基于幽门螺杆菌UreB优势抗原表位多抗原肽疫苗制备及其免疫保护作用

目的 构建串联式幽门螺杆菌UreB抗原优势表位UreB322和UreB527原核重组表达系统,制备UreB322和UreB527表位与多肽载体Poly-Asp-Lys的多抗原肽(MAP)疫苗并确定其免疫原性和免疫保护性.方法 采用连接引物PCR构建含肠激酶(EK)位点的串联式UreB322和UreB527表位基因及其原核表达系统.表达的目的重组融合蛋白8×[rEK-UreB322-EK-UreB527-EK]经EK水解后用Sephadex G-25柱分离rUreB322-EK和rUreB527-EK片段.采用碳二亚胺法将rUreB322-EK、rUreB527-EK与Poly-Asp-Lys载体分子交联,制备出多抗原肽疫苗MAP-rUreB322/B527.采用ELISA和Western blot分别检测各重组表位肽及MAP-rUreB322/527的抗原性和免疫反应性.采用幽门螺杆菌SS1株感染BALB/c小鼠模型检测MAP-rUreB322/527免疫保护效果.结果 获得了8次重复串联的UreB322和UreB527编码基因及其原核表达系统,目的融合蛋白8×[rEKUreB322-EK-rUreB527-EK]表达量可达细菌总蛋白的48％.肠激酶可将目的融合蛋白完全水解为rUreB322-EK和rUreB527-EK片段.rUreB322-EK和rUreB527-EK与Poly-Asp-Lys交联率高达92.5％.幽门螺杆菌全菌抗体及rUreB-IgG均能识别rUreB322-EK、rUreB527-EK和MAP-rUmB322/527并与之结合.MAP-rUreB322/527免疫小鼠血清抗体水平明显高于rUreB(P＜0.05).50或100μgMAP-rUreB322/527对幽门螺杆菌SS1株感染小鼠的保护率(83.3％和91.7％)明显高于等量rUreB(41.7％和50.0％)(P＜0.05).结论 本研究成功地构建了幽门螺杆菌UreB抗原优势表位UreB322和UreB527重复串联式编码基因及其原核表达系统,基于UreB优势抗原表位的多抗原肽疫苗MAPrUreB322/527能显著提高免疫保护效果.     

甲型副伤寒杆菌ompA基因分布及重组表达产物的免疫学鉴定

目的 构建甲型副伤寒杆菌ompA基因原核表达系统,确定其重组表达产物rOmpA免疫原性和保护作用,检测甲型副伤寒杆菌临床菌株ompA基因携带率.方法 采用PCR从甲型副伤寒杆菌临床株JH01中扩增ompA基因,T-A克隆后测序并构建ompA基因原核表达系统.采用SDS-PAGE和Bio-Rad凝胶图像分析系统检测rOmpA表达情况及其产量,采用免疫扩散法、微量肥达试验和Western blot鉴定其抗原性和免疫反应性.采用PCR检测98株甲型副伤寒杆菌临床菌株ompA基因携带率.采用小鼠感染模型,了解rOmpA对甲型副伤寒杆菌50001株感染的免疫保护作用.结果 与报道的相关序列比较,所克隆的ompA基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%.rOmpA表达量约为细菌总蛋白的65%.rOmpA能与其兔抗血清和甲型副伤寒杆菌全菌抗血清产生免疫反应(Western blot),并可在家兔中诱导产生抗体.94.9%(93/98)甲型副伤寒杆菌临床菌株含有ompA基因.100 μg和200 μg rOmpA对感染小鼠的免疫保护率分别为41.7%(5/12)和58.3%(7/12).rOmpA免疫小鼠或保护试验存活小鼠血清对各副伤寒杆菌H抗原的凝集效价为1:5～1:40.结论 ompA基因在甲型副伤寒杆菌临床菌株中分布广泛.rOmpA有良好的免疫原性和一定的免疫保护作用,可考虑为甲型副伤寒杆菌基因工程疫苗候选抗原.     

