Transwell接触共培养促进单散iPSCs生长及分化

 目的：观察Transwell接触共培养促进单散人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）生长及分化的作用。方法：将1～2代牛角膜内皮细胞（corneal endothelial cells, CECs）接种在Transwell小室底面培养8 h后,应用Accutase消化及40 μm过滤处理获得单散iPSCs,将其接种到已有CECs的Transwell小室内共培养14 d,前3 d使用mTeSR1培养基,第4天开始用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基。分别进行实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, qPCR)、免疫荧光、死活细胞染色及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）染色,对iPSCs多能特性表达及分化进行鉴定。设定单散iPSCs共培养组为实验组,常规培养iPSCs组为对照组（一）,非共培养单散iPSCs组为对照组（二）。结果：培养牛CECs形态呈典型的六边形铺路石样外观。人iPSCs呈克隆样生长,共培养3 d后iPSCs贴壁呈单散细胞生长,免疫荧光检测未分化标志Nanog和Oct4呈阳性。qPCR检测Nanog、Oct4和Sox2 mRNA表达,实验组与对照组（一）比较差异无统计学意义（P>005）。死活细胞染色显示,实验组死细胞明显减少,与对照组（二）比较差异有统计学意义（P<001）。共培养14 d后,人iPSCs形态比较均一,呈多边形,体积增大,无明显克隆团块;ALP染色阴性;免疫荧光染色ZO-1、AQP1和CD31表达阳性,CD34和CD133表达阴性。qPCR检测Oct4、Nanog和Sox2 mRNA表达明显下调,与对照组（一）比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论：与牛CECs共培养可增强人单散iPSCs活性,使iPSCs形态上向内皮样细胞转化,表达部分CECs的标志。Transwell接触共培养模型可以促进单散iPSCs生长及分化。     

lincRNA—ROR作为一个内源竞争RNA通过结合miR-145调节Oct4、Sox2和Nanog对结直肠癌干细胞生物学特性的影响及临床意义北大核心CSCD

目的探讨长链非编码RNA（lincRNA）－ROR作为一个内源竞争RNA（ceRNA）结合miR－145对下游干性相关基因Oct4、Sox2和Nanog的表达,及对结直肠癌干细胞生物学特性的影响,并阐明这种分子调控网络的临床意义。方法收集2014年至2016年间河南省南阳市中心医院及南阳市第二人民医院胃肠外科结直肠癌患者的癌组织及癌旁组织共52例,采用即时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）检测52例临床患者结直肠癌组织标本及结直肠癌细胞系中lincRNA－ROR、miR－145的表达;分析lincRNA－ROR和miR－145的表达与结直肠癌临床病理特征的相关性;流式细胞术从SW1116中分离CD44－CD133－和CD44＋CD133＋细胞;qPCR检测细胞中CD44、CD133、Oct4、Sox2、Nanog表达及CD44＋CD133＋细胞贴壁黏附后CD44、CD133、lincRNA－ROR、miR－145表达;生物信息学分析miR－145与lincRNA－ROR及核心转录因子Oct4、Sox2、Nanog之间靶向调控关系,双荧光素酶报告基因实验、qPCR、Western blot进行验证;噻唑蓝法、克隆形成检测沉默lincRNA－ROR对结直肠癌干细胞增殖及化疗敏感性的影响。结果结直肠癌组织中lincRNA－ROR高表达,miR－145低表达,两者呈显著负相关（P〈0.05）;lincRNA－ROR表达与肿瘤大小、淋巴结转移、远端转移有关（P〈0.05）,miR－145表达与肿瘤大小、肿瘤位置有关（P〈0.05）;流式细胞术成功分选出CD44＋CD133＋和CD44－ CD133－细胞,CD44＋CD133＋细胞中CD44、CD133、Oct4、Sox2、Nanog、lincRNA－ROR较CD44－ CD133－细胞高表达,miR－145低表达（P〈0.05）;贴壁黏附后CD44、CD133、lincRNA－ROR表达明显降低,miR－145表达增加（P〈0.05）;lincRNA－ROR能够结合miR－145调控Oct4、Sox2和Nanog表达;沉默lincRNA－ROR可显著抑制结直肠癌干细胞增殖克隆形成能力,增加其对顺铂、紫杉醇敏感性。结论lincRNA－ROR结合miR－145调控核心转录因子Oct4、Sox2和Nanog表达来影响结直肠癌干细胞增殖及化疗敏感性,为后续研究结直肠癌发生发展中遗传网络组分之间相互作用的病理生理功能提供了新见解,为结直肠癌治疗提供新思路。     

脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞的体外分化能力

背景：脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞具有很多相似的生物学特性。 目的：比较脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞与受损PC12细胞分别共培养后定向分化能力的差异。 方法：分别分离培养脂肪组织来源和骨髓组织来源的基质干细胞,取第5代细胞进行实验,2种细胞分别与正常或受损PC12细胞培养上清液共培养,或仅单独培养。 结果与结论：脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞均表达较高水平的CD44和CD29,而后者表达的CD45、CD56在前者几乎未检测到。单独培养的2种细胞均表达较高水平的Nanog、Oct4、Sox2,不表达神经元特异性烯醇酶。其中经受损PC12细胞干预的2种细胞Nanog、Oct4、Sox2表达水平显著降低,而脂肪基质干细胞中神经元特异性烯醇酶阳性细胞数更多,提示受损PC12细胞对于脂肪基质干细胞可能具有更强的诱导分化作用。     

羊水间充质干细胞体外培养方案的优化及生物学特性***

背景：目前干细胞工程种子来源多样化,羊水中存在胎儿脱落细胞,可分离培养出间充质来源干细胞。 目的：探索不同成分培养基对人羊水间充质干细胞(human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells,h-AFMSCs)体外培养的影响,并分析最适培养基体外培养的 h-AFMSCs 的生物学特性,建立优化的h-AFMSCs培养方案。 方法：孕16~24周的孕妇产前检查中获得羊水进行原代及传代培养并采用6种不同的培养基成分对h-AFMSC进行培养。 结果与结论：从孕中期羊水中可分离出h-AFMSCs,体外使用低糖DMEM培养基(L-DMEM)+体积分数10%胎牛血清与合成培养基MESEN PRO体积比1∶1配制的培养基对其扩增促进作用最强。h-AFMSCs高表达CD29、CD73、CD90、CD105、CD166,低表达CD14、CD34、CD45及HLA-DR;分离培养的h-AFMSCs高表达的干细胞基因为OCT-4和Nanog;h-AFMSCs体外具有向成骨、成脂细胞分化的潜能且具有抑制淋巴细胞增殖的作用。提示孕中期羊水是低免疫原性的h-AFMSCs的良好细胞来源。 关键词：羊水;间充质干细胞;优化培养;生物学特性;培养基 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.10.016     

表达肝细胞生长因子的大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞

目的:探讨悬滴培养诱导稳定表达人肝细胞生长因子(hHGF)的大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)向肝样细胞分化的效应。方法:体外分离和培养rMSCs,采用流式细胞术检测干细胞表面标志分子CD44、CD90、CD34和CD45的表达率;构建重组逆转录病毒表达载体pLNCX2-hHGF,包装病毒感染rMSCs,获得稳定表达hHGF的细胞株hHGF-rMSCs;分别对rMSCs和hHGF-rMSCs进行悬滴培养,在培养第7、14和21天,通过RT-qPCR和免疫荧光技术检测白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(APF)和角蛋白18(CK-18)在mRNA和蛋白水平上的表达,此外,还利用ELISA的方法检测培养液上清中ALB的分泌。结果:第3代rMSCs高表达CD44和CD90,几乎不表达CD34和CD45;构建表达载体后,成功建立了hHGF-rMSCs细胞株,且经过悬滴培养后,在第7～21天都呈现ALB、AFP和CK-18在mRNA水平上的高表达(P0.01);免疫荧光结果显示,AFP蛋白在第21天出现阳性表达,而ALB和CK-18蛋白在第7天就呈现阳性表达;在第7～21天,ELISA法均检测到hHGF-rMSCs细胞培养上清中ALB的分泌增多(P0.01)。结论:将HGF基因导入rMSCs,经悬滴培养可诱导分化为肝样细胞,可能为临床肝脏疾病的细胞治疗和体外生物人工肝提供新型种子细胞。     

