体外诱导骨髓间充质干细胞向胆管上皮样细胞分化

背景：肝外胆管和胆囊上皮细胞的分离、纯化相对比较容易,但是胆管上皮细胞在体外易失去增殖能力,难以提供基础研究所需的细胞量,限制了胆管修复等基础研究的进程。虽然骨髓间充质干细胞可以转化为肝细胞,但是尚无体外培养骨髓间充质干细胞分化为胆管上皮细胞的报道。 目的：探讨体外诱导骨髓间充质干细胞分化为胆管上皮细胞的可行性。 方法：采取全骨髓贴壁筛选法体外分离并纯化大鼠骨髓间充质干细胞后,在第3代骨髓间充质干细胞培养基中加入肝细胞生长因子和表皮生长因子,倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞的形态学变化,免疫荧光检测不同时间CK19的表达情况。 结果与结论：在肝细胞生长因子和表皮生长因子的诱导下,骨髓间充质干细胞由梭形逐渐变为多边形、三角形;免疫荧光检查显示诱导第4周细胞膜开始表达CK19,诱导第6周CK19表达率明显提高。结果表明在两种细胞因子联合诱导下骨髓间充质干细胞能够转化为胆管上皮样细胞,从而为骨髓间充质干细胞修复损伤胆管提供了一个新思路。     

水通道蛋白1在生后小鼠精囊腺与前列腺发育过程中的表达与分布

目的 探讨水通道蛋白1(AQP1)在雄性小鼠出生后不同发育阶段精囊腺和前列腺的表达与分布.方法 应用RT-PCR、免疫印迹和免疫组织化学染色方法,检测出生后15d、35d、70d 小鼠精囊腺、前列腺AQP1 mRNA、蛋白表达水平及细胞定位.结果 RT-PCR与免疫印迹结果均显示,出生后70d小鼠精囊腺、前列腺AQP1 mRNA及蛋白表达量较出生后15d显著增强(P<0.05);免疫组织化学染色显示,AQP1蛋白仅表达于出生后15d、35d小鼠精囊腺平滑肌细胞、前列腺腺泡上皮细胞基膜及间质细胞,而此时期精囊腺上皮细胞AQP1蛋白表达呈阴性;出生后70d,AQP1蛋白强烈表达于精囊腺和前列腺上皮细胞.结论 AQP1 mRNA及蛋白在雄性小鼠精囊腺、前列腺的表达与分布随年龄增长而改变,此变化可能与雄性附属性腺发育相关.     

尼古丁暴露对成年昆明小鼠大脑内Presenilin 1表达的影响

目的探讨尼古丁暴露对成年昆明小鼠大脑内Presenilin 1(PS1)表达的影响。方法 SPF级雄性成年昆明种小鼠50只,随机分为对照组,生理盐水组、尼古丁组,尼古丁组依据注射尼古丁溶液时间再细分为Tes1(10d)、Tes2(20d)、Tes3(40d),应用RT-PCR和Western blot方法分别检测小鼠大脑内PS1 mRNA和PS1蛋白表达情况,免疫组织化学染色方法检测PS1在小鼠大脑内表达的部位。结果免疫组织化学检测发现,对照组中的大脑皮层、海马细胞层和第三脑室周围有大量PS1阳性细胞分布,在海马细胞层之间的纤维区域有PS1阳性反应物集聚。尼古丁组仅见第三脑室周围有较多PS1阳性细胞分布,RT-PCR和Western blot方法检测发现,尼古丁组中PS1 mRNA和PS1蛋白表达水平都明显低于对照组和生理盐水组(P<0.05)。结论尼古丁暴露可以抑制成年昆明小鼠大脑皮层、海马细胞层、海马细胞层之间纤维区域中PS1的表达。     

