HER2启动子在卵巢癌细胞系中控制报告基因特异性表达

目的 构建一种能在卵巢癌肿瘤组织中进行肿瘤特异性表达的逆转录病毒载体,增强肿瘤基因治疗的靶向性。方法 ＰＣＲ法获得ＨＥＲ２基因的启动子片段并将其克隆至逆转录病毒载体Ｐ＾ＬＸＳＮ中,再将突变型绿色荧光蛋白（ｍｔＧＦＰ）基因克隆至该启动子下游,将此载体转染ＳＫ－ＯＶ３细胞和ＭＣＦ－７细胞。结果 转染３天后可见部分ＳＫ－ＯＶ３细胞呈现绿色荧光,而ＭＣＦ－７中无此现象。结论 ＨＥＲ－２基因启动子可控制报告     

携带绿色荧光蛋白的逆转录病毒载体的构建及其初步应用

目的构建带有快速筛选基因标记的逆转录病毒载体。方法构建携带绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）基因的逆转录病毒载体（ＧＣＧＦＰＰＸＳＮ），转染包装细胞系ＰＡ３１７，荧光显微镜及流式细胞仪观察结果。结果构建了一个携带快速筛选标记ＧＦＰ的逆转录病毒载体，其转染包装细胞系后在荧光显微镜及流式细胞仪（ＦＡＣＳ）中直接观察到该基因表达。应用该包装细胞系转染Ｔ细胞后第２天即表达绿色荧光蛋白，并可用ＦＡＣＳ进行分选。结论携带ＧＦＰ的逆转录病毒载体能够有效转染哺乳类动物细胞，与新霉素筛选基因相比，具有快速、简便的优点     

新型人肿瘤坏死因子基因在血管内皮细胞中的靶向表达

目的 探索一条肿瘤特异性基因治疗的新途径。方法 将新型人ＴＮＦ－αＤ１１ａ基因和ＫＤＲ特异性启动子插入到３’ＬＴＲ缺失２９９ｂｐ的逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ中,构建成ｐＬＸＳＮ－Ｄ２９９－ＫＤＲｐ－ＴＮＦ－α－Ｄ１１ａ重组逆转录病毒载体,使目的基因转录受ＫＤＲ启动子驱动。通过脂质体介导将该重组载体转染ＰＡ３１７包装细胞,并用病毒上清感染血管内皮细胞和ＮＩＨ３Ｔ３细胞。分别经ＥＬＩＳＡ和ＭＴＴ法测定ＴＮＦ－αＤ１１ａ在血管内皮细胞中的表达及其生物学活性。结果 成功构建了携带ＴＮＦ－αＤ１１ａ和ＫＤＲ启动子的逆转录病毒载体,ＴＮＦ－αＤ１１ａ在血管内皮细胞中的表达水平及细胞增殖抑制作用均高于ＮＩＨ３Ｔ３细胞。结论 ＫＤＲ启动子可使外源ＴＮＦ－αＤ１１ａ在血管内皮细胞中特异性表达。     

逆转录病毒介导的人TNF在人肝癌细胞系（SMMC）中的表达

利用逆转录病毒载体ＬＸＳＮ构建了含人ＴＮＦａ基因的重组逆转录病毒载体Ｌ－ｔｎｆＳＮ。磷酸钙沉淀法将重组载体引入病毒包装细胞ＰＡ３１７，挑选Ｇ４１８抗性克隆，用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒滴度，获得滴度为１×１０５ＣＦＵ／ｍｌ的细胞克隆。应用这一重组病毒感染人肝癌细胞ＳＭＭＣ７７２１，经Ｇ４１８筛选获得抗性克隆。ＰＣＲ可从转导的细胞ＤＮＡ中扩增出ＴＮＦａ基因片段，提示目的基因完整地整合在细胞基因组中。测定转导细胞培养上清中ＴＮＦａ活性，结果显示ＴＮＦａ有相对稳定的表达（１５０～３７０Ｕ／１０６ｃｅｌｌｓ／２４小时）。实验还表明转导细胞的体外生长能力无明显变化，但是其在裸鼠中的致瘤性却明显降低，提示逆转录病毒介导ＴＮＦａ基因对人原发性肝场可能有一定的治疗作用。     