甲型副伤寒杆菌nmpC基因原核表达及表达产物免疫保护作用

目的 构建甲型副伤寒杆菌外膜蛋白基因nmpC的原核表达系统,确定其重组表达产物rNmpC免疫原性和保护作用,了解甲型副伤寒杆菌临床菌株nmpC基因携带及表达率.方法 采用PCR和T-A克隆法从甲型副伤寒杆菌临床株JH01中获得nmpC基因克隆并构建其原核表达系统.采用SDS-PAGE和Bio-Rad凝胶图像分析系统检测rNmpC表达情况及其产量,采用免疫扩散法、Western blot和微量肥达试验鉴定其抗原性和免疫应答性.采用PCR和ELISA分别检测98株甲型副伤寒杆菌临床菌株nmpC基因携带及表达率.采用小鼠感染模型了解rNmpC对甲型副伤寒杆菌致死性感染的免疫保护作用.结果 与报道的相关序列比较,所克隆的nmpC基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%.rNmpC表达量约为细菌总蛋白的30%.rNmpC免疫家兔可产生抗体并能与甲型副伤寒杆菌全菌抗血清产生阳性Western杂交信号.所有甲型副伤寒杆菌菌株均携带nmpC基因并表达NmpC蛋白,但伤寒杆菌、乙型及丙型副伤寒杆菌未检出nmpC基因.100μg和200μgrNmpC对感染小鼠的免疫保护率分别为41.7%(5/12)和66.7%(8/12).rNmpC免疫小鼠或保护试验存活小鼠血清仅对甲型副伤寒杆菌H抗原产生1∶5～1∶40的凝集效价.结论 NmpC是甲型副伤寒杆菌独有的序列保守、分布广泛且自然表达的外膜蛋白抗原,该外膜蛋白具有良好的免疫原性和一定的免疫保护作用,可作为多价甲型副伤寒杆菌基因工程疫苗候选抗原.     

利用小鼠感染模型筛选与鉴定幽门螺杆菌外膜蛋白抗原

目的:利用小鼠感染模型筛选与鉴定幽门螺杆菌SS1株的外膜蛋白抗原。方法:提取SS1株的外膜蛋白进行双向电泳,用幽门螺杆菌感染的小鼠血清作免疫印迹实验,将阳性反应蛋白点进行质谱鉴定分析,将肽质量指纹谱数据输入互联网上的蛋白质数据库进行检索。结果:获得32种抗原相关蛋白。通过与已有报道的幽门螺杆菌感染人抗原比较分析,发现大部分典型的保护性抗原在本实验中都可以检测到。结论:幽门螺杆菌感染的小鼠模型适用于人用保护性幽门螺杆菌抗原的筛选;而且此研究中得到的相关抗原蛋白对于寻找与鉴定幽门螺杆菌未知保护性抗原也有参考价值。     

甲型副伤寒沙门菌spaO-ompA融合基因构建及其表达产物免疫保护作用

目的 构建甲型副伤寒沙门菌spaO-ompA融合基因及其原核表达系统,确定重组表达产物rSpaO-OmpA免疫保护作用.方法 采用柔性肽序列连接spaO与ompA基因,构建spaO-ompA人工融合基因及其原核表达系统.采用SDS-PAGE和Bio-Rad凝胶图像分析系统检测目的重组表达产物rSpaO-OmpA表达情况及其产量.采用免疫扩散法、微量肥达和Western blot法鉴定rSpaO-OmpA 抗原性和免疫反应性.采用小鼠感染模型了解rSpaO-OmpA对甲型副伤寒沙门菌致死性感染的免疫保护作用,实验中采用重组表达的SpaO( rSpaO)及OmpA(rOmpA)作为对照.结果 所构建的spaO-ompA融合基因与spaO或ompA单基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100％.所构建的原核表达系统E.coli BL21 DE3pET42a-spaO-ompA能高效表达重组融合蛋白rSpaO-OmpA.rSpaO-OmpA能与甲型副伤寒沙门菌全菌抗血清结合并产生阳性杂交信号,免疫家兔后可产生特异性抗体.100 μg或200 μgrSpaO-OmpA对甲型副伤寒沙门菌感染小鼠的免疫保护率分别为66.7％ (8/12)和83.3％ (10/12),明显高于等量rSpaO及rOmpA( P＜0.05).rSpaO-OmpA免疫小鼠血清与不同副伤寒沙门菌H抗原的凝集效价为1∶5 ～ 1∶40、与rSpaO和rOmpA及rSpaO-OmpA免疫双扩散效价为1∶1 ～1∶16.结论 人工融合重组抗原rSpaO-OmpA免疫原性和免疫保护作用较等量rSpaO或rOmpA更强.     

