移植GDNF基因修饰的神经干细胞对大鼠脑卒中的神经保护作用

目的:探讨移植胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因修饰的神经干细胞(NSCs)是否比单纯NSCs移植对脑卒中有更好的神经保护.方法:用GDNF重组质粒转染NSCs,构建过表达GDNF的NSCs(GDNF/NSCs).插线法制备大鼠脑缺血卒中模型,再灌注3d,脑立体定位分别移植NSCs、 GDNF/NSCs以及生理盐水到同侧侧脑室,实验分为GDNF/NSCs组、NSCs组和对照组.再灌注第1、 2、 3、 5和7周处死大鼠,用改良的神经功能缺失评分和H-E染色分别评估大鼠神经功能和脑梗死体积;免疫组织化学显色观察移植的NSCs数量与分布和突触蛋白Syn、 PSD-95在脑组织的表达.结果:再灌注2、 3周,GDNF/NSCs组较NSCs组神经功能恢复更好.在各时间点GDNF/NSCs和NSCs组大鼠脑缺血体积较对照组显著减小;GDNF/NSCs组的NSCs细胞数量较NSCs组显著增多.再灌注2和3周,GDNF/NSCs组Syn免疫阳性产物比NSCs组显著增加;各时间点GDNF/NSCs组的PSD-95免疫阳性产物比NSCs组显著增加.结论:GDNF基因修饰的NSCs比NSCs对大鼠脑卒中有更好的神经保护作用.     

小鼠神经干细胞免疫原性的研究

目的:探讨小鼠神经干细胞(NSCs)免疫原性,以利于解决神经干细胞移植中的免疫排斥问题。方法:(1)首先将30只C57BL/6近交系小鼠随机分成两组,以BALB/c近交系小鼠的NSCs及肝细胞(作为体细胞对照组)分别进行腹腔主动免疫,然后将NSCs及肝细胞分别与各自免疫后小鼠的T淋巴细胞进行单向混合淋巴细胞培养,通过液闪计数仪检测各自T淋巴细胞增殖程度,从而比较两者免疫原性的强弱。(2)利用异硫氰酸荧光素标记抗体(FITC)及Phycoery-thrin(PE)抗体分别标记BALB/c小鼠NSCs主要组织相容性抗原复合物Ⅰ、Ⅱ(MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ),然后通过流式细胞术(FCM)分别检测BALB/c小鼠NSCs及其肝细胞的MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ阳性细胞比例,从而推断小鼠NSCs的免疫原性。结果:(1)NSC组液闪计数仪检测所得cpm值为16592.8±2865.3,肝细胞组为27815.0±2416.3,NSC组明显低于肝细胞组,差别有统计学意义(P0.01)。(2)小鼠NSCs实验组中,约(87.55±3.65)%的增殖期神经干细胞没有检测到MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子表达;而作为对照组的小鼠肝细胞组中,仅有约(27.45±1.86)%的肝细胞未表达MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子。且NSC组MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ阴性细胞比例明显高于肝细胞组,差别有统计学意义(P0.01)。结论:小鼠神经干细胞具有较弱的免疫原性,且其免疫原性明显低于同一个体的肝细胞。     

星形胶质细胞条件培养液促进新生大鼠海马神经干细胞分化

目的探讨星形胶质细胞条件培养液(ACM)对神经干细胞(NSCs)体外分化的影响。方法行新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞的纯化培养后收集ACM,将新生大鼠海马NSCs单克隆培养后行nestin免疫细胞荧光染色,诱导分化5d后行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(GALC)免疫细胞荧光染色;将单克隆培养的NSCs分为对照组和实验组,对照组为单纯NSCs培养液,实验组根据NSCs培养液与ACM比的不同分3组:A组(2:1),B组(1:1),C组(1:2)。各组培养1周,采用NSE免疫细胞荧光检测方法标记神经元并计数和统计学分析。结果纯化的星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白抗体标记阳性率为96.5%;单克隆培养的海马NSCs呈nestin阳性,诱导后呈NSE、GFAP和GALC阳性表达。ACM培养的海马NSCs各组分化为神经元的比例明显高于对照组(<0.01),其中A组的比例最高。结论ACM可以促进新生大鼠海马NSCs向神经元分化。     