gadd153基因对卵巢癌细胞生长抑制作用的研究

目的　研究生长抑制ＤＮＡ损伤基因（ｇｒｏｗ ｔｈ ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ＤＮＡ ｄａｍ ａｇｅ, ｇａｄｄ）对卵巢癌细胞生长抑制和凋亡的作用。　方法　ＲＴ－ＰＣＲ鉴定卵巢癌ＳＫＯＶ３ 和３ＡＯ细胞株ｇａｄｄ１５３ 基因表达。通过目的基因的克隆、载体构建技术,将目的基因ｇａｄｄ１５３ 重组于ｐｌＸＳＮ－ｎｅｏ 逆转录病毒表达载体;构建的ｐＬＸＳＮ－ｇａｄｄ１５３载体采用脂质体（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（ＤＯＴＡＰ）的方法,分别转染ＳＫＯＶ３ 和３ＡＯ细胞株;经Ｇ４１８ 抗性筛选;ＲＴ－ＰＣＲ表达鉴定;足叶乙甙（ＶＰ１６）诱导,采用流式细胞仪分析（ＦＣＭ）的方法检测转染前后肿瘤细胞的生长抑制和凋亡。　结果　ＳＫＯＶ３－ｇａｄｄ１５３ 细胞生长抑制在Ｇ１／Ｇ０ 期,部分细胞进入凋亡的状态;３ＡＯ－ｇａｄｄ１５３ 细胞生长抑制,未引起凋亡。　结论　转染ｇａｄｄ１５３ 基因的肿瘤细胞系,诱导表达后可诱发肿瘤细胞生长抑制在Ｇ１／Ｇ０期,并有细胞进入凋亡状态。证实ｇａｄｄ１５３ 基因参与了细胞生长抑制和凋亡过程。     

反义GFAP逆转录病毒表达载体的构建及其对反应性星形胶质 …

目的 构建反义ＧＦＡＰ逆转录病毒表达载体,评价其对２正常及损僵星形胶质细胞（Ａｓｔ）形态及ＧＦＡＰ基因表达的影响。方法 用定向克隆,将１．１ｋｂ的ＧＦＡＰ基因片段反向插入逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ上,获得重组体ＰＬＢｓｋＧ,经病毒包装,抗性克隆筛选、滴度测定等,挑选滴度高的抗性克隆细胞株扩展培养,收获病毒上清液感染体外培养的Ａｓｔ,通过免疫组织化学、原位杂交、ＲＴ－ＰＣＲ,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ     

逆转录病毒载体介导人GM－CSF基因转染肿瘤细胞

应用逆转录病毒载体ｐＺＩＰＮｅｏＳＶ（Ｘ）介导人ＧＭ－ＣＳＦ基因转染肿瘤细胞获得表达。经Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ将含有人ＧＭ－ＣＳＦ基因的重组逆转录病毒载体ｐＺＩＰ－ＧＭ转染兼性病毒包装细胞系ＰＡ３１７，继之用病毒收获液感染人肝癌细胞ＳＭＭＣ７７２１和人胃癌ＢＧＣ－８２３，经ＧＭ－ＣＳＦ依赖细胞株ＴＦ１测活和双抗体夹心法ＥＬＩＳＡ测定表明：人ＧＭ－ＣＳＦ基因在人肿瘤细胞中获得稳定高效表达。为进─步建立ＧＭ－ＣＳＦ的转基因治疗模型提供了基础。     

