microRNA-424-5p对人胃癌细胞SGC-7901自噬的影响及机制

目的研究microRNA-424-5p(miR-424-5p)对人胃癌细胞SGC-7901自噬的影响及可能机制。方法培养人正常胃黏膜上皮细胞GES和人胃癌细胞SGC-7901,应用实时定量PCR方法检测miR-424-5p的表达水平;应用Lipofectamine LTX试剂将化学合成的miR-424-5p agomir和miR-424-5p antagomir转染人胃癌细胞SGC-7901,验证转染效率后应用MTT方法检测细胞活力;应用免疫荧光法检测自噬标记物微管相关蛋白轻链-3(LC3)和自噬降解底物p62/SQSTM1在SGC-7901细胞的分布;应用Western blot方法检测LC3-Ⅱ、p62/SQSTM1和自噬相关蛋白Beclin1的蛋白表达水平。结果 miR-424-5p在人胃癌细胞SGC-7901中呈低表达,miR-424-5p过表达显著抑制人胃癌细胞SGC-7901的细胞活力,miR-424-5p表达沉默的作用效果与之相反。miR-424-5p过表达后自噬标记物LC3在SGC-7901细胞的胞浆内呈点状分布,荧光表达显著增强,并且LC3-II的蛋白表达水平显著上调,同时伴有自噬降解底物p62/SQSTM1在细胞浆内荧光表达显著减弱,蛋白表达下调,此外,自噬相关蛋白Beclin1的蛋白表达水平显著上调;miR-424-5p表达沉默的作用效果与之相反。结论 miR-424-5p过表达明显抑制人胃癌细胞SGC-7901的细胞活力,诱导细胞发生自噬,其机制之一可能与自噬相关蛋白Beclin1上调有关。     

离体培养海马神经干细胞中自噬现象的观察

目的:观察离体培养海马神经干细胞中自噬现象。方法:分离新生1 d大鼠海马组织,培养、扩增和传代,鉴定后取培养7 d的细胞,用RT-PCR法检测自噬特异性蛋白LC3和Bclin1的mRNA表达,Western Blot检测LC3和Bclin1的蛋白表达,透射电子显微镜观察神经干细胞中的自噬体的超微结构。结果:分离培养的神经干细胞呈Nestin免疫荧光阳性,且能分化为β-Ⅲtubulin~+的神经细胞和GFAP~+的胶质细胞;RT-PCR和Western Blot分别检测出神经干细胞有LC3、Bclin1的mRNA和蛋白表达;电镜下观察到神经干细胞胞质内有自噬体和自噬溶酶体。结论:正常离体培养的大鼠海马神经干细胞存在自噬现象,提示自噬可能对神经干细胞正常生理功能的维持有重要作用。     

长链非编码RNA生长停滞特异性转录本5(lncGAS5)促进同型半胱氨酸致肝细胞自噬作用

目的探讨长链非编码RNA生长停滞特异性转录本5(lncGAS5)在同型半胱氨酸(Hcy)致肝细胞自噬中的作用。方法体外培养HL7702人肝细胞,分为对照组和Hcy组。Western blot法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)和P62的表达水平,转染携带双荧光蛋白和LC3(mRFP-GFP-LC3)基因的腺病毒,激光扫描共聚焦显微镜技术观察细胞内自噬流水平变化,实时荧光定量PCR检测lncGAS5的表达水平。转染lncGAS5小干涉RNA(si-lncGAS5)及阴性对照小干涉RNA(si-NC),并用Hcy处理,再次检测LC3B和P62及自噬体的变化。结果与对照组比较,Hcy组LC3BⅡ/LC3BⅠ比值增加,P62蛋白表达降低,细胞内自噬体及自噬溶酶体数量增加,lncGAS5表达升高。敲低lncGAS5后,LC3BⅡ/LC3BⅠ比值减小,P62蛋白表达升高,细胞内自噬体及自噬溶酶体数量减少。结论 lncGAS5促进Hcy致肝细胞自噬。     