β-catenin在四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化过程中的定位、表达及意义

目的 探讨肝纤维化发生过程中β-连环蛋白(β-catenin)定位、表达及意义.方法 健康雄性昆明小鼠(n=45)随机分为对照组(n=15)与实验组(n=30).实验组小鼠皮下注射50% 四氯化碳(CCl4)-粟米油混合液(6ml/kg),2次∕周,对照组皮下注射同等剂量的粟米油.各组分别于造模1周、4周和8周后取小鼠肝脏,常规制作石蜡切片,Masson染色及Desmin免疫组织化学法观察比较不同组别小鼠肝纤维化病理变化,RT-PCR及免疫组织化学方法检测不同时间点各组小鼠肝组织内β-catenin的表达及定位.结果 Masson染色结果显示,对照组肝汇管区结缔组织内及血管壁有少量细小纤维,实验组小鼠肝脏汇管区和中央静脉及其周围胶原纤维增多;随损伤时间延长纤维增生愈加明显.Desmin免疫组织化学结果显示,各组别均有阳性表达,但损伤组各时间点desmin阳性表达细胞数明显高于对照组(P<0.05 或P<0.001).RT-PCR结果显示,CCl4损伤1周后肝内β-catenin mRNA水平与对照组相比无明显差别(P＞0.05),损伤4周及8周β-catenin mRNA水平则明显下降,与对照组相比差异均有显著性(P<0.01).免疫组织化学结果显示,对照组β-catenin弱表达于肝细胞膜及胆管上皮细胞膜和胞质,而损伤组β-catenin阳性反应主要定位于肝内增生的细胞团及新生胆管上皮细胞质,各组间积分吸光度值差别有显著性(P<0.01).结论 CCl4诱导的肝纤维化过程中β-catenin mRNA表达与蛋白表达不同步,阳性表达细胞主要为新生的细胞团及胆管上皮细胞.     

远端同源异型盒2和叉头盒O3a在大鼠脑皮质发育过程中的分布与表达

目的 了目的 探讨远端同源异型盒2（Dlx2）和叉头盒O3a（FoxO3a）在SD大鼠脑皮质发育过程中的表达特点。 方法 应用Real-time PCR法检测Dlx2 mRNA和FoxO3a mRNA分别在受孕11d（E11）、E13、E15、E17、E19及生后1d（P1）的表达情况;应用免疫组织化学技术显示Dlx2和FoxO3a在E11、E13、E15、E17、E19及P1蛋白的表达情况。 结果 FoxO3a与Dlx2 mRNA在E11～P1均有表达,而FoxO3a mRNA表达高峰明显早于Dlx2 mRNA;Dlx2 mRNA表达在E15～E17时大幅度上升,而在此之后始终保持这一高水平的表达;Dlx2 mRNA与FoxO3a mRNA的表达在E15～P1呈现出一致的变化趋势;Dlx2基因在E19时出现mRNA水平的高表达而未见蛋白表达。 结论 Dlx2和FoxO3a基因在胚胎后期鼠脑皮质中均有表达,且其表达趋势具有一定的一致性;两基因的分布随皮质分层而改变。     

血管内皮生长因子家族及其受体在早期人胚胎肝发育过程中的作用

目的通过观察血管内皮生长因子A（VEGFA）、血管内皮生长因子C（VEGFC）及其受体flt-1、flk-1、flt-4在人胚胎肝发育过程中的表达，了解血管内皮细胞和造血细胞与人胚胎肝干细胞发育的关系。方法运用E3～12周胚胎，石蜡切片，免疫组织化学染色，光镜下观察人肝干细胞的发育、与血管内皮细胞和造血细胞的关系及其表达VEGFA、VEGFC等生长因子及其受体的情况。结果E3～5周人胚肝细胞具有幼稚细胞的形态特点，并星c—Met阳性反应。E10～12周，c—Met阳性的肝干细胞主要分布于汇管区周围。E4～6周胚，少数肝干细胞呈VEGFA免疫反应阳性，E7周以后阳性反应消失。VEGFC、flt-1、flk-1、flt-4阳性肝细胞在4～12周胚胎肝内都可检测到。E4～6周，靠近肝芽的横隔间充质中可见较多的血管内皮细胞，并正在形成血管，而在远离肝芽处的内皮细胞和毛细血管较少。E4、5周时，靠近原始肝的横隔间充质组织中血管内皮细胞呈VEGFA、VEGFC、flt-1、flk-1和flt-4阳性，肝内的血管内皮细胞为VEGFA、flt-1、flk-1、VEGFC和flt-4免疫反应阴性。E4～12周胚胎，造血细胞呈VEGFA和flt-4阳性反应，而VEGFC和flt-1、flk-1免疫反应阴性。结论肝干细胞的发育受肝外间充质血管产生的VEGFA、VEGFC的诱导和调节。造血细胞分泌的VEGFA可以通过旁分泌途径调节肝干细胞的发育，而造血细胞的发育依赖于肝干细胞产生的VEGFC。     