可溶性人干细胞因子基因导入真核细胞及其表达

本文构建了编码可溶性人ＳＣＦ基因的逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ－ＳＣＦ，应用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ基因转移法将重组质粒导入Ψ２和ＰＡ３１７病毒包装细胞，经Ｇ４１８选择性培养基筛选，获得产重组病毒的包装细胞ＰＡ３１７－ＳＣＦ，其病毒效价为２．４×１０５～８．５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ，继而感染人造血干祖细胞和ＮＩＨ３Ｔ３细胞。应用ＰＣＲ、ＡＰＡＡＰ免疫组化染色和化学发光一直接酶标法检测上述细胞中人ＳＣＦ基因的转染和表达，结果表明逆转录病毒载体介导转染的ｒｈ～ＳＣＦ基因在真核细胞中获得有效的表达。并将转有外源基因的人骨髓细胞进行体外液体长期培养（ＬＴＣ），观察造血干祖细胞增殖分化期间基因的表达情况。     

逆转录病毒介导的肿瘤坏死因子肝癌特异性基因治疗实验研究

为探讨肿瘤坏死因子基因对肝癌的治疗作用，分别构建ＳＶ４０早期启动子和白蛋白增强子／启动子调控小鼠肿瘤坏死因子基因的逆转录病毒载体ＭＮＳＴ和ＭＮＡＴ，以及ＳＶ４０早期启动子和人甲胎蛋白增强子／ＳＶ４０启动子调控的逆转录病毒载体ＬＴＳＮ和ＬＴＡＳＮ。构建物导入ＰＡ３１７细胞中包装成重组病毒，感染肿瘤细胞，证明白蛋白增强子／启动子和甲胎蛋白增强子均能使肿瘤坏死因子基因在肝癌细胞中高效特异表达。ＭＮＡＴ病毒和ＰＡ３１７／ＭＮＡＴ产病毒细胞ｉｎｖｉｖｏ法基因治疗有特异抗肝癌效果。提示组织特征蛋白“持家基因”转录调控序列在肿瘤组织特异性免疫基因治疗研究中有重要意义。     

hGM—CSF基因转导的人胃癌,肝癌细胞研究

ｈＧＭ－ＣＳＦ是一种细胞因子，能通过多种机制激活机体免疫功能。为了研究ｈＧＭ－ＣＳＦ修饰的人肝癌、胃癌细胞的免疫功能的变化，将含该基因的逆转录病毒载体ＬＸＳＮ转染ＰＡ３１７包装细胞，经Ｇ４１８筛选较高滴度病毒分泌株（滴度为１．５×１０４ＣＦＵ／ｍｌ），用病毒上清感染肝癌（ＨＨＣＬ）和胃癌（ＭＫＮ４５），筛选后测ｈＧＭ－ＣＳＦ活性，最高分别为２７１Ｕ／１０６细胞·２４小时和２４３．８０Ｕ／１０６细胞·２４小时。ｈＧＭ－ＣＳＦ基因在肝、胃癌细胞中整合，未发生重排。ＭＨＣ分子测定结果显示经修饰的肝癌ＨＨＣＬ细胞ＭＨＣ分子的表达无改变，而修饰后胃癌细胞ＭＫＮ４５的ＭＨＣⅠ类分子表达明显增加。本实验为今后瘤苗研制提供了资料。     

细胞内生成的抗整合酶单链抗体阻断HIV—1复制的实验研究

通通细胞内表达抗ＨＩＶ－１整合酶单链抗体（ＩＮ－ｓＦｖ）基因,阻断病毒基因组与缩主细胞基因组的整合,进而抑制病毒复制,探讨该基因载体在ＮＩＶ－１感染基因治疗中应用的意义。方法用带有ＩＮ－ｓＦｖ基因的逆转录病毒表达载体ｐＳＬＸＣＭＶ／ＩＮｓＦＶ转染ＰＡ３１７包装细胞,并用包装后含有目的基因的逆转录病毒转导ＳｕｐＴ１细胞及外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）。以ＨＩＶ－１ＮＬ４－３病毒株感染表达ＩＮ－ｓＦｖ的     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因对人膀胱癌的杀伤效应

目的：探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶ－ＴＫ）基因在人膀胱癌基因治疗中的作用。材料与方法：利用电击基因导入法,将逆转录病毒载体ＰＬＮＸＳＴＫ导入包装细胞ＰＡ３１７,经Ｇ４１８筛选,获得稳定产病毒的ＰＡ３１７／ＰＬＮＸＳＴＫ（ＰＡ３１７／ＴＫ）细胞株。采用制备的病毒转染体外培养的人膀胱癌Ｔ２４细胞,并联合丙氧鸟苷（ＧＣＶ）作用,研究其对膀胱癌细胞的生长抑制作用。结果：所获得的ＰＡ３１７／ＴＫ细胞能稳     

人IFN－γcDNA逆转录病毒载体的构建及其在Lewis肺癌细胞的稳定表达

应用分子克隆技术构建了含８４３ｂｐ的全长人ＩＦＮ－γｃＤＮＡ的逆转录病毒表达载体Ｎ２／ＩＦＮ，采用磷酸钙共沉淀方法转染包装细胞ΨＣＲＥ和ΨＣＲＩＰ，并能得到较高滴度的含病毒颗粒上清。然后应用ΨＣＲＩＰ细胞培养上清的复制缺陷性病毒颗粒感染Ｌｅｗｉｓ肺癌细胞（ＬＬＣ），经过Ｇ４１８筛选克隆得到一株能稳定分泌ＩＦＮ（６４００Ｕ／Ｍ）的克隆，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹证实ＩＦＮ－γ基因已插入ＬＬＣ基因组。结果表明，该逆转录病毒载体系统能有效地介导基因转移，并能使目的基因在靶细胞稳定表达。结果为肿瘤基因治疗及制备新型肿瘤疫苗奠定了基础。     

逆转录病毒载体介导入GM—CSF基因转染肿瘤细胞

应用逆转录病毒载体ｐＺＩＰＮｅｏＳＶ介导入ＧＭ－ＣＳＦ基因转染肿瘤细胞获得表达。经Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ将含有人ＧＭ－ＣＳＦ基因的重组逆转录病毒功茶ｐＺＩＰ－ＧＭ转染兼性病毒包装细胞系ＰＡ３１７，继之用病毒睡获感染人肝癌细胞ＳＭＭＣ７７２１和人胃癌ＢＧＣ－８２３，经ＧＭ－ＣＳＦＪ依赖细胞株ＴＦ１活活和双抗体夹心法ＥＬＩＳＡ法测定表明：人ＧＭ－ＣＳＦ基因在人肿瘤中获得稳定高效表达。     

中国人β神经生长因子基因的分子克隆、序列分析及其在哺乳动物细胞中的分泌表达

以正常人血淋巴细胞染色体ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增出短体前β神经生长因子（ｐｒｅ－ｐｒｏ－β－ＮＧＦ）编码基因。将所得基因片段重组于Ｍ１３噬菌体载体，筛选得到含中国人ｐｒｅｐｒｏ－β－ＮＧＦ基因的克隆。采用Ｓａｎｇｅｒ单链末端终止法测出其全部的核苷酸序列，该序列与国外文献所报道的仅有一个碱基不同。将该基因亚克隆于真核表达载体ｐＥＶ１，经转染哺乳动物细胞ＢＨＫ后，在培养上清中检测到了成熟型β－ＮＧＦ。     

