DC-SIGN荧光融合蛋白的构建、表达和生物学功能初探

目的 构建绿色荧光蛋白（EGFP）标记的DC-SIGN分子（DC-SIGN-EGFP融合蛋白），并在哺乳动物细胞中获得功能性表达。方法 PCR方法获得DC-SIGN分子和EGFP分子的cDNA，分别克隆入真核表达载体pEGFP-N1和真核表达载体pCI，使EGFP荧光蛋白分别位于DC-SIGN蛋白的C末端和N末端。在转染COS-7细胞后，在激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测重组分子的表达及融合蛋白在细胞定位情况。激光共聚焦显微镜检测融合蛋白的功能情况。结果 获得了预期的重组表达质粒，经DNA测序证实开放阅读框正确，转染COS-7细胞后绿色荧光蛋白位于细胞膜，仅EGFP位于DC-SIGNN-末端的融合蛋白可被抗DC-SIGN抗体结合。EGFP位于DC-SIGN N-末端的融合蛋白可有效摄取DC-SIGN受体的高亲和力配体le（x）寡糖。结论 所构建的DC-SIGN-EGFP融合蛋白在细胞内表达后具有细胞表面受体分子的特征性分布，可被抗DC-SIGN抗体检测及摄取特异性配体，为进一步深入研究DC-SIGN分子功能提供了良好的模型。     

人RUVBL2真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建带有绿色荧光蛋白的RUVBL2真核表达载体pEGFP-N1-RUVBL2,并鉴定其在HeLa细胞中的表达。方法:以pGADT7-RUVBL2质粒为模板,PCR扩增RUVBL2基因,首先克隆至T载体中,进一步亚克隆至p-EGFP-N1,并对重组表达载体进行酶切及测序鉴定。采用脂质体转染法将重组质粒瞬时转染HeLa细胞系,应用荧光显微镜观察绿色荧光融合蛋白的表达,并用Western blot法检测RUVBL2-GFP融合蛋白的表达。结果:经限制性酶切鉴定及测序分析证实pEGFP-N1-RUVBL2载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的HeLa细胞中有绿色荧光蛋白的表达,Western blot法证实转染细胞中能表达RUVBL2-GFP融合蛋白。结论:pEGFP-N1-RU-VBL2表达载体构建成功,并在HeLa细胞内成功表达。     

Expression of rat brain-derived neurotrophic factor in COS-7 cells following its eukaryotic expression vector construction

目的:构建脑源性神经营养因子(BDNF)基因真核表达载体,检测其转染COS-7细胞后的表达.方法:从大鼠海马组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法获得目的基因片段,克隆至pGEM-T载体中.经测序确证后将BDNFcDNA片段与pEGFP-N1载体定向连接.将鉴定正确的重组体pEGFP-N1-BDNF以脂质体法转染至COS-7细胞中,用RT-PCR鉴定BDNF mRNA的表达,免疫印迹法检测BDNF蛋白质表达水平.结果:克隆了BDNF的cDNA,并构建了其真核表达载体pEGFP-N1-BDNF,经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性;免疫印迹法分析显示,转染48 h时,COS-7细胞以分泌proBDNF-GFP融合蛋白为主,在96 h以分泌成熟BDNF-GFP融合蛋白为主.结论:成功构建pEGFP-N1-BDNF真核表达载体,并且在COS-7细胞中得到高效表达,BDNF前体及成熟体同时分泌到胞外,在不同时间点分泌组合不同.     

AngRem104基因与绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建及在COS-1细胞中的表达定位

构建以绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein,GFP)为报告基因的重组表达质粒AngRem104-pEGFP-N1，利用脂质体转染体外培养的COS-1细胞，在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察AngRem104-EGFP融合蛋白在细胞中的分布和定位，用RT-PCR和Western blot方法验证其mRNA和蛋白的表达。结果表明在空载体pEGFP-N1转染组中，COS-1细胞内绿色荧光呈弥散分布；重组质粒AngRem104-pEGFP-N1转染组中，绿色荧光集中在细胞核中，随着表达量的增高，绿色荧光在细胞核中聚集成团块状，颗粒状，RT-PCR的结果表明AngRem104在重组质粒转染组中的表达明显高于空载体和空白对照组。Western blot的结果也确证了AngRem104-EGFP融合蛋白的表达。提示新基因AngRem104/pEGFP融合基因真核表达载体在真核细胞COS-1中获得了表达，细胞所表达的融合蛋白具有An-gRem104和EGFP的双重活性，可用荧光显微镜直接观察其表达情况及亚细胞定位，为基因功能研究提供了线索。     

抗人HBsAg单链抗体基因的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的：构建抗人HBsAg单链抗体基因，并分析其在COS—7细胞中的表达。方法：以从噬菌体抗体库中筛选的抗HBsAg的Fab抗体基因为模板，分别扩增其轻、重链可变区(VL、VH)基因，通过重组PCR方法将轻、重链可变区基因用连接肽(C1y4Ser)3的编码序列连接，并引入前导肽编码序列，构建具有L—VH—Linker—Vl结构的单链抗体基因。将所构建的单链抗体基因克隆入绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体pEGFP—N3，并转染COS—7细胞进行表达。结果：经测序表明，前导肽、连接肽、VL及Vh的序列正确。酶切鉴定证实，成功地构建了GFP基因融合表达载体。瞬时转染COS—7细胞后，通过荧光显微镜观察证实有ScFv融合蛋白的表达。转染细胞的培养上清浓缩后，进行SDS—PAGE及westem blot分析，可检出ScFv融合蛋白的分泌性表达。培养上清的间接ELISA检测证实，所表达的单链抗体具有与HBsAg结合的特异性。结论：成功地构建了抗人HBsAg单链抗体基因，并可在COS—7细胞中分泌性表达。     