感染人单核细胞THP-1前后钩端螺旋体外膜蛋白抗原表达差异性

目的 了解感染人单核细胞THP-1前后钩端螺旋体(简称钩体)外膜蛋白表达变化,为选择钩体基因工程疫苗候选抗原提供依据.方法 采用Triton X-114法提取感染THP-1细胞前后问号钩体黄疸出血群赖型赖株外膜蛋白.采用双向电泳技术分离钩体外膜蛋白,银染色法检测感染前后钩体外膜蛋白表达量及其差异.感染细胞后4个表达显著上调和4个表达显著下调的钩体蛋白点胰酶水解后,采用LC-MS/MS方法进行鉴定.应用生物信息学软件分析靶蛋白跨膜区和信号肽,采用实时荧光定量RT-PCR检测感染细胞前后靶基因mRNA水平变化.构建靶基因原核表达系统,采用钩体感染豚鼠模型了解重组靶蛋白的免疫保护作用.结果 感染THP-1细胞60 min后,问号钩体赖株外膜蛋白中Loa22、GroEL、F0F1 ATP合成酶α和β亚单位表达水平均显著升高(P＜0.05),FluB2、LigB、OmpA和OmpA家族蛋白表达显著下降(P＜0.05),实时荧光定量RT-PCR检测结果与之基本一致.生物信息学分析结果显示,上述8个外膜蛋白中,OmpA和OmpA家族蛋白为跨膜蛋白,其余均无跨膜结构,Loa22、LigB和OmpA家族蛋白含有信号肽.200 μg重组表达的靶蛋白 rLoa22或rGroEL对豚鼠的免疫保护率均为75.0％.结论 问号钩体赖株感染细胞时外膜蛋白表达谱可发生明显变化.感染后高表达的钩体外膜蛋白尤其是GroEL和Loa22,可作为钩体基因工程疫苗侯选抗原.     

幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位融合蛋白表达的研究

目的：获得大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）与幽门螺杆菌保护性抗原热休克蛋白A亚单位（HspA）的融合蛋白。方法：PCR扩增ltB和hspA基因，依次构建至表达载体pIM-1，转化大肠杆菌，SDS-PAGE、免疫印迹分析目的蛋白表达情况。采用GM1ELISA和D( )-半乳糖亲和层析方法检测重组LTB-HspA融合蛋白LTB组分与GM1神经节苷脂结合活性。结果：重组LTB-HspA融合蛋白表达量最高可达细菌总蛋白的25％。免疫印迹检测结果证实为重组LTB-HspA融合蛋白。GM1ELISA和D( )-半乳糖亲和层析方法检测结果证实重组LTB-HspA融合蛋白具有与GM1神经节苷脂结合的活性。结论：LTB-HspA融合蛋白的表达研究，为研制幽门螺杆菌分子内佐剂疫苗打下了基础。     

幽门螺杆菌Catalase基因的克隆、表达及其抗原性鉴定

目的：构建含人幽门螺杆菌（Hpylori，Hp）过氧化氢酶（catalase，KatA）编码基因的重组质粒，测定、分析其核酸序列，并在E.coli中表达，研究其抗原性。方法：应用PCR技术从HpDNA染色体中扩增KatA编码基因片段，将其T-A克隆和测序，并与GenBank公布的其他Hp菌株的基因序列比较，再将目的基因插入至融合表达载体pGEX-4T-1中进行表达，用GST亲和层析对其进行纯化。纯化产物用于对29株小鼠抗Hp-全菌单克隆抗体（mAb）的鉴定及与Hp啊感染患者血清进行Western blot。结果：KatA基因全长为1 515 bp，并在GenBank上登录（No．DQ333889），与GenBank公布的其他Hp菌株的核酸的同源性为96％～97％，表达的KatA融合蛋白的相对分子质量（Mr）为85 000，29株小鼠抗Hp全菌mAb中有4株mAb是针对KatA的，表达产物可被Hp感染患者的血清特异性识别。结论：重组KatA具有较好的抗原性，为坳检测试剂和疫苗的研究奠定了基础。     