特异性shRNA对小鼠海马神经干细胞中Olig2基因表达的影响

目的:构建RNA干扰(RNAi)少突胶质细胞转录因子2(Olig2)基因的小鼠海马神经干细胞(NSCs)体系,用于离体水平研究Olig2对精神分裂症模型海马神经发生的调控作用。方法:海马NSCs原代培养及鉴定;通过荧光显微镜分别观察24、48、72 h后NSCs感染情况,确定慢病毒感染的最佳时间;通过Western Blot筛选有效干扰Olig2的shRNA序列;在NSCs体系中加入浓度为200μmol/L的MK-801 24 h后,加入有效干扰Olig2的shRNA,通过Western Blot检测慢病毒感染后的Olig2蛋白表达。结果:慢病毒感染72 h后,海马神经干细胞球荧光表达最强,可达90%; Western Blot结果显示:与对照组比较,Olig2 shRNA3干扰组Olig2的蛋白表达明显降低(P 0. 05);干扰组可明显降低MK-801处理后的NSCs中Olig2蛋白表达(P 0. 05)。结论:成功构建RNA干扰Olig2基因的海马NSCs体系,为进一步研究Olig2对精神分裂症后海马神经发生的调控机制奠定了基础。     

APP5肽对体外培养的大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响

目的 研究APP5肽对体外培养的大鼠胚胎海马神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响. 方法 1. 原代培养SD大鼠胚胎脑海马NSCs;2. 利用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)和神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞的特异性标记物微管相关蛋白2(MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(GalC)对培养的NSCs进行鉴定;3. 将培养的NSCs分为对照组、血清组、APP5肽反序列组和APP5肽组, 观察各组细胞形态的变化;4. 将培养的NSCs分为对照组、APP5肽反序列组和APP5肽组,利用细胞计数、干细胞克隆形成率、干细胞克隆形成大小以及四甲基偶氮唑盐(MTT)代谢率测定的方法 ,分析APP5肽对海马NSCs增殖的影响. 结果 1.海马神经干细胞呈神经球聚集生长,BrdU染色阳性;加入血清后神经球周围有细胞呈放射状向四周生长,并带有突起.染色呈MAP2、GFAP或GalC阳性;2. 海马NSCs加入APP5肽及其反序列后细胞形态与对照组相比没有明显改变;3.与对照组相比,加APP5肽后海马NSCs数量明显增加,克隆形成率和克隆形成的直径均有明显的增加, 并有统计学差异;4.与对照组相比,加入5肽后海马NSCs的MTT代谢率明显增加,有统计学差异,反序列组没有明显改变. 结论 APP5肽能促进海马NSCs增殖,但并不促进其分化.     

环孢菌素A结合神经干细胞移植对6-OHDA大鼠PD模型的作用

目的:观察环孢菌素A(cyclosporine A,CsA)结合神经干细胞(neural stem cells,NSCs)移植对于6-OHDA大鼠PD模型的作用。方法:SD大鼠随机分为四组:(1)正常组;(2)模型组;(3)NSCs组;(4)NSCs+CsA组。APO诱导旋转测试、悬挂实验、自发实验观察行为学改变,高效液相色谱(HPLC)检测纹状体多巴胺(dopamine,DA)含量。移植术后1、2、4周,ELISA检测纹状体TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-4的含量,免疫组化观察移植部位细胞的变化。结果:与模型组相比,移植组大鼠的旋转次数减少(P0.05),悬挂评分提高(P0.05),自发总活动度增加(P0.05),纹状体DA含量升高(P0.05),且NSCs+CsA组优于NSCs组(P0.05)。移植组的TNF-α、IL-1β三个时间点均低于模型组,且NSCs+CsA组抑制TNF-α、IL-1β的作用强于NSCs组(P0.05);移植组的IL-4、IFN-γ三个时间点均高于模型组(P0.05),但NSCs+CsA组的IFN-γ低于NSCs组(P0.05)。细胞的存活增殖迁移状态在2周时较好,4周时较差。与NSCs组相比,NSCs+CsA组的迁移细胞形态瘦长,4周时EGFP活细胞较多(P0.05)。GFAP+细胞数:NSCs+CsA组NSCs组;小胶质细胞数:模型组NSCs组NSCs+CsA组。结论:NSCs移植可改善PD大鼠行为障碍,增加纹状体DA含量,有利于营造良好的脑内微环境,加用CsA可提高其疗效。     