IL-13及其变异体真核表达载体的构建表达与亚细胞定位

目的：体外构建野生型人白细胞介素-13（whIL-13）及变异型人白细胞介素-13（mhIL-13）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融和蛋白真核表达载体，分析其在COS-7细胞中的表达和亚细胞定位。方法：以RT-PCR方法扩增whIL-13、mhIL-13全长编码基因，构建EGFP-whIL-13、EGFP-mhIL-13融和蛋白真核表达载体，转染COS-7细胞，以激光扫描共聚焦显微镜观察融合蛋白的表达及其在细胞内的分布情况。结果：两种融和蛋白表达载体均构建正确，将其转染COS-7细胞后，在阳性克隆胞浆内均可见明亮的绿色荧光，胞核空虚。结论：成功构建EGFP-whIL-13、EGFP-mhIL-13融和蛋白表达载体，并在COS-7细胞中得到表达，表达的两种融和蛋白细胞内分布特征没有区别，均位于胞浆内。     

小鼠B7-H4基因克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆小鼠B7-H4(mB7-H4)基因cDNA全长,构建表达跨膜型mB7-H4-GFP融合蛋白的真核表达载体pmB7-H4-GFP和表达可溶性mB7-H4-Fc融合蛋白的真核表达载体pmB7-H4-Fc。方法:采用RT-PCR技术从小鼠脾细胞总RNA中逆转录mB7-H4cDNA,将其全长cDNA去掉中止密码克隆入真核表达载体pEGFP-N1中,并转染293T细胞使其表达跨膜型mB7-H4-GFP融合蛋白;将其胞外功能区cDNA克隆入pcDNA3·1-hFc真核表达载体中,并转染COS-7细胞使其表达可溶性mB7-H4-Fc融合蛋白。结果:序列测定证实克隆的mB7-H4全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实mB7-H4分别正确插入pEGFP-N1和pcDNA3·1-hFc载体中,两种表达载体分别转染293T细胞和COS-7细胞后可分别表达跨膜型mB7-H4-GFP和可溶性mB7-H4-Fc。结论:成功地克隆mB7-H4基因并构建了两个真核表达载体,它们可分别表达跨膜型和可溶性融合蛋白。     

人源性抗HBc单链抗体真核表达载体的构建及其细胞内表达

目的：构建人源性抗HBc单链抗体的真核表达载体并在细胞内表达。方法： 采用DNA重组技术将特异性人源性抗HBc单链抗体基因插入真核表达载体pEGFP-c1；转染HepG2细胞，经G418筛选细胞，荧光倒置显微镜观察细胞内抗HBc单链抗体与绿色荧光蛋白融合表达情况，并用ELISA法检测HBc单链抗体基因的细胞内表达。结果： 成功地构建了人源性抗HBc单链抗体的真核表达载体。转染HepG2细胞并筛选后，经荧光倒置显微镜观察，细胞内有绿色荧光蛋白表达；ELISA检测细胞内表达的单链抗体片段具有HBcAg结合活性。结论： 人源性抗HBc单链抗体的真核表达载体的构建并在细胞内成功表达，为胞内抗HBc单链抗体的进一步研究奠定了基础。     

hdll1ext-Fc融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的：构建人dlll^ext(human delta-likel extraeellular region)-Fe融合蛋白的真核表达载体pEF-BOSneo-hdlll^ext-Fc，并在COS-7细胞中进行表达。方法：从人脑cDNA文库中PCR扩增人delta-likel胞外段，通过DNA重组构建真核表达载体pEF-BOSneo-hdlll^ext-Fe。瞬时转染COS-7细胞，应用RT-PCR、细胞免疫荧光技术和双抗体夹心ELISA，检测融合蛋白的表达。结果：成功地构建了真核表达载体pEF-BOSneo-hdlll^ext-Fc。以重组载体转染COS-7细胞后，RT-PCR结果显示delta-likel胞外段与IgG1 Fe在mRNA水平正确拼接；细胞免疫荧光染色呈阳性反应；夹心ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论：成功地扩增了人delta-likel胞外段，构建了pEF-BOSneo-hdlll^ext-Fc真核表达载体，并在COS-7细胞中获得表达，为下一步研究奠定了基础。     

重组双功能域补体受体Ⅰ型分子在Vero细胞中的稳定表达及其抑制补体活化的初步研究

构建包含人重组双功能域人补体受体Ⅰ与绿色荧光蛋白(GFP)的重组质粒,观察融合蛋白在非洲绿猴肾细胞(Vero)内表达并检测其抑制补体活化的能力。PCR方法扩增出重组双功能域CR1分子,限制性内切酶XhoⅠ和SalⅠ将重组分子连入真核表达载体pEGFP-N2中,构建出重组质粒pEGFP-N2/CR1-2D,脂质体转染Vero细胞中。新霉素G418筛选出稳定表达细胞克隆,荧光显微镜下观察绿色荧光融合蛋白在细胞内的表达。用Vero细胞和免疫小鼠获得的抗Vero细胞多克隆抗体激活补体后,通过检测乳酸脱氢酶的释放来分析重组蛋白抑制补体活化的功能。结果显示pEGFP-N2/CR1-2D质粒经酶切及测序分析证实载体构建正确。转染细胞后,荧光显微镜下观察到重组质粒pEGFP-N2/CR1-2D在Vero细胞中能够大量表达,G418筛选出了稳定表达细胞克隆,乳酸脱氢酶活性检测显示,与对照组相比CR1-2D能够显著的抑制补体的活化(P0.05),初步证实了其能够抑制补体的活化。