长链非编码RNA HULC对肺癌细胞增殖及自噬的调控

目的探讨长链非编码RNA HULC对非小细胞肺癌增殖及其与自噬的关系。方法采用实时定量PCR检测48例肺癌组织以及相应正常肺组织中HULC的表达水平,并检测HULC在肺癌细胞系及正常肺细胞系中的表达情况。通过pcDNA3.1-HULC转染肺癌细胞系A549、95D过表达HULC;采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖改变情况;Western blot、免疫荧光检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、LC3斑点数目变化情况以及自噬相关蛋白Atg7的表达变化。结果HULC在肺癌组织中的表达高于正常肺组织,差异有统计学意义(P<0.05);过表达HULC能促进肺癌细胞增殖,且过表达HULC促进肺癌细胞中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化和Atg7的表达增加(P<0.05);免疫荧光可见过表达HULC后LC3荧光斑点明显增多。结论肺癌组织中HULC的表达高于正常肺组织,HULC促进肺癌细胞增殖与提高肺癌细胞自噬水平,且与自噬相关蛋白ATG7相关。     

Rab5 GTPase对膀胱癌细胞自噬及增殖的调控

目的探讨Rab5 GTPase对膀胱癌细胞自噬及增殖的影响。方法采用实时定量PCR检测60例膀胱癌组织以及相应正常膀胱组织中Rab5 mRNA的表达水平,并检测Rab5 mRNA在膀胱癌细胞系及正常膀胱细胞系中的表达情况。通过pcDNA3.1-Rab5转染膀胱癌细胞系BIU-87、RT4过表达Rab5;免疫荧光、Western blot检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、LC3斑点数目变化情况以及自噬相关蛋白Vps34的表达变化;采用CCK-8检测膀胱癌细胞的增殖改变情况。结果Rab5 mRNA在膀胱癌组织中的表达高于正常膀胱组织,Rab5 mRNA在膀胱癌细胞中的表达高于正常膀胱细胞系,差异有统计学意义(P<0.05);免疫荧光显示过表达Rab5后LC3荧光斑点明显增多,且过表达Rab5促进膀胱癌细胞中Vps34的表达增加及LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化;过表达Rab5能促进膀胱癌细胞增殖(P<0.05)。结论膀胱癌组织中Rab5 mRNA的表达高于正常膀胱组织,Rab5提高膀胱癌细胞自噬水平并促进膀胱癌细胞增殖,且与自噬相关蛋白Vps34相关。     

饥饿诱导的细胞自噬可以引起UVRAG的降解

目的：观察细胞发生自噬后UVRAG水平的改变及其与自噬发生的关系。方法用Western印迹检测饥饿诱导细胞自噬后UVRAG分子的水平改变,然后分别应用自噬起始阶段与效应阶段的抑制剂抑制自噬,检测自噬不同阶段UVRAG分子的水平变化;结果饥饿促进了细胞LC3的型别转换和P62的降解,诱导细胞发生自噬;3-MA抑制细胞自噬及E64d和pepstatin抑制自噬溶酶体活性后,UVRAG的降解减少;结论饥饿诱导细胞自噬在形成自噬溶酶体后引起了UVRAG的降解。     