大鼠视网膜表达生长抑制mRNA细胞的发生

目的：研究视网膜中表达生长抑素mRNA神经元的发生和发育规律。方法：原位杂交组织化学。结果：胚胎第十三天（E13），视网膜内层就可以检测到生长抑素mRNA阳性细胞。从E14到E17阳性细胞增加迅速，E17达到高峰，此时视网膜节细胞层大部分为生长抑素mRNA阳性细胞，细胞排列紧密，从E18开始，阳性细胞逐渐减少，细胞排列开始稀疏。出生后当（PND0）阳性细胞数显著下降，从PND0到PND15，阳性细胞继续减少，阳性细胞主要位于节细胞层，PND20时，阳性细胞的数目及分布均与成年动物相似，部分已迁移至内核层的内表面。细胞开始或停止表达生长抑素mRNA均是从视网膜中央开始，然后向周围。结论：首次发现生长抑素基因在胚胎期的节细胞中一过性表达，提示生长抑素在视网膜节细胞的产生，分化以及视觉通路的形成与成熟有关。     

orexin A和orexin 1型受体在新生大鼠与成年大鼠延髓分布的比较

本文研究orexinA(OXA)和orexin 1型受体(OX1R)在新生大鼠与成年大鼠延髓的分布及比较。新生(1～5d)和成年(6～8周)SD大鼠,取其延髓,采用免疫组织化学方法和图像分析技术,观察OXA和OX1R在新生与成年SD大鼠延髓的分布。结果显示,OXA免疫反应阳性纤维和OX1R免疫反应阳性细胞在新生和成年SD大鼠延髓内有广泛分布,主要分布在延髓腹外侧区(ventrolateralmedulla,VLM)和舌下神经核(hypoglossalnucleus,XII)。在这两个区域,新生大鼠组的OX1R免疫反应阳性细胞的相对光密度值均低于成年大鼠组(P<0.001)。结果表明随着大鼠发育成熟,OX1R表达水平增加,可能与其生理功能完善有关。OXA免疫反应纤维和OX1R免疫反应阳性细胞在延髓的VLM和XII的表达提示可能与心血管和呼吸等活动的调节有关。     

Expression of growth arrest-specific protein 7 in the entorhinal cortex of rat during development

目的:研究生长休止蛋白7(Gas7)在大鼠内嗅皮质(EC)不同发育阶段的表达.方法:采用免疫组织化学方法观察Gas7在SD大鼠胚胎第18.5天(E18.5 d)、新生第0天(P0 d)、P7、P14、P21和成年EC中的表达.结果:Gas7免疫阳性产物出现在E18.5 d大鼠ECⅡ板层的表面,至P7d向Ⅱ板层内分布,并可见清晰的Gas7阳性细胞,Gas7免疫阳性产物表达于胞膜和胞质.到P14 d,Gas7阳性细胞深染并向内扩散至Ⅵ板层,其中Ⅱ板层阳性细胞最密集,形态上以锥体样细胞和星形细胞多见.P21 d大鼠内嗅皮质各板层Gas7免疫阳性反应均弱于P14 d,至成年,Gas7免疫阳性细胞基本上局限于Ⅱ板层内,呈中等度着色.Gas7在围产期大鼠EC的表达呈现先增高后降低的趋势,最高点在P14 d,至P21 d其表达强度和分布接近成年水平.结论:Gas7在大鼠内嗅皮质发育过程中的表达呈现时空特异性,提示Gas7可能参与了内嗅皮质发育过程中结构形成和功能成熟的调控.     