补阳还五汤联合神经干细胞移植促进脊髓损伤髓鞘再生

目的:探讨补阳还五汤(BYHWD)灌胃联合神经干细胞(NSCs)移植对脊髓损伤(SCI)后髓鞘再生的影响.方法:将48只成年雌性SD大鼠随机分为脊髓损伤(SCI)组、BYHWD灌胃组、NSCs移植组、NSCs移植联合BYHWD灌胃(BYHWD+ NSCs)组.SCI组不做治疗;NSCs组于脊髓横断后局部移植NSCs; BYHWD+ NSCs组移植NSCs,并每天BYHWD灌胃;各组在损伤后14、28 d后分别留取损伤脊髓标本,用免疫荧光双标法检测髓磷脂碱性蛋白(MBP)表达情况,透射电镜观察脊髓白质内髓鞘超微结构变化.结果:BYHWD+ NSCs组MBP阳性表达最多,较其他3组差异有统计学意义.电镜下BYHWD+NSCs组髓鞘结构较为规整,轴突微丝、微管排列有序,线粒体结构完整,可见薄髓的再生髓鞘.结论:SCI后BYHWD灌胃联合NSCs移植能够促进损伤脊髓MBP的表达及脱髓的轴突再髓鞘化.     

神经干细胞联合氯化锂对急性脊髓损伤修复的试验研究

目的:观察神经干细胞(neural stem cells,NSCs)移植联合应用氯化锂(lithium chloride,LiCl)对于大鼠急性脊髓损伤修复效果,并探讨二者相互作用.方法:利用MASCIS impactor(多中心急性脊髓损伤打击器)制作大鼠脊髓打击伤模型,随机分为NSCs组、NSCs+LiCl组、LiCl组及空白对照组,分期进行BBB后肢运动功能评分及组织学检查,评价及比较各组修复效果.结果:NSCs组与NSCs+LiCl组BBB评分较LiCl组与对照组在2周后各时段差别有意义(P<0.01);NSCs+LiCl组BBB评分在4周后明显高于NSCs组(P<0.01);组织学检查表明NSCs组与NSCs+LiCl组组织学改变与LiCl组与对照组有显著差别,但是NSCs+LiCl组相对于NSCs组可以更明显的促进神经元再生.结论:NSCs联合LiCl具有良好的脊髓损伤修复作用,二者协同作用明显.     