ctB和ure I双基因融合表达及其免疫特性分析

目的构建霍乱毒素B亚单位(CtB)和幽门螺杆菌尿素膜通道蛋白(UreI)融合的原核表达质粒pET32a( )ctB/ureI,并初步研究融合蛋白CtB/UreI的表达特性和免疫特性。方法PCR从pUC18ctB中克隆ctB基因,定向在pET32a( )/ureI的ureI基因5′端插入ctB基因,构建ctB和ureI双基因原核表达质粒pET32a( )ctB/ureI,转该质粒于E.coliBL-21(DE3),经酶切和序列分析鉴定工程菌。IPTG诱导表达,HP-His亲和层析纯化,SDS-PAGE和Gel-ProAnalizer4分析,重组蛋白免疫BALB/c小鼠。用Westernblot和ELISA分析重组蛋白的免疫特性。结果工程菌含完整的ctB和ureI基因,与相对应基因的序列同源性分别为100%。在22℃,1mmol/LIPTG诱导4h后,重组蛋白的表达占菌体总蛋白12%,亲和层析纯化后蛋白纯度为94.3%。Westernblot表明重组蛋白分别能与相应的抗体反应,该蛋白免疫小鼠后能产生相应的IgG抗体。结论成功构建了能表达CtB/UreI蛋白的大肠杆菌表达菌株。对融合蛋白表达和纯化后,初步证明了该重组蛋白有CtB和UreI的双特异反应原性和免疫原性,为研究新型幽门螺杆菌疫苗奠定了坚实的基础。     

幽门螺杆菌napA-ctxB融合蛋白的基因克隆与表达

目的 克隆、表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白napA与霍乱毒素B亚单位ctxB融合基因napA-ctxB(nctB),为制备预防H.pylori感染的疫苗奠定基础.方法 用PCR方法扩增ctxB目的基因片段,克隆至pQE30-napA质粒的napA基因上游,构建含双基因的表达质粒pQE30-napA-ctxB(pQE30-nctB),经测序分析确认后转化E.coli DH5α,经IPTG诱导表达融合蛋白NCTB,融合蛋白NCTB经镍离子柱纯化.结果 PCR扩增出807 bp的目的基因片段nctB.工程菌pQE30-nctB-DH5α经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,Mr为30 000,与预期的一致,约占菌体总蛋白的27%,重组蛋白用Ni2 -NTA 树脂提纯,纯化后的蛋白质经SDS-PAGE分析可见单一条带,图象软件分析表明纯度可达94%以上.Western blot 显示重组蛋白质有良好的抗原性.结论 构建含双基因的表达质粒pQE30-nctB成功,并在大肠杆菌DH5α中高效的表达.     

PBAD表达系统对抗-HBs Fab抗体表达的影响

目的研究PBADP替换Plac的原核表达系统对重组抗-HBs Fabs的表达效率、产量及其抗体活性的影响。方法通过Western blot、抗体不同稀释度的Dot blot和抗原特异性结合实验，对两种表达系统进行比较。结果在PBAD控制下表达的抗．HBs Fabs与Plac控制下的相比，Western blot显示两种表达系统都能完整表达抗-HBs Fab抗体，Mr为50000。PBAD表达系统表达的抗-HBs Fabs多以可溶形式存在于周质腔中，而Plac表达系统表达的抗-HBs Fabs更多的释放入培养上清液。抗体不同稀释度的Dot blot结果显示pBAD-抗HBs Fab表达系统表达的抗体效价较pComb3-抗HBs Fad高，乙型肝炎表面抗原特异性结合实验证实两种表达系统表达的抗体的抗原结合活性无明显差别。结论PBAD表达系统明显提高了抗-HBs Fab的表达量并保持了原抗体活性。     