发育小鼠胰腺胃泌素免疫反应细胞的形态及数量变化

目的观察小鼠胰腺内胃泌素免疫反应细胞(G-IR细胞)的个体发生、分布、形态及数量变化。方法免疫组织化学技术。结果小鼠胰腺中G-IR细胞最早出现于胚胎第12d,至胚胎第18d前分布于外分泌部及胰岛内;此后直至成年,仅见于胰岛内。G-IR细胞的总数胚胎期以第15d组最多,随后数量逐渐减少,至第17d组降至最低;此后至出生直至成年,数量逐渐增加。强阳性G-IR细胞数量以胚胎第15d组最多,出生后第15d至成年,胰腺内无强阳性细胞。G-IR细胞形态多样,可见免疫反应阳性的细胞突起伸至其它细胞之间。结论小鼠胰腺中G-IR细胞发生、分布及数量变化规律有别于其它种属。胃泌素在胚胎期小鼠胰腺内的表达,提示其可能与胰腺早期发育有关。     

低氧诱导因子-1在小鼠胚胎神经胚形成阶段的发育学表达

为研究低氧诱导因子-1(HIF-1)在小鼠胚胎神经胚形成阶段的时空表达规律,探讨HIF-1在胚胎神经系统发生和发育过程中的作用。本研究以地高辛标记的HIF-1αcRNA为探针,采用全胚胎原位杂交技术,观察HIF-1α在神经胚形成阶段的表达规律。结果显示在E8.5d,整个鼠胚神经管的头端和尾端均可观察到HIF-1αmRNA的表达,此时表达较弱。在E9.5d,随着神经管的逐渐关闭,HIF-1αmRNA在前脑泡、第一鳃弓、第二鳃弓、后脑泡处急剧增多,并在发育中的眼部有较强的表达;此外在中脑泡以及心脏原基有较弱的表达。到E10.5d,阳性信号除在E9.5d检测到的部位继续富集外,在端脑、间脑、发育中的肢芽以及尾部也出现较强的HIF-1αmRNA的表达,且在心脏原基的表达亦进一步增强。E11.5d时在连合板、喙区、第一鳃弓、第二鳃弓、后脑、延脑、发育中的肢芽以及尾部末端可检测到HIF-1αmRNA的明显表达。以上结果提示HIF-1可能参与了小鼠神经胚形成的发育过程。     

脂多糖对不同发育期小鼠肝脏β-防御素3表达的影响

目的:观察在脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导条件下,胎鼠(E14.5,E17.5),新生鼠(P0,P4)以及成年鼠肝脏中鼠β-防御素3(mouseβ-defensin 3,mBD-3)基因表达。方法:100只孕鼠随机平均分成2组:LPS感染组(E14.5、E17.5、P0、P4、a-dult),正常对照组(E14.5、E17.5、P0、P4、adult)(n=50)。LPS感染各组分别于E13.5,E16.5,E17.5(Embroynic day)天,孕鼠腹腔注射550μg.kg-1LPS(100μl),同时正常对照组也注射等量生理盐水,24 h后取出肝脏。提取RNA及蛋白,采用RT-PCR及Western blotting检测mBD-3的RNA及蛋白表达;同时取出左半肝经4%多聚甲醛固定后,石蜡包埋切片,免疫组化法检测mBD-3的阳性表达,图像分析系统进行定量分析,并进行统计学处理。结果:正常对照组小鼠肝脏在胎鼠以及新生鼠期均未检测到mBD-3的表达,而LPS感染组小鼠肝脏在胎鼠以及新生鼠时期均检测到大量mBD-3的阳性表达,且随着时间的增加呈上升的趋势(P0.05)。结论:mBD-3在正常的胎肝以及新生小鼠肝脏中未检测到表达,在LPS的诱导下,其在不同发育期小鼠肝脏组织中表达均明显增高。这提示不同发育阶段小鼠肝组织在受到外界感染侵袭后,mBD-3可能是肝组织抵抗微生物感染的重要抗菌分子。     

Attenuated liver fibrosis and depressed serum albumin levels in carbon tetrachloride-treated IL-6-deficient mice.