lncRNA HOTAIR在胃癌中的表达及对胃癌细胞增殖及自噬的影响

目的研究lncRNA HOTAIR在胃癌中的表达及其对胃癌细胞增殖和自噬的影响,探讨lncRNA HOTAIR调控胃癌细胞自噬的机制。方法收集2015年1月—2017年12月于中国医科大学附属肿瘤医院确诊为胃癌的60例癌组织及其配对癌旁组织;实时荧光定量PCR (RT-PCR)检测HOTAIR表达水平,CCK-8实验检测siHOTAIR及si-ATG3对细胞增殖影响,蛋白免疫印迹实验检测HOTAIR对细胞自噬水平及ATG3表达水平影响,免疫荧光实验检测HOTAIR对胃癌细胞自噬的影响。结果 HOTAIR在胃癌组织及癌细胞株MGC-803、BGC-823、SGC-7901中表达水平显著高于癌旁正常组织及人胃黏膜细胞株GES-1。通过转染si-HOTAIR,构建胃癌HOTAIR干扰细胞株;与空载对照组相比,HOTAIR干扰组胃癌细胞增殖水平降低,胃癌细胞自噬标志蛋白LC3表达水平降低,LC3-Ⅱ/Ⅰ比例降低,P62表达增高,自噬相关蛋白ATG3表达亦降低。结论胃癌组织中HOTAIR表达上调,抑制HOTAIR促进了胃癌细胞增殖能力;且HOTAIR能够通过ATG3促进自噬水平。     

TLR4介导可溶性尿酸诱导的肾小管上皮细胞自噬流异常

目的:探寻Toll样受体4(TLR4)与可溶性尿酸诱导肾小管上皮细胞HK-2自噬的关系。方法:用可溶性尿酸或/和氯喹(CQ)刺激HK-2细胞,采用Western blot检测LC3-Ⅱ和P62的表达水平,通过透射电子显微镜观察细胞内自噬小体及自噬溶酶体形成。在可溶性尿酸刺激HK-2细胞的基础上加上TLR4抑制剂TAK242后采用RT-qPCR检测TLR4的mRNA表达水平,Western blot检测TLR4、LC3-Ⅱ和P62的蛋白水平,并通过自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)标记观察细胞内自噬流的变化。结果:可溶性尿酸可诱导HK-2细胞LC3-Ⅱ和P62的表达上调,其与CQ共同处理后LC3-Ⅱ及P62的表达进一步增加,透射电子显微镜下观察到自噬小体增多,自噬溶酶体少见,提示自噬流受阻。Western blot结果显示,与正常对照组相比,可溶性尿酸组TLR4、LC3-Ⅱ和P62的蛋白水平增高,而TAK242则抑制可溶性尿酸诱导HK-2细胞的TLR4、LC3-Ⅱ和P62的表达水平。自噬双标腺病毒实验结果显示,可溶性尿酸组与对照组相比,自噬小体显著增多,且自噬溶酶体较少;而与可溶性尿酸组相比,TAK242+可溶性尿酸组自噬小体减少,自噬溶酶体相对增多,表明自噬小体与溶酶体融合现象增多,形成自噬溶酶体的进程更顺畅。结论:可溶性尿酸导致肾小管上皮细胞自噬流受阻;同时,可溶性尿酸可通过TLR4介导肾小管上皮细胞自噬流异常。     

GSK3β抑制非小细胞肺癌细胞自噬增强放疗敏感性

目的探讨糖原合成酶激酶-3β(GSK3β)在非小细胞肺癌中对自噬的调节及调节自噬对放疗敏感性的影响。方法通过Western blot检测正常支气管上皮细胞HBE和肺癌细胞A549,H460,H292,H1299,Calu1和SK-MES-1中GSK3β的表达情况。转染或抑制GSK3β的表达并经X射线照射后,通过Western blot检测磷酸腺苷蛋白激酶(AMPK),自噬标记物微管相关蛋白轻链-3(LC3)和自噬降解底物p62的蛋白表达水平。应用集落形成实验检测转染或抑制GSK3β的表达并经X射线照射后的细胞增殖能力,促进或抑制自噬并经X射线照射后的细胞增殖能力。结果在H460细胞中分别转染野生型GSK3β-WT,激酶激活型GSK3β-S9A,激酶失活型GSK3β-K85R并经X射线照射,下调AMPK和LC3表达水平,上调P62表达水平,抑制肺癌细胞的增殖能力,其中转染激活型GSK3β-S9A的作用最显著。在A549细胞中抑制GSK3β并X射线照射,上调AMPK和LC3表达水平,促进肺癌细胞的增殖能力。在H460细胞中施加自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)或自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin)并经X射线照射,3-MA抑制细胞自噬水平,抑制细胞增殖能力,细胞存活能力下降更显著。结论GSK3β抑制细胞自噬,抑制细胞自噬水平可以增强非小细胞肺癌的放射敏感性。     