一种高效表达小干扰RNA载体的构建研究

目的：用mir30前体骨架来构建高效表达小干扰RNA载体。方法：通过基因合成的方法，将mir30前体骨架进行全长基因合成，并在合成的mir30前体骨架中引入合适的酶切位点用于外源发夹DNA的克隆，然后将之克隆到含U6启动子的表达载体中。将针对绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的小干扰RNA克隆到以上表达载体中，通过转染及Western blot来检测新的小干扰RNA表达载体的基因沉默效率。结果：同目前常用的含polⅢ的小干扰RNA表达载体相比较，用mir30前体骨架表达针对GFP的小干扰RNA的表达载体可以明显抑制GFP的表达。结论：用mir30前体骨架构建的小干扰RNA表达载体可高效表达外源小干扰RNA。     

急性淋巴细胞白血病细胞β2整合素及L-选择素的表达与意义

目的和方法:研究急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞粘附分子β₂整合素(CD11a、CD11b)及L-选择素(CD62L)的表达及其临床意义。用流式细胞仪检测45例ALL及25例正常人骨髓单个核细胞的CD11a、CD11b、CD62L表达。结果:①CD11a、CD11b在ALL细胞上表达均明显低于正常人,CD11b低表达的阳性率为100%,50%患者有CD11a低表达。而60%患者CD62L在ALL细胞上表达升高。②CD11a在B-ALL表达明显低于T-ALL表达,CD62L在B-ALL表达高于T-ALL。③浸润组CD11a表达高于非浸润组(P＜0.05)。④ALL完全缓解组CD11a、CD11b的表达在正常范围。结论:急性淋巴白血病细胞上存在多个粘附分子的表达异常,检测粘附分子有助于判断白血病细胞类型及疗效。     

人源抗-HAV Fab真核表达载体的构建及表达

目的 构建人源抗－ＨＡＶＦａｂ真核表达载体并进行表达。方法 采用ＤＮＡ重组技术将抗体重轻链基因与信号肽基因连接,并分别插入真核表达载体ｐＣｄｈｆｒｌ、ｐＣＤＮＡ３．１;以脂质体介导法转染ＣＨＯ细胞,经Ｇ４１８筛选细胞,ＥＬＩＳａｂ基因的表达。结果 成功地构建了Ｆａｂ表达载体。转染细胞后,经ＥＬＩＳＡ检测,细胞增养上清中有抗原结合活性的Ｆａｂ片段。结论Ｆａｂ真核表达载体的构建及其在ＣＨＯ细胞中的表达     

真核表达载体pEGFP-GPC3的构建及表达

目的:构建磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)真核表达载体pEGFP-GPC3,并在小鼠树突状细胞(DC)表达.方法:将质粒pCMV-SPORT6-GPC3和载体pEGFP-N1分别进行双酶切获得目的基因GPC3片段和空载体,回收纯化后用T4连接酶将两者连接并转化E.coli DH5α菌株,用EcoR I、BamH I双酶切鉴定后通过脂质体法转染到DC中,然后进行荧光检测和Western blot分析.结果:构建的真核表达载体pEGFP-GPC3,转染DC后,荧光显微镜下可见转染的DC中有EGFP-GPC3融合蛋白的表达,Western blot分析发现有相对分子质量(M,)大小约为67 000的蛋白条带.结论:成功地构建了真核表达载体pEGFP-GPC3并在转染DC后能在其中表达,为进一步研究GPC3基因的功能提供实验基础.     

SERPINA3K原核表达系统的构建及其表达

目的：通过构建丝氨酸蛋白酶抑制因子SERPINA3K的原核表达载体,并将其转化到Rosetta-g ami2感受态细胞中,表达重组SERPINA3K,从而为对其功能的深入研究奠定了基础.方法：以小鼠MS-1细胞cDNA为模板通过PCR的方法扩增Serpina 3k基因的表达全片段,再将其插入到原核表达载体pET-41a中,酶切并测序鉴定重组体.将构建好的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta-gami2感受态细胞,表达产物用Western blot鉴定.结果：原核表达载体pET-4 1a-Serpina 3k成功构建,可在大肠杆菌Rosetta-gami2中高效表达,得到重组蛋白SERPINA3K,经Western blot鉴定正确.结论：成功构建SERPINA3K原核表达载体且获得表达,为研究SERPINA3K生物学活性及产品开发提供了实验基础.     

