一种合成的新型内毒素结合肽突变体的体内外拮抗内毒素效应初步研究

目的设计构建新型内毒素结合肽突变体(mutant of endotoxin binding peptide,mEBP),并研究其体内外拮抗内毒素效应。方法采用F-moc固相合成法获得内毒素结合肽(endotoxin binding peptide,EBP)及其突变体mEBP;CCK-8法检测mEBP对RAW264.7细胞增殖的影响;ELISA法检测mEBP对内毒素(lipopolysaccharide,LPS)诱导的RAW264.7细胞分泌TNF-α和IL-6的影响;Western blot法检测mEBP对LPS诱导的RAW264.7细胞表达p-p38 MAPK的影响;中性红法测定mEBP对LPS诱导的RAW264.7细胞吞饮功能的影响。复制烧伤合并内毒素血症小鼠模型;检测mEBP对建模后6 h小鼠血浆中TNF-α、ALT和AST浓度的影响;检测mEBP对模型小鼠48 h生存率的影响。结果 mEBP无可见的细胞毒性;mEBP可降低LPS诱导的RAW264.7细胞分泌TNF-α和IL-6(P<0.05);抑制p-p38 MAPK信号通路的激活;抑制RAW264.7细胞的吞饮功能(P<0.01);mEBP预处理可明显降低烧伤合并内毒素血症模型小鼠血浆中的TNF-α、ALT和AST浓度(P<0.05),提高模型小鼠48h生存率。结论 mEBP和EBP均具有明显的拮抗内毒素活性,其中mEBP拮抗活性更强。     

人组织激肽释放酶6的原核表达载体的构建及表达

目的：构建人组织激肽释放酶6原核表达系统。方法：采用RT-PCR技术从人乳腺癌组织中扩增出KLK6基因片段,克隆至原核表达载体pET28b中,经酶切和序列测定后,转化至E.coli BL21,IPTG进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE检测,Ni-NTA亲和层析柱纯化,其纯化产物进行SDS-PAGE和Western-blot检测。结果：pET28b-KLK6原核表达载体构建成功,经IPTG诱导高效表达hK6蛋白,纯化后获得大量高纯度蛋白。结论：成功构建了KLK6的原核表达系统并在E.coli BL21中高效表达,获得高纯度的hK6融合蛋白。     

天花粉蛋白突变体TCSFYY163-165CSA的构建表达与纯化

目的:构建天花粉蛋白(TCS)突变体基因,并在原核系统进行表达及纯化。方法:应用计算机预测TCS分子上可能的抗原决定簇(FYY163-165),并进行定点突变。以栝楼基因组DNA为模扳,经PCR扩增突变基因,与pRSET-A表达载体连接,转化感受态E.coli DH5α,提取质粒进行酶切鉴定及测序。将阳性重组质粒转化感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,对表达产物进行Western blot法鉴定和Ni-NTA层析纯化。结果:构建了带有TCS突变体基因(TCSFYY163-165CSA)的重组表达质粒,使目的蛋白在大肠杆菌中获得高效可溶性表达,表达产物经纯化后,得到均一的TCS突变体蛋白。结论:成功地构建了TCS突变体基因TCSFYY163-165CSA,并获得高效表达,为基因工程方法改造TCS提供了新的途径。     

人TLR1胞外段原核表达载体的构建、蛋白表达及纯化

目的:克隆、原核表达人Toll-like receptor1 (TLR1)胞外段基因,获得人TLR1胞外段蛋白.方法:RT-PCR扩增人TLR1胞外段基因,构建pET30(a)+/TLR1表达质粒,转染大肠杆菌BL21,在BL21细胞中表达TLR1胞外段蛋白,并进行纯化和Western blot 鉴定.结果:PCR扩增及重组质粒测序结果表明成功地构建了pET30(a)+/TLR1胞外段原核表达质粒,PCR扩增的目的基因大小为1 700 bp左右.表达的包涵体蛋白经溶解及变性后上镍亲和柱纯化,SDS-PAGE分析纯化产物在Mr为68 kD处有明显蛋白条带;Western blot ELISA结果显示,其表达纯化的蛋白为TLR1蛋白.结论:TLR1胞外段在大肠杆菌BL21中正确表达,为TLR1识别机制及信号转导机制研究奠定了基础.     