Chronic intermittent injection of carbon tetrachloride (CCl4) for more than 10 weeks induced liver fibrosis in mice, as evidenced by positive Azan staining and increased intrahepatic collagen content. Preceding the onset of liver fibrosis, interleukin-6 (IL-6) gene expression was enhanced in liver and immunoreactive IL-6 was detected in infiltrating inflammatory cells. To delineate the role of IL-6 in this process, we treated IL-6-deficient mice with CCl4 in a similar manner for 12 weeks, after which fibrotic changes were less evident and serum albumin levels were lower in IL-6-deficient than wild-type mice. Moreover, CCl4-induced expression of transforming growth factor beta1 and hepatocyte growth factor genes in liver was significantly reduced in IL-6-deficient mice. Thus, IL-6 may be vitally involved in fibrotic changes and maintenance of serum albumin levels, partly by modulating intrahepatic expression of these cytokines.     

肝细胞核因子4在肝细胞分化和成熟中的作用

肝细胞核因子4在肝脏发育及肝细胞的分化、成熟过程中有着重要的调控作用,通过与肝特异基因启动子结合而影响肝特异基因的表达,促进肝细胞极化结构的形成,调节肝细胞的物质代谢和生物转化,并且能够抑制肝脏肿瘤的发生。     

Entamoeba histolytica calreticulin: an endoplasmic reticulum protein expressed by trophozoites into experimentally induced amoebic liver abscesses

Entamoeba histolytica calreticulin (EhCRT) is remarkably immunogenic in humans (90-100% of invasive amoebiasis patients). Nevertheless, the study of calreticulin in this protozoan is still in its early stages. The exact location, biological functions, and its role in pathogenesis are yet to be fully understood. The aim of the present work is to determine the location of EhCRT in virulent trophozoites in vivo and the expression of the Ehcrt gene during the development of experimentally induced amoebic liver abscesses (ALA) in hamsters. Antibodies against recombinant EhCRT were used for the immunolocalization of EhCRT in trophozoites through confocal microscopy; immunohistochemical assays were also performed on tissue sections of ALAs at different times after intrahepatic inoculation. The expression of the Ehcrt gene during the development of ALA was estimated through both in situ RT-PCR and real-time RT-PCR. Confocal assays of virulent trophozoites showed a distribution of EhCRT in the cytoplasmic vesicles of different sizes. Apparently, EhCRT is not exported into the hepatic tissue. Real-time RT-PCR demonstrated an over-expression of the Ehcrt gene at 30 min after trophozoite inoculation, reaching a peak at 1-2 h; thereafter, the expression fell sharply to its original levels. These results demonstrate for the first time in an in vivo model of ALA, the expression of Ehcrt gene in E. histolytica trophozoites and add evidence that support CRT as a resident protein of the ER in E. histolytica species. The in vivo experiments suggest that CRT may play an important role during the early stages of the host-parasite relationship, when the parasite is adapting to a new environment, although the protein seems to be constitutively synthesized. Moreover, trophozoites apparently do not export EhCRT into the hepatic tissue in ALA.     

Biliary epithelial expression of MUC1, MUC2, MUC3 and MUC5/6 apomucins during intrahepatic bile duct development and maturation. An immunohistochemical study.

Phenotypic alterations of biliary epithelial cells such as changes in intermediate filament composition and presence of carbohydrate residues, occur during the development of intrahepatic bile ducts. In this study, we examined the expression of MUC1, MUC2, MUC3, and MUC5/6 apomucins (mucin core proteins) by immunohistochemical means in the human intrahepatic bile duct during its development and maturation. In the fetal liver, new bile ducts in the portal tracts, either at the hilar level (corresponding to the large bile ducts) or peripheral level (corresponding to the small bile ducts), frequently expressed MUC1 apomucin at their luminal surface. Ductal plates also focally expressed MUC1 apomucin. By contrast, in the postnatal liver, the biliary epithelial cells of intrahepatic large bile ducts constantly expressed MUC3 apomucin, whereas those of small bile ducts did not. MUC2 and MUC5/6 apomucins were absent in the intrahepatic biliary elements of the fetal as well as postnatal livers. These data suggest that the biliary epithelial cells switch MUC1 apomucin expression before birth to that of MUC3 after birth. This characteristic transition may be similar to the changes in the hepatocellular expression of alpha-fetoprotein and albumin during the perinatal period.