单链抗体（ScFv）表达载体的构建及抗HBs ScFv的表达

通过ＤＮＡ重组技术和ＰＣＲ技术，将Ｆａｂ表达载体改建成了ＳｃＦｖ表达载体。该载体可以表达表达方式产生噬菌体抗体，用于抗体库技术，也可以分泌型表达产生有活性的ＳｃＦｖ。所表达的抗ＨＢｓ ＳｃＦｖ具有与其亲本Ｆａｂ相同的抗体活性。载体上具有聚组氨酸编码序列，使表达的ＳｃＦｖ可经金属螯合层析法进行简便有效的纯化。     

人SYNOVIOLIN基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建携EGFP的人SYNOVIOLIN基因真核表达载体。方法：应用基因重组技术,根据人SYNOVIOLIN基因序列和表达载体pIRES2-EGFP质粒上的多克隆位点设计引物,对含有SYNOVIOLIN基因的质粒pCDNA3-syno扩增,得到约1900 bp的目的片段,进行T-A克隆。SalⅠ/BamHⅠ双酶切测序正确的重组质粒,回收SYNOVIOLIN cDNA片段,将其亚克隆于pIRES2-EGFP载体的多克隆位点内得到质粒pIRES2-EGFP-syno。脂质体法转染HEK293细胞, 用激光共聚焦显微镜和Western blot检测EGFP和SYNOVIOLIN在HEK293细胞的表达。结果：PCR,酶切及测序结果表明pIRES2-EGFP-syno真核表达载体构建成功,激光共聚焦显微镜和Western blot显示EGFP和SYNOVIOLIN蛋白在HEK293细胞中成功表达。结论：成功构建pIRES2-EGFP-syno真核表达载体并在HEK293细胞表达,为抗肌腱粘连的　SYNOVIOLIN基因治疗研究奠定基础。     

人重组pEGFPC1-uPA ATF质粒的构建及表达的研究

目的构建含人uPA ATF基因的真核表达质粒，并研究其对小鼠细胞株Pam212细胞的影响。方法设计引物，利用PCR从原核表达质粒中扩增人uPAA1F基因片断，并导入真核表达载体的绿色荧光蛋白pEGFPCI中，利用电泳和测序检测构建状况，荧光显微镜观察和免疫细胞化学检测转染情况，通过MTT、体外迁移实验检测对小鼠Pam212细胞株的影响。结果电泳和测序表明构建的质粒准确，uPA ATF cDNA阅读框完整，连接部位序列正确；质粒转染Pam 212细胞株成功，并且能抑制细胞的增殖和迁移。结论成功构建了真核表达载体pEGFPC1-uPA ATF质粒，明确了人uPA ATF基因片断能降低小鼠细胞的增殖和迁移，为进一步在体实验研究打下了基础。     

过表达TRIM69抑制细胞内源c-Jun蛋白的表达

目的探索TRIM69负调控AP1信号通路及抑制内源c-Jun蛋白表达的分子机制。方法在子宫颈癌细胞He La细胞或人胚肾细胞HEK293T细胞共转染荧光素酶报告基因质粒和空载体或TRIM69,共转空载体组作为对照,通过双荧光素酶报告基因实验检测了TRIM69对8条关键信号通路的影响;在HEK293T细胞过表达TRIM69全长及各个结构域的截短体,通过Western blot实验检测了TRIM69抑制细胞内源c-Jun蛋白表达的关键结构域;在HEK293T细胞过表达TRIM69,利用cycloheximide(CHX)、MG132或chloroquine分别处理细胞,通过蛋白稳定性实验探讨了TRIM69负调控内源c-Jun蛋白表达的分子机制。结果 TRIM69可以特异负调控AP1信号通路(P0.05),并且TRIM69对内源c-Jun蛋白表达的抑制作用依赖于其RBCC结构域(P0.05),进一步研究发现TRIM69通过蛋白酶体途径影响内源c-Jun蛋白的稳定性(P0.05)。结论 TRIM69负调控AP1信号通路并通过蛋白酶体途径影响内源c-Jun蛋白的降解。