p53和DNA损伤调节基因1在口腔癌组织中的表达及通过 Wnt/β-catenin信号途径对口腔癌细胞自噬和凋亡的影响*

目的：探讨p53 和DNA损伤调节基因1（PDRG1）在口腔癌组织中的表达及通过Wnt/β-catenin 信号途径对 口腔癌细胞自噬和凋亡的影响。方法：收集2017 年6 月至2019 年6 月在河南省第二人民医院60 例接受口腔癌切 除手术的患者的癌组织标本及配对的癌旁组织,qRT-PCR 和免疫印迹检测PDRG1 在口腔癌组织中的mRNA和蛋 白表达;同时体外培养正常人口腔角质形成细胞（NHOK）和口腔癌细胞系,qRT-PCR 和免疫印迹检测PDRG1 在口腔癌细胞系中的mRNA和蛋白表达;将口腔癌细胞系SCC-15 细胞分为shNC 组和shPDRG1 组,细胞集落形 成实验检测细胞增殖能力;免疫印迹检测细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达比例;透射电镜检测细胞中自噬体数量; 流式细胞术检测细胞凋亡率;免疫印迹检测Wnt/β-catenin 信号途径相关蛋白表达。结果：PDRG1 在口腔癌组织 和口腔癌细胞系中高表达;与shNC 组相比,shPDRG1 组SCC-15 细胞中PDRG1 mRNA 的表达显著下降, PDRG1 蛋白的表达水平明显下调。与shNC 组相比,shPDRG1 组SCC-15 细胞的集落数目明显减少,细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ 的比例减少;与shNC 组比较,shPDRG1 组细胞中自噬体数量减少,细胞的凋亡率明显提高,细胞中β-catenin、 c-Myc、cyclin D1 蛋白表达水平下调。结论：PDRG1 在口腔癌组织和口腔癌细胞系中高表达,沉默PDRG1 抑制 SCC-15 细胞增殖和自噬,增强SCC-15 细胞的凋亡率及抑制Wnt/β-catenin 信号途径。     

LncRNA CCAT1通过调控MYC蛋白的表达激活MAPK信号通路影响胃癌细胞的生物学行为

目的：探讨lncRNA CCAT1通过调控瘤细胞病毒癌基因（MYC）蛋白的表达激活MAPK信号通路影响胃癌细胞的生物学行为及机制。方法：qPCR检测lncRNA CCAT1在胃癌组织和不同胃癌细胞株中的表达情况;qPCR检测MYC在胃癌组织中的表达和lncRNA CCAT1的关系,双荧光素酶报告基因检测lncRNA CCAT1和MYC之间的相互作用;流式细胞术实验检测lncRNA CCAT1对胃癌细胞的凋亡行为和细胞周期的影响;划痕愈合试验和Transwell侵袭实验检测lncRNA CCAT1对胃癌细胞的迁移和侵袭行为的变化情况;Western blot实验检测lncRNA CCAT1对MAPK通路相关蛋白表达情况的影响。结果：与正常胃组织相比,胃癌组织中lncRNA CCAT1的表达水平相对上调,与其他细胞株相比,HCG-27细胞中lncRNA CCAT1表达最高;MYC表达与相对lncRNA CCAT1的表达呈负相关关系;双荧光素酶实验证实lncRNA CCAT1能与MYC的3′UTR特异性结合,可以调控MYC的表达与活性;抑制lncRNA CCAT1的表达可以诱导G0/G1期的细胞周期停滞并促进细胞凋亡;抑制lncRNA CCAT1的表达后可以抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力;抑制lncRNA CCAT1后下游MAPK通路蛋白表达水平相应下调。结论：LncRNA CCAT1通过调控MYC蛋白表达激活MAPK信号通路影响胃癌细胞的生物学行为。     