改良法体外分离培养成年大鼠骨髓间充质干细胞实验研究

目的寻找一个稳定、快速、获取大量高纯度的成年骨髓间充质干细胞(BMSCs)的实验方法,为组织工程种子细胞来源提供实验依据。方法使用全骨髓贴壁法分离成年大鼠BMSCs,设立含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养组为对照组,含10%FBS、10ng/mL表皮生长因子(EGF)的DMEM/F12培养组为实验组,倒置显微镜下观察比较两组原代、传代后BMSCs的形态及生长情况,使用流式细胞仪检测实验组P6、P10细胞表面标记。结果实验组原代细胞达融合的时间为5～6d,对照组为7～9d。传代后实验组细胞贴壁伸展的时间为2h,而对照组为6h。对照组p1细胞达融合时间为5～6d,实验组P1细胞达融合时间为4d,流式细胞仪检测实验组P6、P10BMSCs,发现P6细胞92%细胞表达CD29,3.5%细胞表达CD44,有14%的细胞表达CD45;而P10BMSCs抗原表达具有较高的均一性,CD29/CD44强阳性表达,仅有2%的细胞表达CD45。结论 10%FBS、10ng/mL表皮生长因子(EGF)的DMEM/F12全骨髓贴壁法培养BMSCs能够稳定、简便、快速获取大量高纯度成年大鼠BMSCs,满足组织工程对种子细胞的要求。     

大鼠骨髓胚胎样干细胞的培养和鉴定

目的:探索骨髓胚胎样干细胞(ELSCs)的分离纯化和鉴定方法,并探讨该细胞分离培养方法的可行性。方法:采用全骨髓培养、明胶包被和无血清培养的方法,培养SD大鼠骨髓细胞,5 d后进行第1次传代,以后每2 d传代1次。观察其形态结构;免疫荧光检测其表面标志物CD73、CD90、CD105、SSEA-4、Sox-2、Nanog;流式细胞术检测干性标志物SSEA-4、OCT-4、Sox-2、Nanog的表达,并与骨髓间充质干细胞(MSCs)相比较;检测其向成骨细胞和成脂细胞的诱导分化能力。结果:获得的ELSC呈现长梭形,体积小且形态均一。免疫荧光示其表达CD73、CD90、CD105、SSEA-4、Sox-2、Nanog;流式细胞术检测示ELSCs表达CD73、CD90、CD105,且纯度高于95%,与MSCs相比,ELSCs的SSEA-4、OCT-4、Sox-2、Nanog等干性基因表达较高。结论:该方法获得的ELSCs干性较强、强度较高,可分离、培养出ELSCs。     

不同来源间充质干细胞表面标记的比较

目的 探讨人脐带间充质干细胞（HUCMSCs）、人脂肪间充质干细胞（ADSCs）和人经血源子宫内膜间充质干细胞（MenSCs）之间表面标记的差异及随培养代次增加表面标记的变化。 方法 分别将HUCMSCs、 ADSCs和MenSCs培养至第3、6、9、12代,用流式细胞术、免疫荧光法检测CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD45的表达并进行比较。 结果 培养MenSCs和HUCMSCs呈纺锤状,ADSCs形态多样以梭型、多角形为主。流式细胞术检测显示,人HUCMSCs、ADSCs和MenSCs的第3代CD29、CD44、CD73和CD105阳性表达率均在95%以上,CD45阴性表达;第3代MenSCs CD90的表达率为(72.43±0.76)%,均低于其在HUCMSCs（99.67±0.12）%和ADSCs（99.70±0.15）%表达（P＜0.001）。HUCMSCs、ADSCs和MenSCs随培养代次的增加表面标记CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD45表达率差异无显著性（P>0.05）。免疫荧光结果与流式细胞术结果一致。 结论 HUCMSCs、ADSCs和MenSCs随培养时间的增加稳定高表达 CD29、CD44、CD73、CD90和CD105,不表达CD45,MenSCs的CD90表达率低于其在HUCMSCs和ADSCs的表达。     

