化,SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹免疫分析(Western blot)鉴定纯化蛋白质。结果成功构建了pET-28a(+)-PI-EGFP的原核表达载体;其经诱导后,在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白以可溶性形式存在;SDS-PAGE分析显示,在相对分子量约33kD的位置出现目的蛋白条带,与理论值相符;经His TALONTM Cartridge亲和层析纯化获得了高纯度的重组的PI-EGFP融合蛋白,Western blot鉴定结果显示获得了目的蛋白。结论成功构建出乳腺癌特异性转导小肽PI-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白原核表达载体,并能够表达出PI-EGFP的融合蛋白,为进一步研究小肽的乳腺癌特异性转导功能奠定基础。     

一种新型肝癌免疫毒素的表达、纯化及初步鉴定

从噬菌体随机肽库中筛选获得了与肝癌细胞特异性结合的12-肽A54,将其与蜂毒肽(melittin,Mel)编码基因连接后,插入质粒载体pET-32a(+)中,构建成A54-Mel与硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)及六聚组氨酸(6×His)的融合表达载体pET32-A54-Mel。将重组质粒转化E.coliBL21(DE3)表达后,获得可溶性表达产物,经Western blot鉴定,表达产物能与蜂毒肽特异性抗体反应。表达菌经超声裂解后,上清液用Ni+离子亲和层析法纯化得到了融合蛋白(Trx-A54-Mel),经肠激酶裂解、再次Ni+离子亲和层析后得到纯度大于95%的肝癌特异性免疫毒素A54-Mel。经细胞ELISA和四氮唑盐(MTT)法检测,发现A54-Mel在体外具有一定的肿瘤细胞特异性靶向及杀伤活性,为新型免疫毒素在肝癌靶向治疗中的研究奠定了基础。     

双功能域小分子补体受体1型衍生物的构建、表达、纯化及生物功能鉴定

目的 克隆表达出能够抑制补体活化的双功能域小分子补体受体1型(complementreceptor type 1,CR1)衍生物.方法 从外周血提取总RNA,进行RT-PCR扩增出功能性片段Ⅰ(CR1-SCR1-3);以本室构建的pET-32a-CR1-SCR15-18为模板扩增功能性片段Ⅱ(CR1-SCR15-17);利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)法扩增出包含双功能域的融合基因.将融合基因重组于pET-32a(+)载体,转化大肠杆菌Rosetta,经酶切及DNA序列测定鉴定后,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot对表达蛋白质进行分析鉴定.蛋白质经Ni柱亲和层析及透析复性后,采用50%补体溶血抑制试验(CH50)进行功能鉴定.结果 酶切及DNA序列测定证实成功构建出了pET-32a-CR1-SCR(1-3+15-17)重组表达载体,IPTG诱导表达后在相对分子质量(Mr)为63×103处有一明显的条带,经Westernblot鉴定为目的 蛋白,Ni柱亲和层析获得纯度约为92%的目的 蛋白,功能试验证实,在0～200 μg/ml的融合蛋白剂量范围内,随着浓度的增加,补体抑制活性增强.结论 成功构建并在大肠杆菌内表达了具有较高生物活性的重组双功能域小分子CR1衍生物,为体内保护实验研究提供实验数据.     

重组胶质细胞生长因子2蛋白的原核表达及纯化

目的通过原核表达的方法得到胶质细胞生长因子2(GGF2)重组蛋白。方法将不含信号肽编码序列的GGF2基因用亚克隆的方法自PVT-GGF2质粒克隆至PCXJ18质粒,再由PCXJ18-GGF2质粒克隆至pET-32b(+)质粒,构建pET-32b(+)-GGF2表达载体。表达载体转染4种宿主菌,筛选合适者。优化表达时程和IPTG诱导剂量。GGF2大量表达后回收包涵体,复性。复性产物利用His Bind树脂进一步纯化。纯化产物用Western blot鉴定。结果测序鉴定表明,成功构建pET-32b(+)-GGF2表达载体。筛选结果表明Origami B(DE3)为合适宿主菌。适宜的表达条件为30℃诱导前扩增,浓度25μmol/L IPTG,37℃诱导2 h。所表达外源蛋白相对分子质量和预期一致。回收、纯化后得到纯度约为96%的产物。Western blot鉴定表明所获为GGF2重组蛋白。结论原核表达方法得到足量GGF2重组蛋白。     