人重组IL-17/His蛋白的原核表达、纯化及其生物学活性

目的:研究人IL-17的体外生物学活性。方法:采用RT-PCR的方法克隆得到了hIL-17基因序列。将测序正确的人IL-17基因装入PQE3.0原核表达载体构建重组载体hIL-17/PQE3.0。该重组载体导入宿主菌M15,经异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生IL-17/His融合蛋白,并经West-ernblot实验确认。结果:原核表达的hIL-17/His重组蛋白经变性、复性后,利用HiTrapTM亲和层析得到纯品蛋白。体外活性实验表明,该融合蛋白具有刺激人宫颈癌细胞株HeLa分泌IL-6和GM-CSF的作用。结论:制备了具有生物学活性的IL-17/His重组蛋白,为进一步研究该分子在自身免疫疾病等方面的作用奠定了基础。     

低毒性金葡萄球菌肠毒素 A D227A 突变体的原核表达、纯化及鉴定

目的:获得低毒性但仍保留其免疫活性、高纯度的重组D227A 突变型金葡菌肠毒素A 蛋白(rSEAD227A )。方 法:利用PCR 技术克隆含D227A 突变的SEA 基因并原核表达,用盐酸胍溶解包涵体并进行梯度透析复性;使用Strep域亲和层 析来纯化蛋白;免疫印迹和LC-MS/ MS 进行鉴定。结果:成功克隆SEA 的D227A 突变体,获得了高纯度的rSEAD227A蛋白。LC- MS/ MS 分析证实,胰酶消化后的rSEAD227A肽段序列与数据库中SEA 的序列匹配。结论:获得了高纯度rSEAD227A 蛋白,为SEA 的进一步基础研究和临床应用提供了实验基础。     

人MAdCAM-1胞外区基因在原核系统的表达及重组蛋白纯化

目的：制备高纯度的重组人MAdCAM-1蛋白。方法 采用PCR技术从pUC21/hMadCAM-1质粒上,选择性扩增编码成熟MAdCAM-1胞外区两个Ig域的基因片段。将其克隆至pQE30载中,转化大肠杆菌后,以IPTG诱导表达,产物经Ni-NTA亲和层析纯化。结果：诱导表达出相对分子质量（Mt)约29000的融合蛋白。薄层凝胶扫描显示,其表达量占菌体总蛋白质的50％左右。经亲和层析纯化得到高纯度的蛋白产品。结论 获得了重组人MAdCAM-1胞外区蛋白,为后续功能研究及其单抗研制奠定了基础。     

重组人IL-11的原核表达、纯化和鉴定

以本实验室构建的pET24a-hrIL-11表达载体为模板,PCR扩增重组人白细胞介素11(hrIL-11)的基因,克隆入pET21a表达载体,转化BL-21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生hrIL-11/His融合蛋白,并经Western blot实验确认。原核表达的hrIL-11/His融合蛋白经变性后,利用亲和层析纯化,目的蛋白纯度达95%以上。纯化后蛋白经尿素梯度复性后,比活达到1×106 IU/mg。研究结果为进一步研究该蛋白在促进血小板增殖等方面的作用奠定了基础。     

人PHF8蛋白的原核表达、纯化与结晶

目的 探讨人PHF8蛋白的原核表达,纯化与结晶条件。方法 用分子克隆的方法构建重组质粒PHF8/pet28b,测序鉴定正确后将其转入Rosetta 2(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白。对融合蛋白进行分离纯化结晶,衍射分析,并用计算机软件解析其晶体结构。结果 经过诱导,含有PHF8/pet28b的Rosetta 2在原核表达系统中表达出了相对分子质量为40kd的c-PHF8融合蛋白,c-PHF8在合适的悬滴条件下得到六方柱晶体。结论 利用原核表达体系成功地表达了人PHF8催化活性中心结构域并获得结晶,为进一步的三维结构解析和PHF8功能研究奠定了基础。     