骨髓间充质干细胞的旁分泌能影响成骨细胞生物学功能

背景:有研究表明骨髓间充质干细胞移植可促进骨缺损的修复,但受损组织的缺血、缺氧和炎症反应限制了其临床应用。目的:观察骨髓间充质干细胞旁分泌作用对成骨细胞MG63增殖、迁徙、分化功能的影响。方法:Ficoll-Paque密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,制备骨髓间充质干细胞条件培养基培养成骨细胞MG63。CCK-8法检测MG63细胞增殖能力变化;细胞划痕法检测MG63细胞迁徙能力变化;微板检测MG63细胞合成碱性磷酸酶能力的变化;Real-time PCR法检测碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原及骨钙素基因表达量的变化;茜素红染色检测其矿化能力的变化。结果与结论:骨髓间充质干细胞表型为CD44、CD73、CD90表达强阳性,CD34表达阴性。与普通培养基(DMEM)相比,在骨髓间充质干细胞条件培养基作用下,MG63细胞的增殖速度明显加快;细胞划痕结果示其迁徙能力明显提高;诱导第4,7天后碱性磷酸酶基因表达量及蛋白合成量明显增多(P0.01);Ⅰ型胶原及骨钙素基因表达量在诱导第4天后差异无显著性意义,诱导第7天后较对照组明显升高(P0.05);茜素红染色示骨髓间充质干细胞条件培养基诱导MG63细胞21 d后钙结节形成增多,矿化沉积作用增强。结果证实,骨髓间充质干细胞的旁分泌物质可以显著促进成骨细胞的增殖、迁徙、分化和矿化能力。     

人诱导性多能干细胞向神经干细胞分化的方法探讨

目的:探讨人诱导性多能干细胞(iPS细胞)体外定向分化为神经干细胞(NSCs)的方法。方法:人iPS细胞悬浮培养4 d形成的拟胚体(EB)经维甲酸(RA)诱导4 d,诱导后的EB在无血清培养基中筛选并扩增培养。倒置显微镜下观察诱导后细胞的形态变化,RT-PCR检测iPS细胞多能性基因Nanog、Oct4和Sox2的表达,免疫荧光法检测NSCs特异性标志物Nestin、神经元标志物β-tubulinⅢ和神经胶质细胞标志物GFAP的表达。结果:(1)人iPS细胞在饲养层细胞上稳定传代,表达多能性基因Nanog、Oct4和Sox2,去除饲养层后悬浮培养能形成球形EB;(2)经RA诱导后的EB在无血清培养基中筛选培养第1 d贴壁生长,周围爬出细胞;第3 d,在高倍镜下可见中央聚集的细胞呈环形的rosette结构,rosette结构增多到第7 d达高峰。对照组未观察到rosette结构。随后大部分rosette细胞脱离瓶壁悬浮生长,形成神经球样克隆。免疫荧光显示神经球呈nestin阳性表达。贴壁培养的神经球能分化成β-tubulinШ和GFAP阳性细胞。结论:RA诱导结合无血清培养基筛选法能诱导iPS细胞高效分化为NSCs。     

5-氮杂胞苷诱导大鼠心脏成纤维细胞向心肌样细胞分化进程相关基因的表达差异

目的 探讨5-氮杂胞苷（5-aza）诱导心脏成纤维细胞（CFs）向心肌样细胞分化5 d、7 d、14 d、21 d和28 d相关基因的表达差异。方法 新生1～3 d SD大鼠12只,胰蛋白酶/胶原酶联合消化法分离培养新生大鼠CFs,采用CFs分子标记盘状结构域受体2（DDR2）并行细胞免疫荧光染色。含15 μmol/L 5-aza心肌细胞诱导液培养第3代CFs, Real-time PCR检测心肌化诱导不同时间点相关基因vimentin、DDR2、Nanog、sox2、c-kit、sca-1、Tbx5、CD73、CD34、cMyc、klf4、Gata4、Oct4、Mef2c和心肌肌钙蛋白T（cTnT）的表达差异,细胞免疫荧光检测心肌化诱导后5 d、7 d、14 d、21 d和28 d肌钙蛋白T（cTnT）的表达。透射电子显微镜观察心肌化诱导28 d CFs的超微结构变化。结果 5-aza诱导CFs后3 d 细胞生长速率减慢,部分细胞由三角形、梭形向圆形和杆状转变。诱导后7 d、14 d、21 d 和28 d,与诱导前相比,DDR2表达稳定,vimentin在14 d表达下降,Nanog、c-kit、sox2和Tbx5伴随着心肌化进程呈现表达下降趋势,而CD73、Mef2c、CD34、Gata4、Oct4和cTnT表达逐步增加,sca-1在7 d 表达上升又下降,cMyc和klf4在14 d表达上升又下降。诱导后 5 d少量细胞表达cTnT,14～21 d cTnT阳性细胞数明显增高,28 d表达cTnT较多且趋于稳定。透射电子显微镜显示,CFs心肌化诱导28 d,细胞与细胞间出现端-端连接,细胞质内出现大量的肌原纤维,排列较为规律,但肌节不明显,H带、Z线和M线显示不清。结论 CFs经5-aza诱导,可向心肌样细胞分化,但不能形成成熟的心肌细胞。     