人类新基因CTRP4的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:构建新基因CTRP4的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化rhCTRP4-his蛋白,制备和鉴定小鼠抗人CTRP4多克隆抗体,为进一步研究人类新基因CTRP4的生物学功能奠定基础。方法:从pcDNA3.1-myc/his(-)B-hCTRP4重组载体中通过PCR的方法扩增CTRP4基因ORF中不含信号肽的目的基因片段,将得到的片段双酶切定向插入pET-32a中,构建原核表达载体pET-32a-hCTRP4。构建好的质粒在E.coli BL21(DE3)中进行诱导、表达,通过镍亲和层析柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度。将pcDNA3.1-myc/his(-)B-hCTRP4重组质粒和纯化好的融合蛋白依次免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。并对抗体进行纯化、效价测定以及特异性鉴定。结果:DNA测序证实构建的pET-32a-hCTRP4重组表达载体含有hCTRP4编码序列,其序列比对分析与GenBank中公布序列一致,质粒在E.coli中表达相对分子质量(Mr)为35 000的目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析纯度为95%以上。ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,Westernblot、免疫荧光细胞化学和免疫组化分析显示抗体能特异性识别重组hCTRP4以及天然状态hCTRP4蛋白。结论:成功构建了hCTRP4蛋白的原核表达载体,并获得较高纯度的融合蛋白,制备了高效价、高特异性的多克隆抗体。     

Nanog基因的原核表达及抗体制备

目的:在大肠杆菌中表达Nanog融合蛋白,制备兔抗小鼠Nanog融合蛋白抗体。方法:从含小鼠Nanog基因的pNA992质粒中扩增出小鼠Nanog基因并插入pET-32a中构建pET-32a-Nanog重组表达载体,并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,得到了Nanog融合蛋白,并经Histrap亲和层析柱纯化后,将其作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体效价,Western blot和免疫细胞化学染色检测抗体特异性。结果:成功地构建了重组表达载体pET-32a-Nanog,经诱导获得了大量Nanog融合蛋白,其主要以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达到97%,经免疫的兔抗血清效价可达1∶32 000,并表现出较好的特异性。结论:成功地制备出高滴度、高特异性的兔抗Nanog融合蛋白抗体。     

宫颈癌相关BLCAP基因的原核表达及条件优化

目的利用大肠埃希菌表达系统表达宫颈癌相关BLCAP基因,并优化表达条件。方法利用PCR技术从逆转录病毒重组载体pL(BLCAP)SN中扩增宫颈癌相关BLCAP基因,将其插入到原核表达载体pET-32(a)中,从而构建原核表达重组质粒pET-32(a)-BLCAP,随后将阳性重组质粒转化到表达宿主菌中,通过IPTG诱导表达并优化表达条件,所表达的带有His标签目的融合蛋白经Ni2 亲和层析纯化回收,并采用SDS-PAGE和Western印迹对目的蛋白进行分析和鉴定。结果构建的重组表达质粒经PCR、酶切和DNA测序鉴定与预期的结果一致,含有重组质粒的表达宿主菌经过IPTG诱导表达了分子量约为28ku的融合蛋白,并经优化确定了最佳的诱导表达条件。结论成功构建了pET-32(a)-BLCAP原核表达质粒,表达并经纯化得到了BLCAP目的蛋白,为研究该蛋白的性质及其制备针对该蛋白的抗体奠定了基础。     

肝癌抗原肽(EPVTKAEML)与人HSP70融合基因的构建及原核表达

目的:构建及原核表达肝癌抗原肽(EPVTKAEML)与人热休克蛋白70(HSP70)的融合基因.方法:采用加端PCR方法,将EPVTKAEML的基因序列融合到人HSP70基因的3′端;将融合基因克隆入原核表达载体pET-28a( )中,构建重组质粒pET-28a( )/EPVTKAEML-HSP70.经限制性内切酶BamH I、Xho I双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE检测表达结果.结果:应用加端PCR方法扩增出约2.0 kb的目的片段,序列测定结果证实,EPVTKAEML的基因序列成功地融合到人HSP70基因的3′端.经BamH I、Xho I酶切鉴定证实,融合基因成功地克隆到原核表达载体pET-28a( )上;转入重组质粒的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析发现在相对分子质量(Mr)约72 000处有表达量明显增多的蛋白条带.结论:成功地构建并表达了肝癌抗原肽(EPVTKAEML)与人HSP70的融合基因.