5-氮杂胞苷通过p53/Gadd45α信号途径影响小鼠神经干细胞的增殖

目的:通过研究DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷(5-Azacytidine,5-Aza)对小鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的影响,进一步阐明DNA甲基化模式的变化对神经发生的影响及机制。方法:采用无血清悬浮培养方法分离培养新生小鼠脑NSCs,通过MTT法检测5-Aza对NSCs增殖的影响;应用流式细胞仪检测5-Aza对NSCs细胞周期和凋亡的影响;并用RT-PCR、Western Blot法检测给予5-Aza对NSCs细胞p53和Gadd45αmRNA水平和蛋白表达的影响。结果:MTT法测定结果显示:与对照组相比,5-Aza能够明显抑制NSCs的增殖;流式细胞仪测定结果显示,5-Aza组NSCs在G0/G1期细胞数量较对照组明显减少(P0.01),而S期、G2/M期细胞数量则明显增多(P0.01),表明5-Aza可引起细胞周期在G2/M期停滞;且5-Aza组NSCs的凋亡率与对照组相比明显增加(P0.01)。RT-PCR结果显示:5-Aza组NSCs中p53和Gadd45αmRNA水平较对照组明显增高(P0.05);Western Blot结果也显示:与对照组相比,5-Aza组NSCs中p53和Gadd45α蛋白表达量明显增加(P0.05)。结论:5-Aza可能通过影响NSCs细胞周期和诱导凋亡抑制小鼠NSCs增殖;5-Aza阻滞NSCs细胞周期的作用机制可能与p53/Gadd45α信号途径相关。     

Wnt/β-Catenin对低氧诱导绿色荧光蛋白小鼠神经干细胞体外增殖的影响

目的:体外观察低氧对绿色荧光蛋白(GFP)小鼠神经干细胞(NSCs)增殖的影响,并探讨Wnt/β-catenin通路在此过程中的作用。方法:经低氧(3±2)%O_2和常氧205O_2培养GFP小鼠海马组织NSCs,通过NSCs克隆形成率检测、BrdU掺入法和四唑盐比色法(MTT)法检测细胞增殖情况;脂质体介导法将NSCs转染β-catenin,通过免疫细胞化学染色、Western印迹法检测β-catenin表达情况,MTT法检测转染β-catenin后低氧对NSCs增殖的影响。结果:低氧组细胞克隆球形成率、BrdU阳性细胞数量、NSCs增殖活性、NSCs内β-catenin表达均显著高于常氧组;转染β- catenin的NSCs经低氧培养后,NSCs增殖活性明显高于未转染组。结论:体外低氧培养能促进NSCs增殖和NSCs内β-catenin表达;增加NSCs中β-catenin表达能促进低氧培养下NSCs的增殖。表明Wnt/β-catenin通路具有促进低氧诱导NSCs增殖的作用。     

P>胰岛素样生长因子-1抑制β淀粉样蛋白25～35诱导的神经干细胞凋亡/P>

目的 观察β-淀粉样蛋白(Aβ)对神经干细胞(NSCs)增殖和凋亡的影响,探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对Aβ介导的NSCs毒性作用的保护机制.方法 从E14 SD大鼠大脑中分离神经干细胞,分别用Aβ、IGF-1和Aβ加IGF-1处理,锥虫蓝(trypan blue)染色确定细胞死亡数量和细胞死亡率,BrdU标记并分析细胞增殖能力,免疫细胞化学法鉴定神经干细胞和新生细胞,TUNEL技术检测凋亡细胞.结果 IGF-1处理时细胞死亡率低下,有大量BrdU阳性细胞生成,但无TUNEL阳性细胞.Aβ处理组细胞死亡率在6～48 h快速上升,并形成大量TUNEL阳性细胞.而IGF-1加Aβ处理时,细胞死亡率较Aβ组显著下降.TUNEL阳性细胞显著减少.结论 Aβ促进神经干细胞死亡和凋亡;而IGF-1促进神经干细胞增殖并抑制由Aβ诱导的神经干细胞凋亡.     

肝细胞生长因子促大鼠神经干细胞增殖的作用

目的:研究肝细胞生长因子(HGF)对大鼠神经干细胞(NSCs)增殖的作用以及PI3K/Akt信号途径的影响.方法:分离培养大鼠NSCs,通过向神经培养基中添加HGF(10,30,60 ng/ml),计数干细胞克隆形成率、四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法以及5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU)标记检测NSCs的增殖,Annexin V/FITC免疫荧光显色测定NSCs的凋亡;免疫印迹法检测细胞磷酸化Akt蛋白表达的变化.结果:与对照组相比,HGF各剂量组NSCs克隆率明显增加,生长速度增快,BrdU 阳性细胞增加,NSCs凋亡率显著减少.此外,HGF可上调磷酸化Akt蛋白的表达,HGF的效应可被PI3K/Akt通路抑制剂LY294002阻断.结论:HGF可促进大鼠NSCs增殖,抑制其凋亡,其作用机制可能与激活NSCs的PI3K/Akt信号转导通路有关.     