胸腺嘧啶核苷激酶/丙氧鸟苷自杀基因系统旁观者效应机制的探讨

目的 探讨用单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶／丙氧鸟苷系统进行基因治疗时发生的旁观才效应机制。方法 构建表达ＨＳＶ－ＴＫ和β－半乳糖苷酶基因的重级逆转录病毒载体,将其分别直接导入胰腺癌细胞,细胞计数检测ＧＣＶ对ＨＳＶ－ＴＫ基因转化细胞的抑制作用;以Ｌａｃ Ｚ基因转化细胞为旁观细胞,唑蓝法检测旁观者效应,并通过上清移换实验１维拉帕米抑制实验及电镜观察超微结构。结果 ＧＣＶ对ＨＳＶ－ＴＫ基因转化细胞的生长     

中国人β神经生长因子基因的分子克隆,序列分析及其在哺乳…

以正常人血淋巴细胞染色体ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增出短体前β神经生长因子编码基因。将所得基因片段重组于Ｍ１３噬菌体载体，筛选得到含中国人ｐｒｅｐｒｏ－β－ＮＧＦ基因的克隆。采用Ｓａｎｇｅｒ单链末端终止法测出其全部的核苷酸序列，该序列与国外文献所报道的仅有一个碱基不同。将该基因亚克隆于真核表达载体ｐＥＶ１，经转染哺乳动物细胞ＢＨＫ后，在培养上清中检测到了成熟型β－ＮＧＦ。     

中国株HGV NS3 区基因的原核表达及其产物的抗原性分析

目的研究ＨＧＶＮＳ３区基因产物的抗原性,并探讨ＮＳ３蛋白在血清学检测中的应用。方法将中国株ＨＧＶＮＥ３区的３个基因片段分别克隆到ｐＲＳＥＴＢ和ｐＲＳＥＴＣ质粒载体中,构建成原核表达载体。ＩＰＴＧ诱导下,在大肠杆菌ＢＬ２１中高效表达,获得３个重组蛋白,用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和ＥＬＩＳＡ法分别对表达产物进行分析。结果所构建的表达载体均得到高效表达,得到的重组蛋白ＰＡ、Ｐ３和Ｐ４的分子量分别为４２０００,３００００和２４０００,在Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和ＥＬＩＳＡ反应中均可被ＨＧＶ阳性血清识别,其中ＨＧＶＮＳ３区Ｎ端的基因产物抗原性较强。结论中国株ＨＧＶＮＳ３区的Ｎ端存在优势的抗原决定簇,其基因产物有较好的抗原性。     

导入小鼠IFN-γ基因的肿瘤细胞的建立和鉴定

从小鼠脾细胞提取总ＲＮＡ,通过ＲＴ ＰＣＲ得到含信号肽的小鼠γ 干扰素（ｍＩＦＮ γ）全长ｃＤＮＡ,经测序鉴定后将其克隆到含标记基因ＮｅｏＲ的逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ中,采用脂质体法将其导入包装细胞ＰＡ３１７,经过包装,用含ｍＩＦＮ γ基因的缺陷型病毒上清感染小鼠肝癌细胞,经Ｇ４１８筛选建立起ｍＩＦＮ γ基因修饰株。ＰＣＲ、ＲＴ ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交结果显示有ｍＩＦＮ γ及标记基因的转入和表达。生物学活性测定也表明该基因修饰株细胞培养上清中有一定活性的ＩＦＮ γ分泌。     

中国株HGV NS3区基因的原核表达及其产物的抗原性分析

目的 研究ＨＧＶ ＮＳ３区基因产物的抗原性,并探讨ＮＳ３蛋白在血清学检测中的应用。方法 将中国株ＨＧＶ ＮＥ３区的３个基因片段分别克隆到ｐＲＳＥＴ Ｂ和ｐＲＳＥＴ Ｃ质粒载体中,构建成原核表达载体。ＩＰＴＧ诱导下,在大肠杆菌ＢＬ２１中高效表达,获得３个重组蛋白,用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和ＥＬＩＳＡ法分别对表达产物进行分析。结果 所构建的表达载体均得到高效表达,得到的重组蛋白ＰＡ,Ｐ３和Ｐ４的分子