Nanog蛋白在CD73+小鼠脂肪源间充质干细胞中的表达

目的 探讨Nanog蛋白在小鼠脂肪源间充质干细胞(ADMSCs)中的表达规律.方法 体外分离培养ADMSCs,利用流式细胞仪从ADMSCs中分选出CD73+和CD73 -两个细胞亚群.体外分别培养两组细胞,用免疫细胞化学和免疫荧光测定两组细胞Nanog蛋白的表达,并比较其差异.结果 CD73+ ADMSCs细胞约占总细胞的5％,形态上分为大细胞和小细胞.Nanog蛋白在CD73+ ADMSCs细胞中强阳性表达率(16.85±6.83)％,弱阳性表达率(81.78 ±7.19)％,阴性表达率(1.63±3.59)％;nanog蛋白在CD73 - ADMSCs细胞中强阳性表达率(5.74±2.79)％,弱阳性表达率(85.84 +37.31)％,阴性表达率(8.42±4.12)％.在Nanog阳性表达的细胞中可见不同分裂时相的有丝分裂细胞,CD73+细胞的分裂象明显多于CD73 -细胞.结论 CD73和Nanog可能均是ADMSCs特异性表达的标志,Nanog蛋白强阳性的细胞可能更具幼稚性.通常采用分离培养方法获得的ADMSCs是多种细胞的复合物.     

人脐带Wharton’s jelly源间充质干细胞培养中碱性成纤维细胞生长因子的作用

背景:培养脐带源间充质干细胞过程中,细胞形态常易变得宽大不规则,传代不易贴壁,死亡率高,找到一个维持细胞稳定的方法是有必要的。目的:拟采用组织块培养法从人脐带Wharton’s jelly中分离培养间充质干细胞,观察碱性成纤维细胞生长因子对其生物学特性的影响。方法:采用组织块法分离培养和扩增脐带组织间充质干细胞,对照组用DMEM/F12培养基+体积分数为10%胎牛血清培养,实验组用DMEM/F12培养基+体积分数为10%胎牛血清+20μg/L碱性成纤维细胞生长因子培养。观察组织块游出细胞的时间和细胞形态,每隔3d或4d更换培养液,待细胞达到80%~90%融合时,用0.25%胰酶消化后,按1:2或1:3的比例传代。结果与结论:倒置显微镜下观察对照组中从8~10d开始有细胞从组织块四周游出贴壁,实验组中从6~8d开始有细胞从组织块四周游出贴壁,1周后可见多数呈长梭形或扁平形的成纤维样细胞,围绕组织块成旋涡状,前3代细胞形态及传代间隔时间两组基本相同;3代以后实验组细胞较对照组易于贴壁,传代死亡率低,生长曲线提示增殖能力强。流式细胞术分析两组细胞周期显示第3,6代70%以上的细胞处于G0/G1期,且第3,6代细胞均阳性表达CD29,CD44,弱表达HLA-ABC,不表达CD34、CD45和HLA-DR。结果提示采用组织块培养法可从人脐带Wharton’s jelly中分离出具有间充质干细胞特性的细胞,且碱性成纤维细胞生长因子能使细胞从组织块游出时间提前和有助于促使细胞贴壁,一定程度上维持细胞形态稳定性,提高增殖能力,并且不改变细胞的表面标志物表达。     

人胚胎干细胞向间充质干细胞分化的低血清诱导法的建立

目的建立人胚胎干细胞向间充质干细胞分化的低血清诱导方法。方法用低血清培养体系培养人胚胎干细胞,每3 d半量换液,7~10 d后消化成单细胞用扩增培养基培养,每3 d传代1次。结果人胚胎干细胞呈克隆样增殖,边缘呈锯齿状,表达多能干细胞标志OCT4、SOX2和NANOG。诱导3 d后,克隆间隙出现体积较小的成纤维样细胞,增殖能力强,经两次传代后可获得形态一致的长梭形细胞。这些细胞表达间质细胞标志VIMENTIN,细胞均表达CD105、CD90、CD73、CD44和HLA-ABC,不表达CD34、CD45和HLA-DR,且具有成脂和成骨分化能力。结论用低血清诱导法能快速获得较高纯度的人胚胎干细胞源性间充质干细胞。     