Olig2过表达对神经干细胞向少突胶质细胞分化的影响

目的:构建大鼠olig2真核表达载体,观察其过表达对大鼠神经干细胞(NSCs)向少突胶质细胞分化的影响.方法:采用 RT-PCR,以新生大鼠脊髓RNA为模板,扩增olig2基因,定向克隆到pEGFP-N3载体中.用电穿孔方法转染pEGFP-N3-olig2表达载体至NSCs中.用RT-PCR鉴定olig2的表达,用免疫荧光显色鉴定NSCs向少突胶质细胞的分化情况.结果:成功构建了pEGFP-N3-olig2真核表达载体;olig2在重组质粒转染的NSCs中能够高效表达;重组质粒转染的NSCs在体外诱导分化后,能够较空质粒转染的NSCs产生更多的受体相互作用蛋白(RIP)阳性细胞.结论:olig2过表达能够促进大鼠NSCs向少突胶质细胞方向分化.     

Nogo-p4对神经干细胞分化为双极形星形胶质细胞突起长度的影响

目的 观察Nogo-p4对大鼠脊髓来源神经干细胞（NSCs）分化形成双极形星形胶质细胞突起长度的影响。方法 取4只出生24h内的Wistar大鼠,悬浮培养法培养大鼠脊髓来源的NSCs,形成神经球后,以免疫荧光法鉴定NSCs。把NSCs分为A、B两组,A组加入血清,B组加入血清和Nogo-p4,分化7d后,胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体标记星形     

神经调节蛋白-1与碱性成纤维细胞生长因子对大鼠神经干细胞增殖和分化的影响

目的:探讨神经调节蛋白-1(NRG-1)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响.方法:从新生大鼠大脑组织分离NSCs,进行体外培养,分别用bFGF、 NRG-1和NRG-1加bFGF处理,观察各组神经球的形成情况;应用免疫细胞化学法鉴定NSCs及检测分化后神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、 2,3-环核苷酸磷酸二酯酶(CNP)的表达.结果:NRG+bFGF组和bFGF组形成的神经球数量和直径的差别不明显,但都明显多于和大于NRG组和对照组.免疫细胞化学显色结果显示,NRG+bFGF组、bFGF组中的神经球分化出的NSE、 GFAP、 CNP阳性细胞数量明显多于NRG组和对照组,尤其是NRG+bFGF组分化的NSE、CNP阳性细胞的突起较bFGF组更长和增多.结论:NRG-1与bFGF合用能促进NSCs的增殖和分化,促进分化的神经元、少突胶质细胞突起的生长.     

人参皂苷Rgl诱导大鼠海马神经干细胞分化的实验研究

为探讨人参皂苷Rgl诱导新生大鼠海马神经干细胞(NSCs)分化的作用,本实验采用无血清和单克隆培养方法进行细胞培养,应用免疫荧光染色法观察NSCs的形态及其分化而来的神经元、胶质细胞的形态,并经图像扫描分析仪分析海马NSCs分化的细胞数量.实验分4组:5%胎牛血清组、5%胎牛血清+30 ms/kg人参皂苷Rgl组、5%胎牛血清+15 ms/kg人参皂苷Rgl组和5%胎牛血清+10mg/kg人参皂苷Rgl组.结果显示:海马NSCs在无血清培养下,可形成巢蛋白(nestin)和5-溴脱氧尿苷(BrdU)阳性细胞球;在诱导分化后,免疫荧光染色可见B-Ⅲ型微管蛋白(Tuj-1)与波形蛋白(vimentin)阳性细胞;图像扫描分析结果显示15 mg/kg人参皂苷Rgl干预组海马NSCs向神经元的分化比例最高.此结果提示在一定浓度人参皂苷Rgl的作用下,海马NSCs向神经元分化的数量增多,为进一步研究人参皂苷Rgl对NSCs分化的影响提供了实验依据.     