人NT-proBNP的克隆及原核表达

目的：克隆人氨基末端脑钠肽（amino—terminal pro—brain natriuretic peptide,NT—proBNP）基因,构建原核表达载体并纯化表达产物。方法：采用PCR从正常成人cDNA中扩增NT—proBNP基因,将其克隆至pGEM—T中,测定其核苷酸序列。然后构建原核表达载体pGXE4T-2-NT-proBNP,用IPTG诱导表达,GSH—agarose亲和纯化蛋白。结果：经PCR扩增获得NT—proBNP基因,测序正确,在大肠杆菌中融合表达后,该蛋白的表达量占菌体总蛋白的20％,用SDS—PAGE和Western blot鉴定,显示其相对分子量34600。经亲和纯化后的GST—NT—proBNP的纯度可以达到96％,得率为1．8mg／100ml。结论：NT—proBNP的纯化成功,为建立NT—proBNP检测方法奠定了基础。     

人血红素加氧酶-1的原核表达、纯化及其中和抗体的制备

目的 确定人血红素加氧酶-1(human heme oxygenase-1,hHO-1)在大肠埃希菌中的表达条件与纯化方法,利用纯化的蛋白制备具有中和活性的hHO-1多克隆抗体.方法 将hHO-1原核表达质粒pMW172/hHO-1转入大肠埃希菌菌株BL21,通过改变摇床转速、诱导剂IPTG浓度和培养时间确定hHO-1蛋白的最佳可溶性表达条件;利用超声破碎、高速离心、分级盐析、分子筛层析等方法纯化hHO-1蛋白,建立体外HO-1活性测定方法检测hHO-1蛋白的活性;利用纯化的hHO-1活性蛋白作为抗原免疫新西兰兔,制备多克隆抗体;利用ELISA方法和Western印迹技术分别测定抗体的效价和特异性,通过HO-1活性测定检测抗体的中和活性.结果 确定hHO-1最佳可溶性表达条件为:37 ℃、200 r/min培养3 h后,0.1 mmol/L IPTG诱导培养4 h.超声破碎菌体,上清经30%～40%盐析纯化及分子筛层析纯化,获得活性hHO-1蛋白,收得率为30.3%,纯化倍数为2.83倍,纯度为90 %.制备的抗hHO-1的兔血清效价达到10~6,并能中和掉46 % hHO-1的催化活性.结论 为hHO-1蛋白的表达和纯化以及多克隆抗体制备确立了可行的技术方案;获得了高纯度活性hHO-1蛋白及hHO-1多克隆抗体,为HO-1功能、结构研究,以及相关疾病研究奠定了基础.     

人单核细胞趋化蛋白-1在大肠杆菌中的高效表达及其生物学活性

利用PCR和DNA重组技术,将人单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）cDNA克隆在表达载体pGEX－2T中,表达产物GST／MCP－1占菌体总蛋白的50％,且以无活性的包涵体形式存在。经变复性,GlutathioneSepharose4B亲合柱层析纯化,融合蛋白达到电泳纯,且具有MCP－1趋化活性。体内外抗肿瘤试验结果表明,GST／MCP－1激活单核细胞和淋巴细胞后可抑制肿瘤细胞生长,提示MCP－1可能成为肿瘤辅助治疗的一个候选药物。     

人细胞因子受体样因子3在真核及原核细胞中的表达

目的:观察CRLF3蛋白在293T细胞中的表达及亚细胞定位,并在大肠杆菌中表达和纯化了重组CRLF3蛋白.方法:将真核表达载体pCMV-myc-CRLF3瞬时转染293T细胞,转染24 h和48 h后免疫荧光染色,共聚焦显微镜观察蛋白表达及定位;构建原核表达质粒pGEX-4T-1-CRLF3,实现插入基因的融合表达,经GST亲合层析纯化蛋白.结果:CRLF3蛋白在293T细胞中高效表达,主要分布在细胞质和细胞膜;成功构建了表达CRLF3融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌内高效表达,纯化后得到Mr约为74 000的融合蛋白.结论:在真核细胞中过表达的CRLF3蛋白主要定位在细胞质和细胞膜;获得了重组GST-CRLF3融合蛋白,为进一步探讨CRLF3的功能奠定基础.     