脐带间充质干细胞在不同培养体系条件下的生物学特性

背景：体外培养的脐带间充质干细胞在不同培养体系下生长状态差异显著,因此选取一种更适合的培养基相当必要。 目的：对比观察人脐带间充质干细胞在3种培养基中的生长增殖情况,并检测细胞免疫表型以及间充质干细胞的诱导分化能力。 方法：在无菌条件下用贴块法收获人脐带间充质干细胞,用T75培养瓶培养传代后,取第3代脐带间充质干细胞分别种入到含体积分数为5%胎牛血清的DMEM/F12培养基、含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和Mesen PRO RSTM培养基中,培养第1,3,5,7天进行细胞计数,绘制细胞生长曲线。采用流式细胞仪分析第3代脐带间充质干细胞免疫表型,并检测其成骨及成脂肪诱导分化能力。 结果与结论：培养出的第3代人脐带间充质干细胞高表达CD44、CD73、CD90、CD105,不表达CD29、CD31、CD34、HLA-DR。经成脂诱导后,油红O染色可见胞浆中有大量红色小脂滴;成骨诱导后,茜素红染色后镜下可见成骨样细胞团,说明脐带间充质干细胞在体外具有多向分化的潜能。在倒置显微镜下观察可见含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中的细胞集落密集,形态均匀,而其他2种培养基中的细胞集落密集程度和形态都不如前者好。在培养传代细胞时,可优先选择含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

采用组织贴壁法从整根脐带分离培养间充质干细胞及其生物学特性的研究

 为了建立从整根脐带中分离培养间充质干细胞(UC-MSCs)的技术,并对其生物学特性进行研究。采用组织贴壁法分离UC-MSCs, 并通过传代进行纯化和扩增培养, 绘制生长曲线：用流式细胞仪检测UC-MSCs表面抗原及细胞周期; 在特定诱导体系中,检测UC-MSCs向脂肪、成骨及软骨分化的能力;采用RT-PCR检测多能干细胞标志多能干细胞标志Oct4, Sox-2, Nanog mRNA水平。结果表明,　成功建立了UC-MSCs分离培养的方法;流式细胞仪检测结果显示, 贴壁细胞均表达CD73 、CD90 、CD105, 不表达造血细胞表型CD34、CD45 和HLA-DR ;细胞倍增时间为(24.04±0.49)h , 细胞周期分析表明,G0～G1 期和S+ G2 + M 期所占比例分别为81.56 %和18.44%;UC-MSCs能够向脂肪、成骨和软骨分化;表达Oct4, Sox-2, Nanog基因。结论：组织贴壁法是一种较好的分离培养UC-MSCs的方法,培养的细胞为具有增殖能力强和更原始间充质干细胞,为建立间充质干细胞库和临床应用提供了理论依据。     

肿瘤坏死因子α刺激骨髓间充质干细胞表达及分泌肝细胞生长因子

背景：有研究表明,肿瘤坏死因子α可以刺激骨髓间充质干细胞发挥免疫抑制功能,并促进骨髓间充质干细胞表达肝细胞生长因子。 目的：观察肿瘤坏死因子α刺激大鼠骨髓间充质干细胞是否可以促进肝细胞生长因子的表达及分泌。 方法：全骨髓贴壁法分离、纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞,传代至第三四代使用。以100 µg/L肿瘤坏死因子α预刺激骨髓间充质干细胞 5 h后弃去培养基,换上新鲜培养基作为实验组,以正常培养的骨髓间充质干细胞为空白组。采用倒置相差显微镜观察细胞形态;流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞表面标记物CD29、CD34、CD44、CD45的表达;RT-PCR 、Western blot检测细胞肝细胞生长因子mRNA及蛋白表达;ELISA测定细胞上清液中肝细胞生长因子水平。 结果与结论：获得的骨髓间充质干细胞形态均一,呈典型的旋涡样生长。骨髓间充质干细胞表达CD29⁺99.45%,CD34^-97.91%、CD44⁺99.52%、CD45^-98.42%;骨髓间充质干细胞中肝细胞生长因子 mRNA及蛋白与上清液中肝细胞生长因子表达量呈时间依赖性增加,实验组肝细胞生长因子 mRNA及蛋白与上清液中肝细胞生长因子的表达量明显高于空白组(P < 0.01)。说明肿瘤坏死因子α刺激骨髓间充质干细胞可以有效促进肝细胞生长因子的表达及分泌。     