不同低氧浓度对神经干细胞增殖与凋亡的影响

目的 探讨不同的低氧浓度对离体培养胎鼠脑皮质神经干细胞( NSCs)的增殖与凋亡的影响.方法 体外不同低氧条件下(3％ O2、5％ O2、10％ O2)培养胎鼠皮质来源的细胞,实验组分别分为低氧1、3、5d组,常氧组为对照.免疫细胞化学染色鉴定NSCs,BrdU掺入法检测实验组NSCs的增殖:流式细胞仪检测实验组NSC...     

督脉电针联合神经干细胞移植治疗脊髓全横断损伤后aggrecan的表达变化

目的:观察督脉电针联合神经干细胞( NSCs)移植治疗脊髓损伤对硫酸软骨素蛋白多糖aggrecan的表达影响.方法:成年SD大鼠随机分为脊髓损伤对照组、督脉电针组、NSCs移植组以及督脉电针联合NSCs移植组.建立成年大鼠第9～10胸椎段脊髓全横断模型.其中电针组和电针联合NSCs组于术后当天进行电针治疗.用免疫组织化...     

大鼠胚脑皮质和中脑神经干细胞移植治疗PD模型鼠的比较研究

为比较大鼠胚胎大脑皮质和中脑神经干细胞(NSCs)移植入Parkinson病(PD)模型鼠后动物行为的改善和植入细胞分化为酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元的情况,本研究将大鼠胚胎大脑皮质和中脑NSCs在体外分离、扩增、BrdU标记后,添加或不加白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-11(IL-11)、白血病抑制因子(LIF)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)等因子,分别移植入PD模型鼠病侧纹状体中。术后每隔2周进行动物旋转行为的检测,第12周时用免疫荧光双重标记方法检测BrdU和TH双标神经元。结果显示:中脑NSCs+因子移植组,动物的旋转行为得到明显改善;单纯中脑NSCs移植组次之;而单纯皮质NSCs移植组、皮质NSCs+因子移植组及生理盐水对照组动物的行为无明显改善。免疫荧光双重染色结果显示,中脑NSCs+因子组和单纯中脑NSCs组BrdU和TH双标神经元的数量明显多于其它组,而中脑NSCs+因子组又多于单纯中脑NSCs组。以上结果提示,大鼠胚胎中脑NSCs移植治疗PD模型的疗效明显优于胚胎皮质NSCs,IL-1α、IL-11、LIF和GDNF等因子能促进移植的中脑NSCs分化为TH阳性神经元。     

N-cadherin对大鼠脊髓损伤后移植神经干细胞存活、增殖与迁移的影响

目的探讨神经钙黏蛋白(N-cadherin)对大鼠脊髓损伤(SCI)后移植神经干细胞(NSCs)存活、增殖与迁移的影响。方法 60只SD大鼠随机分为对照组、模型组、移植1组和移植2组。横断T12复制SCI模型。移植1组行原代培养NSCs移植;以lentivirus病毒为载体将N-cadherin转染至原代培养NSCs再植入移植2组。BBB评分评定大鼠神经功能。术后5、10和15 d免疫荧光检测NSCs存活、增殖和迁移。结果模型组BBB评分显著低于对照组(P<0.05);各移植NSCs组BBB评分均高于模型组(P<0.05),但以移植2组评分最高(P<0.05);移植2组各时间点巢蛋白(Nestin)阳性细胞数量均显著多于移植1组(P<0.05),以15 d的数量最多(P<0.05);移植2组各时间点Nestin阳性细胞迁移距离显著长于移植1组。结论 N-cadherin可以促进NSCs的存活、增殖与迁移,以修复SCI大鼠的神经功能。