Galectin-9调控SHH信号通路影响结直肠癌HT29细胞凋亡

目的:探讨半乳糖凝集素9(galectin-9)对结直肠癌细胞凋亡的影响及机制。方法:在结直肠癌细胞系HT29中分别转染galectin-9过表达载体pcDNA3.1-Galectin-9和对照载体pcDNA3.1,用real-time PCR和Western blot检测过表达效果。Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡变化,Western blot测定细胞中活化的caspase-3水平,以及SHH信号通路蛋白Smo、Gli1和SHH的表达变化。用SHH信号通路特异性抑制剂cyclopamine处理上调galectin-9表达的结直肠癌细胞,用上述方法检测细胞凋亡、细胞中活化的caspase-3水平,以及SHH信号通路蛋白Smo、Gli1和SHH的表达变化。结果:pcDNA3.1-Galectin-9可显著上调结直肠癌HT29细胞中galectin-9的mRNA和蛋白水平。上调galectin-9表达后的结直肠癌HT29细胞凋亡率升高,细胞中活化的caspase-3蛋白水平升高,同时细胞中SHH信号通路蛋白Smo、Gli1和SHH的表达水平降低(P0.05)。Cyclopamine处理可以进一步诱导上调galectin-9表达的结直肠癌HT29细胞凋亡,促进细胞中活化的caspase-3蛋白水平上调,降低细胞中SHH信号通路的激活水平(P0.05)。结论:Galectin-9通过抑制SHH信号通路诱导结直肠癌HT29细胞凋亡。     

MMP-2、MMP-9与Ⅳ型胶原在大肠癌中的表达及其相关性研究

目的: 研究大肠癌中MMP-2、 MMP-9与IV型胶原的表达及其相关性.方法: 对30例Dukes'B、 C期大肠癌患者的癌组织和正常组织进行IV型胶原、 MMP-2、 MMP-9的免疫组织化学检测, 并进行相关性分析.结果: IV型胶原在大肠癌组织中的表达明显降低; MMP-2、 MMP-9在大部分正常大肠组织中均未见表达, 仅少数见到有阳性表达, 而在癌组织中表达明显增强.IV型胶原评分与MMP-9表达之间呈负相关.结论: 大肠癌组织中IV型胶原的表达明显降低, MMP-9对大肠癌中IV型胶原的降解起着重要作用.     

miR-128 调控AK2 蛋白的表达通过STAT3 信号通路对宫颈癌细胞生物学行为的影响

目的:探讨miR-128 调控AK2 蛋白的表达通过STAT3 信号通路对宫颈癌细胞生物学行为的影响其机制。方法:qPCR 和Western blot 检测宫颈癌组织和细胞中AK2 和miR-128 的表达情况;双荧光素酶实验检测miR-128 和AK2 之间的相互作用;CCK-8 增殖试验检测miR-128 对宫颈癌细胞增值能力的影响;裸鼠体内成瘤试验检测miR-128 对宫颈癌细胞成瘤能力的影响;Western blot 检测miR-128 对STAT3 信号通路蛋白水平的影响;Western blot 检测过表达AK2 蛋白逆转miR-128对p-STAT3 的抑制水平。结果:在宫颈癌组织中AK2 表达水平相比正常宫颈组织中高,miR-128 在宫颈癌C33a 细胞株中表达水平较低;双荧光素酶试验证实miR-128 可以直接靶向调控AK2 的表达;CCK-8 增殖实验表明miR-128 可以抑制宫颈癌细胞株的增殖能力;体内成瘤实验表明miR-128 的增高可以抑制宫颈癌细胞成瘤能力[体积(3.05±0.35)cm3 vs (0.86±0.11)cm3 ,P =0.031;(3.26±0.39)g vs (0.89±0.15)g,P = 0.016];Western blot 实验表明miR-128 可以抑制p-STAT 的激活[(42.12±6.28)% vs (91.25±9.29)%, P<0.05],而AK2 的过表达又可以逆转miR-128 对p-STAT 的抑制作用。结论:miR-128 靶向调控AK2 的表达进而通过STAT3 通路的激活调控宫颈癌细胞的生物学行为。     