金黄色葡萄球菌膜蛋白nEBPS原核表达及抗体制备

目的：构建金黄色葡萄球菌弹性纤维结合蛋白N端蛋白（N-terminal elastin binding proteins of S.aureus,nEBPS）的原核表达系统,制备其多克隆抗体。方法：设计引物,PCR方法扩增nEBPS基因（nebps）,分别构建克隆载体pMD19-T（＋）/nebps和原核表达载体pQE30（＋）/nebps,经PCR、双酶切和测序鉴定后,阳性表达载体转化大肠杆菌表达宿主菌M15[pREP4],经1mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达,表达产物用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western Bloting,WB）分析鉴定,经镍螯合亲和层析（Ni-NTAAgrose）纯化后再用SDS-PAGE和WB法鉴定。制备抗原,免疫新英格兰白兔,得到抗血清并对其进行鉴定。结果：pQE30（＋）/nebps重组表达载体构建成功,目的蛋白在构建的原核表达系统中较高表达,纯化后得到高纯度的nEBPS,免疫动物后得到理想的多克隆抗体。结论：通过基因重组技术,金黄色葡萄球菌膜蛋白nEBPS在构建的原核表达系统M15[pREP4]中得以成功表达,并获得了高纯度的目的蛋白及其多克隆抗体。     

重组人BMP-2的基因克隆及原核表达

目的 构建重组人骨形态发生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2)的原核表达质粒并在大肠埃希菌中诱导表达.方法 采用RT-PCR法,从骨髓细胞总RNA中扩增获得人BMP-2成熟肽cDNA,将其克隆入表达载体pBV220,构建BMP-2的重组原核表达质粒.重组质粒经酶切和测序鉴定后,在大肠埃希菌中诱导表达目的蛋白,表达产物采用Western印迹和ELISA进行鉴定.结果 测序表明,重组基因序列与人BMP-2成熟肽基因完全一致.Western印迹和ELISA检测显示,表达产物的相对分子量(Mr)与预期结果相符,与相应抗体有结合活性.结论 获得了人BMP-2成熟肽的编码基因,并构建了含有该基因的重组质粒pBV220/BMP-2,在大肠埃希菌中可高效表达人BMP-2.     

人GST-PTEN融合蛋白的原核表达和纯化

目的构建人第10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失的基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)原核表达质粒,使其在原核细胞中高效表达并进行纯化。方法将全长片段插入原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组子pGEX-4T-1-PTEN,转化BL-21感受态细胞。经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达PTEN融合蛋白的可诱导性表达,通过SDS-PAGE电泳、Western印迹分析证实蛋白表达的特异性。并用谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-Stransferase,GST)亲和层析对融合蛋白进行纯化。结果成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1-PTEN,并将PTEN融合蛋白的成功表达,通过SDS-PAGE电泳、Western印迹分析,证实了蛋白表达的特异性。并对蛋白进行了纯化,获得了GST-PTEN融合蛋白的纯品。结论成功表达、纯化了GST-PTEN融合蛋白,为进一步研究PTEN蛋白的功能及其与其它功能性蛋白的相互作用研究奠定了基础。     

人源抗狂犬病毒二硫键稳定抗体在大肠杆菌中的融合表达

目的在大肠杆菌pMAL-P2x系统中表达anti-rabiesMBP-ScdsFv融合蛋白,酶切获得目的蛋白ScdsFv,进行纯化、鉴定及简单活性分析。方法利用DNA重组技术,将全长的ScdsFv蛋白基因克隆至原核表达载体pMAL-p2x中,重组质粒转化大肠杆菌E.coliER2566,IPTG诱导表达。表达产物经Xa酶切后,经Ni柱、AmyloseResin亲和层析进行纯化,SDS-PAGE和Western blot对其进行鉴定,ELISA检测其结合活性。结果成功地构建了重组质粒pMAL-ScdsFv,经诱导表达、蛋白酶切、亲和纯化后获得目的蛋白。ELISA检测其具有抗原特异结合活性,其热稳定性有显著提高。结论抗狂犬病毒ScdsFv蛋白具有良好的结合活性和生物学活性稳定性,可作为候选分子用于狂犬病的防治研究。