髓核细胞共培养诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化

背景：骨髓间充质干细胞近年来作为种子细胞被广泛应用于髓核组织工程。在诱导骨髓间充质干细胞向髓核细胞分化的过程中,需要提供适当的细胞外微环境以及生长因子。 目的：研究体外与髓核细胞非接触共培养和生物诱导剂条件下,兔骨髓间充质干细胞向类髓核样软骨细胞分化的可行性。 方法：用单层培养法分别分离培养兔骨髓间充质干细胞和髓核细胞。选用第3代的髓核细胞和骨髓间充质干细胞置于Transwell培养皿上下层构建共培养体系并加入转化生长因子β1为主的生物诱导剂诱导培养21 d,以高糖DMEM培养基单独培养的骨髓间充质干细胞作为阴性对照。 结果与结论：分离培养的兔骨髓间充质干细胞细胞表面CD29和CD44表达阳性,CD34、CD45的细胞表达阴性。与髓核细胞共培养诱导21 d后,可观察到骨髓间充质干细胞形态向多角形类圆形转变,胞质中分泌Ⅱ型胶原颗粒明显增多,RT-PCR结果表明诱导后细胞中Ⅱ型胶原mRNA表达明显增高。结果说明骨髓间充质干细胞在与髓核细胞共培养加生物诱导剂条件下可成功诱导分化为类髓核细胞。     

不同分离方法及培养条件对兔骨髓间充质干细胞生物活性的影响

背景:骨髓间充质干细胞常被用作骨组织工程的种子细胞和基因治疗的载体细胞,如何获得纯度较高活性较好的骨髓间充质干细胞是很多研究者关心的问题。目的:观察不同分离方法及培养条件对兔骨髓间充质干细胞生物活性的影响。方法:分别用密度梯度离心法、全骨髓培养法和红细胞裂解液法提取兔骨髓间充质干细胞,48h后观察各组获得的细胞量,记录各组首次传代时间,相差显微镜观察细胞的形态,流式细胞仪鉴定其CD44抗原表达。分别用DMEM-LG、MEM-HG和DMEM/F123种培养基培养第3代细胞和第7代老化细胞,MTT法和计数板计数法比较不同时间点3种培养基培养细胞的生长情况,相差显微镜观察老化细胞的形态变化。结果与结论:3种分离方法均能得到较均一的梭形或者多角形贴壁细胞,胞核大胞浆丰富,CD44抗原表达阳性。其中红细胞裂解液法获得的贴壁细胞的量较其他方法多,首次传代时间短(P0.05)。用DMEM/F12培养的细胞活力更好,细胞生长更迅速,并且经过DMEM/F12培养一段时间后,部分静止期细胞开始分裂增殖。提示红细胞裂解液法能够提高骨髓间充质干细胞的贴壁效率,是一种方便、有效的提取方法;DMEM/F12更能够促进细胞的增殖,较适合于培养骨髓间充质干细胞。     

激活素A对离体培养大鼠卵泡发育的影响

激活素A是一种由卵泡液中提取出来的蛋白,主要以旁分泌和自分泌途径调节卵泡颗粒细胞功能,而对卵泡发育的影响却不十分清楚。本实验目的旨在探讨激活素A对大鼠离体培养卵泡发育的影响。用胶原酶分离窦前卵泡并分别加入激活素A（140μg/L)、FSH（0．1IU/mL)以及卵泡抑素（FS）在DMEM培养液中进行离体卵泡培养4d,观察卵泡直径、雌二醇分泌的变化。结果表明：激活素A处理组和FSH＋激活素处理组的卵泡直径显著增大（P＜0．01）。FSH＋激活素A处理组雌二醇的分泌显著增加。FS可抑制激活素A对卵泡发育的影响。结果显示：激活素A可以促进未成年大鼠窦前卵泡的生长发育。