过表达miR-10b促进肺癌细胞系A549增殖

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)患者肺癌及癌旁组织中miR-10b(miR-10b)表达水平及miR-10b是否通过调控锌指转录蛋白基因(KLF4)对肺癌细胞系A549恶性化的影响。方法 40例NSCLC患者病理切片,原位杂交检测肺癌及癌旁组织中miR-10b的表达量;对肺癌细胞系A549转染miR-10b mimics后,CCK-8法检测肺癌细胞增殖;real-time PCR及Western blot检测KLF4 mRNA及蛋白水平;软琼脂克隆形成实验检测过表达miR-10b对A549细胞的肿瘤恶性化程度的影响。结果肺癌细胞A549及肺癌组织中miR-10b的表达量分别高于正常肺上皮细胞16HBE及癌旁组织;过表达miR-10b模拟物的A549细胞中,KLF4蛋白水平显著下降(P0.05);过表达的miR-10b可显著增加A549细胞的增殖速度及在软琼脂内的成瘤性。结论 miR-10b在不同类型细胞及组织中具有分布差异性、可能是通过抑制KLF4的表达促进肺癌细胞增殖及恶性化。     

miR-107 靶向NID2 通过Notch 信号通路调控肺癌细胞的增殖侵袭

目的:miR-107 靶向NID2 调控Notch 信号通路影响肺癌的侵袭和增殖。方法:免疫组化检测NID2 在肺癌组织和正常肺组织中的表达;PCR 检测miR-107 在肺癌组织中的表达;双荧光素酶报告基因系统检测miR-107 对NID2 转录活性的影响;肿瘤细胞成球实验检测miR-107 的表达对肺癌细胞A549 的增殖能力的影响;Transwell 侵袭实验检测miR-107 的表达对肺癌A549 细胞的侵袭能力的影响;划痕试验检测miR-107 的表达对肺癌A549 细胞的迁移能力的影响;Western blot 检测过表达miR-107 后Notch 信号通路的蛋白表达水平。结果:和正常肺组织比较,NID2 在肺癌组织中表达较高;miR-107 在肺癌组织中表达明显降低;双荧光素酶报告基因系统检测结果显示,miR-107 可以直接调控NID2 的转录活性;过表达miR-107 后,肺癌细胞A549 的增殖、侵袭和迁移能力明显降低;过表达miR-107 后,Notch1、hes-1、presenilin1 蛋白表达下调。结论:miR-107靶向NID2 的表达,通过Notch 通路调控肺癌细胞的增殖和侵袭能力。     

PXMP4促进结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的探讨过氧化物酶体膜蛋白4(peroxisomal membrane protein 4, PXMP4)对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法采用生物信息学分析65例配对结直肠癌组织中PXMP4 mRNA的表达。应用免疫组化检测112例配对结直肠癌组织中PXMP4的表达,并进行临床病理相关分析;利用RT-PCR和Western blot法检测过表达/干扰结直肠癌细胞中PXMP4的表达;采用CCK-8、划痕愈合实验和Transwell实验检测结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。结果 65例结直肠癌组织中有64例PXMP4 mRNA的相对表达量高于正常肠黏膜组织,差异有统计学意义(P<0.01)。112例结直肠癌组织中PXMP4的阳性率为71.429%(80/112),高于正常肠黏膜组织(5.4%,6/112);按肿瘤分化程度和淋巴结转移分组,PXMP4的阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。与空载组和阴性对照组相比,过表达PXMP4能促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭(P<0.05),干扰PXMP4能抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭(P<0.05)。结论 PXMP4在结直肠癌组织中表达上调,其与肿瘤分化程度和淋巴结转移有关;PXMP4促进结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭。