植物内生菌抗病毒活性成分的研究进展

自从1993年首次从短叶红豆杉的韧皮部分分离到一株产紫杉醇的内生真菌后,研究者就开始不断地从内生菌中分离出各种活性代谢产物[1],这其中就包括抗病毒活性代谢产物.乙型肝炎病毒、甲型H1N1和H5N1型高致病性禽流感病毒、人类免疫缺陷病毒( HIV)和严重急性呼吸综合征病毒( SARS-CoV)等引起的病毒性传染病,对人类的健康产生巨大的影响.抗病毒药物已成为全世界新药研发的一个重要课题[2].植物内生菌的次生代谢产物是可以重复利用的资源,可以通过菌种诱变、培养条件改变以及代谢调控等手段进行目标产物的优化,因而在药物研发中发挥了巨大的作用.本文着重论述了国内外新近发现的抗病毒化合物,并按照化学结构官能团进行了如下分类.     

丰肉结海绵相关真菌产黄青霉HLS111菌株活性代谢产物研究

目的对我国南海水域丰肉结海绵相关真菌产黄青霉菌HLS111的活性代谢产物进行研究。方法采用HPLC-DAD技术与活性筛选相结合的方法,通过硅胶柱、凝胶柱及HPLC等色谱方法对HLS111发酵产物进行分离纯化;通过核磁共振、质谱等波谱分析手段对分离得到的化合物进行结构鉴定;并对单体化合物进行抗肿瘤、抗HIV、抗炎活性测定。结果分离得到12个化合物。其中2个黑麦酮酸类化合物:黑麦酮酸F(1)和D(2);4个生物碱类化合物:环(L-色氨酸-L-苯丙氨酸)(3)、citreoindole(4)、meleagrin(5)、脑苷脂B(6);4个甾体类化合物:麦角甾醇(7)、(22E,24R)-5α,8α-过氧化麦角甾-6,22-烯-3β-醇(8)、globosterol(9)、β-谷甾醇(10);1个三萜类化合物:24-亚甲基环木菠萝烷醇-反式阿魏酸(11);1个蒽醌类化合物:大黄素(12)。对化合物4的氢谱、碳谱数据进行了归属。初步的药理研究表明,黑麦酮酸类化合物表现出较强的抗肿瘤活性,化合物citreoindole表现出一定的抗HIV及抗炎活性。结论海绵相关真菌产黄青霉HLS111菌株体现了次生代谢产物化学结构的多样性;黑麦酮酸类化合物为产黄青霉HLS111的主要抗肿瘤活性成分。     

柽柳内生链霉菌CLR304抗MRSA次级代谢产物304A的研究

目的从沙生植物柽柳来源的内生链霉菌CLR304发酵液中分离鉴定具有强抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)活性的次级代谢产物。方法基于16S rRNA基因序列,对菌株CLR304进行初步分类鉴定;采用液体发酵、溶剂萃取、正相硅胶层析、薄层层析以及高效液相制备分离纯化CLR304的活性次级代谢产物304A;根据紫外光谱、高分辨质谱和核磁共振波谱及文献比对,鉴定化合物304A的平面结构;采用琼脂稀释法测定化合物的抗菌活性。结果菌株CLR304为链霉菌,从其发酵液中分离获得抗MRSA次级代谢产物304A,证明为维吉尼霉素M_1。抑菌活性实验显示其对葡萄球菌、屎肠球菌的敏感株和耐药株均具有较强活性(MIC=1~4μg/ml)。结论首次从柽柳中获得产生维吉尼霉素M_1的内生链霉菌,表明沙生植物柽柳蕴含药用放线菌资源。     

刺五加内生放线菌Streptomyces sp. CWJ-256次生代谢产物研究

目的研究刺五加植物内生放线菌CWJ-256次级代谢产物及其生物活性。方法采用16S rRNA基因同源进化分析对菌株CWJ-256进行初步分类鉴定,采用抗菌活性追踪方式,对CWJ-256发酵液通过硅胶柱层析、凝胶柱层析、薄层色谱显色以及高效液相色谱等方法对目标化合物分离纯化,利用核磁共振波谱法和质谱法鉴定化合物的结构。采用MTT法测试其抗肿瘤细胞增殖活性。基于Gluc报告系统对化合物3的体外抗流感病毒药效学进行初步评价。结果菌种鉴定显示Streptomycessp.CWJ-256为生黑孢链霉菌Streptomyces melanosporofaciens;从该菌株的发酵代谢产物中分离得到3个活性化合物,经结构鉴定为efomycin G(化合物1)、11,11'-O,O-dimethylelaiophylin(化合物2)、elaiophylin(化合物3);抗肿瘤细胞增殖活性评价显示,化合物1和3对体外培养的人乳腺癌细胞MDA-MB-231具有增殖抑制作用(IC50分别为4.385和2.118μmol/L)。体外抗流感病毒药效学评价显示,化合物3对流感病毒A/WSN/33(H1N1)具有一定抑制效果。结论刺五加内生放线菌Streptomycessp.CWJ-256可产生多个洋橄榄叶素类次生代谢产物,显示出抗细胞增殖、抗病毒等多种活性。     

五种药用石斛内生真菌抑制HIV-1整合酶活性研究

目的 评价5种药用石斛内生真菌发酵产物抑制HIV-1整合酶的活性.方法 将分离自石斛的202株内生真菌提取物共404个采用高通量ELISA法评价其抑制HIV-l整合酶活性;对抑制活性大于100％的样品进行量效关系考察并进行体外抑制肿瘤细胞活性筛选.结果 筛选得到19个对HIV-l整合酶抑制活性大于80％的样品,其中样品5119F、5297F、5097F、5140J和5211F的抑制率分别达到117.96％、113.53％、108.62％、103.74％和109.02％,其对应的IC50值分别为0.02024、0.003125、0.00862、0.01007 和 0.01192 mg/ml.结论石斛属药用植物内生真菌是一个潜在的、丰富的用于筛选HIV-1整合酶抑制剂的资源库,值得进一步研究和开发.     

HPV18 E6 siRNA对宫颈癌细胞增殖及化疗药物敏感性的影响

目的探讨HPV18 E6siRNA联合紫杉醇应用对宫颈癌细胞生长的影响。方法用RNAi抑制HeLa细胞中HPV18 E6蛋白的表达。Western blot检测E6、P53和P21的蛋白表达量,MTT法检测细胞的增殖活性及细胞对紫杉醇的敏感性。结果抑制HPV18 E6的表达后,P53和P21的表达量均显著升高,HeLa细胞的生长受到抑制(P<0.01)。加入紫杉醇后,细胞增殖速度较对照组明显降低(P<0.01)。结论HPV18 E6siRNA可有效沉默HeLa细胞中E6基因的表达,抑制细胞增殖,并提高细胞对化疗药物的敏感性。     

人LAK细胞抗菌杀瘤活性多肽HLP-2b的分离纯化

目的 :分离纯化人LAK细胞小分子抗菌多肽 ,并检测其抗肿瘤细胞株K5 6 2活性。方法 :采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞 ,并用IL 2和PHA刺激培养。 5 %乙酸匀浆细胞获得其酸溶性提取物。应用制备性酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳技术和反相高效液相色谱技术分离纯化多肽 ,Tricine SDS PAGE鉴定其分子量 ,并运用琼脂糖弥散法、MTT法鉴定其抗菌、抗肿瘤活性。结果 :从人LAK细胞酸溶性提取物中纯化出一多肽 ,分子量为 7 9kD ,命名为HLP 2b ,具有抗金黄色葡萄球菌活性和抗肿瘤细胞株K5 6 2活性。结论 :HLP 2b可能为LAK细胞一新的抗菌抗瘤效应分子。     

靶向hTERT RNA干涉促进人宫颈癌HeLa细胞凋亡的研究

目的：利用RNA干涉技术抑制肿瘤细胞端粒酶表达，探讨其对肿瘤细胞凋亡的诱导作用。方法：将成功构建的针对hTERT的siRNA(small interferencing RNA)表达载体转染HeLa细胞，通过透射电镜、免疫印迹和流式细胞术(FCM)等方法检测人宫颈癌HeLa细胞的凋亡情况。结果：构建的siRNA表达载体可以诱导HeLa细胞发生凋亡。结论：针对人端粒酶逆转录酶的siRNA表达载体稳定转染HeLa细胞，可诱导HeLa细胞发生凋亡。     

人LAK细胞抗菌杀菌活性多肽HLP—2b的分离纯化

目的：分离纯化人LAK细胞小分子抗菌多肽，并检测其抗肿瘤细胞株K562活性。方法：采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞，并用IL-2和PHA刺激培养。5%乙酸匀浆细胞获得其酸溶性提取物。应用制备性酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳技术和反相高效液相色谱技术分离纯化多肽，Tricine-SDS-PAGE鉴定其分子量，并运用琼脂糖弥散法，MTT法鉴定其抗菌、抗肿瘤活性。结果：从人LAK细胞酸溶性提取物中纯化出一多肽，分子量为7.8kD，命名为HLP-2b，具有抗金黄色葡萄球菌活性和抗肿瘤细胞株K562活性。结论：HLP-2b可能为LAK细胞一新的抗菌抗瘤效应分子。     

海洋链霉菌IMB3-202产生的吲哚咔唑生物碱

目的分离鉴定海洋链霉菌IMB3-202产生的抗菌和抗肿瘤活性产物。方法利用Anti SMASH对菌株基因组进行生物信息学分析;运用多种色谱手段分离纯化IMB3-202的活性产物;通过波谱学方法鉴定化合物的化学结构;采用微量肉汤稀释法和MTT法分别测定化合物的抗菌和细胞毒活性。结果菌株IMB3-202基因组含有一条吲哚咔唑类生物合成基因簇。通过发酵条件优化,从中分离鉴定了4个吲哚咔唑类化合物,结构分别确定为星形孢菌素、3'-O-去甲基星形孢菌素、holyrine A和K252c。星形孢菌素、3'-O-去甲基星形孢菌素和holyrine A对HeLa细胞、HCT116和MCF-7等肿瘤细胞具有很强的抑制活性,IC_(50)值为0.75~1192.8 nmol/L。星形孢菌素对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌显示出较弱的抗菌活性,最低抑菌浓度值为128μg/ml。结论通过基因组序列分析,可以在基因水平上预测产物结构,快速识别特定类型产物。     

816株真菌感染分布及药敏分析

目的了解本院医院感染真菌分布的特点及对常用抗真菌药物的耐药情况。方法CHROMagar显色培养基及ATB真菌试剂盒进行鉴定;药敏试验采用纸片扩散K—B法。结果2008年1月至2009年6月我院临床共分离真菌816株,其中白色念珠菌（占53．2％）是引起真菌感染的最常见菌种,其次是热带念珠菌（21．6％）、光滑念珠菌（15．6％）、近平滑念珠菌（5．0％）和克柔念珠菌（2．3％）。药敏试验结果显示各种真菌对两性霉素B、制霉菌素的敏感性最高,分别达98％和99％,其次是氟康唑、伊曲康唑。结论真菌感染率呈逐年上升趋势,耐药率也逐渐增高。因此应及时对送检标本进行真菌培养和药敏试验,合理使用抗真菌药物,减少医院感染多重耐药和深部真菌感染的发生。     

G实验和真菌培养在艾滋病人深部真菌感染中的联合诊断

目的:探讨血清(1-3)-β-D葡聚糖对艾滋病人深部真菌感染的早期诊断。方法:对2014年1月~2014年3月入住我院的68例疑为深部真菌感染的艾滋病人,进行血清(1-3)-β-D葡聚糖检测,并与真菌培养加以对比及结合,观察其在深部真菌感染中的诊断价值。结果:68例疑为深部真菌感染的艾滋病患者,血清(1-3)-β-D葡聚糖阳性率为91.5%,而真菌培养的阳性率仅为57.8%,血清(1-3)-β-D葡聚糖检测阳性率明显高于真菌培养(X2=0.96,P0.05)。血清(1-3)-β-D葡聚糖检测与真菌培养相结合,灵敏度、特异度以及阳性预测值和阴性预测值比单独血清(1-3)-β-D葡聚糖检测或真菌培养阳性率高。结论:血清(1-3)-β-D葡聚糖检测能更早、更灵敏反应深部真菌早期感染;将其与真菌培养结合,能提高深部真菌感染的诊断率。     

转录因子环磷酸腺苷反应元件结合蛋白在紫杉醇诱导HeLa细胞周期阻滞中的作用及其机制

目的探讨转录因子环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)在紫杉醇诱导宫颈腺癌HeLa细胞周期阻滞中的作用及其分子机制。方法 MTT法确定紫杉醇的最佳浓度和处理时间;PCR技术构建pCI neo/CREB(PN)重组质粒及pCI neo/CREB-M(PM)定点突变质粒;流式细胞术检测细胞周期,Western blotting检测磷酸化CREB(pCREB)、CREB、cyclins以及CDKs蛋白表达。结果紫杉醇抑制HeLa细胞增殖的有效条件为0.1μmol/L处理24 h。0.1μmol/L紫杉醇诱导G2/M细胞数量增加,并呈时间依赖性;cyclin A表达量下调,cyclin B1、D1和pCREB表达量上调。此外,紫杉醇的处理对cyclin E、CDK1、CDK2、CDK4和CREB表达量并无显著性改变。然而,PM联合紫杉醇处理后显著性地反转了紫杉醇单独处理引起的cyclin A下调、cyclin B1和cyclin D1的上调,并且细胞周期G2/M期阻滞显著性减少。结论转录因子CREB介导的靶向细胞周期蛋白表达在紫杉醇诱导的细胞周期阻滞过程中扮演重要角色。     

螃蟹甲内生真菌Chaetosphaeronema sp.的化学成分研究

目的 研究一株来源于藏药螃蟹甲内生真菌 PHY-24的化学成分。 方法 采用麦麸培养基,对内生真菌 PHY-24进行放大培养,通过硅胶柱色谱、MCI 柱色谱、ODS 柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱、高效液相色谱等对其发酵液中的化学成分进行分离纯化,利用 NMR、MS 等波谱方法进行化学成分的结构鉴定,并测定这些成分抗 HIV-1整合酶链转移反应活性。 结果 从内生真菌 PHY-24发酵液的乙酸乙酯提取部分分离并鉴定了4个化合物,分别是：integrastatin B（1）、2-乙酰基-3,5-二羟基-苯乙酸（2）、curvulin （3）、O-methylcurvulinic acid（4）。其中化合物（1）和（2）具有抗 HIV-1整合酶链转移反应活性,其 IC50分别为6.22和75.1μmol/L。 结论 4个化合物均为从此属真菌中首次分得,其中化合物（1）、（2）具有抗 HIV-1整合酶链转移反应活性。化合物（2）的活性为首次报道。     

Acanthamoebicidal activity of <Emphasis Type="Italic">Fusarium</Emphasis> sp. Tlau3, an endophytic fungus from <Emphasis Type="Italic">Thunbergia laurifolia</Emphasis> Lindl.

A fungal endophyte identified as Fusarium sp. Tlau3 was isolated from fresh twig of Thunbergia laurifolia Lindl., a Thai medicinal plant collected from the forest of Chiang Mai Province, Northern Thailand. The fungus was grown on a medium containing yeast extracts and sucrose. The fungal metabolites were isolated from the culture broth by dichloromethane extraction, isooctane/methanol then n-butanol/water partitions, and fractionation with Sephadex LH 20 column chromatography. Acanthamoebicidal fractions were found to induce the formation of large contractile vacuole (LCV) in trophozoites of an Acanthamoeba clinical isolate, leading to cell lysis under isotonic and hypotonic conditions within 1 h. In hypertonic condition, LCV formation was also induced but without cell lysis. Acridine orange staining of the treated cells revealed increased intracellular acidity, implying an increased proton pumping or a vacuolar proton-ATPase (V-ATPase) stimulation. Scanning electron microscopy showed cell membrane damage with intact cytoplasmic organelles. Our finding has indicated that contractile vacuoles of Acanthamoeba trophozoites are the primary target of the amoebicidal substance(s) from this endophytic fungus.     

三白草水提液抗肠道病毒71型作用初探

目的：初步探讨三白草水提液抗肠道病毒71型（EV71）的活性及其机制。方法：采用EV71感染非洲绿猴肾上皮（Vero细胞）模型,以不同浓度的三白草水提液提前预处理细胞,结合MTT方法检测细胞活力,采用TCID50的方法检测子代病毒的释放,评价三白草水提物抗EV71病毒能力。应用Realtime PCR的方法检查三白草水提物对炎症因子产生的作用。以免疫印迹法检测三白草水提物对NF-κB信号通路的影响。利巴韦林为阳性对照。结果：三白草水提物0.1、0.03、0.015 mg/ml的浓度下能够显著抑制EV71感染诱导的细胞死亡,并且这种抑制作用具有剂量依赖性。与病毒组相比,三白草水提液在0.1、0.03以及0.015 mg/ml的浓度下分别将病毒滴度降低了1.60 logs、1.85 logs和3.45 logs。利巴韦林将病毒滴度降低了3.54 logs。Realtime PCR的结果显示,三白草水提液能够明显降低EV71诱导的IL-1β、IL-6以及IL-8 mRNA的表达。提取核蛋白,免疫印迹检测结果显示,三白草水提物能够阻断EV71诱导的NF-κB 核转移。结论：三白草水提液在体外具有抗EV71病毒复制的活性,并且可能通过抑制NF-κB 核转移抑制炎症因子的产生。     

Fungal endophytes in five medicinal plant species from Kudremukh Range, Western Ghats of India

Eighteen species of endophytic fungi were isolated from bark, stem and leaf segments of five medicinal plant species growing within the Kudremukh range in the Western Ghats of India. The dominant endophytic fungal species isolated from these plant species were Curvularia clavata, C. lunata, C. pallescens and Fusarium oxysporum. The highest species richness as well as frequency of colonization of endophytic fungi was found in the leaf segments, rather than the stem and bark segments, of the host plant species. The greatest number of endophytic fungal species were found within Callicarpa tomentosa (11 species), whereas Lobelia nicotinifolia harbored the lowest number of fungal endophytes (5 species). This study provides evidence that fungal endophytes are host and tissue specific.     

Endophytic fungi with antitumor activities: Their occurrence and anticancer compounds

Abstract

Plant endophytic fungi have been recognized as an important and novel resource of natural bioactive products, especially in anticancer application. This review mainly deals with the research progress on the production of anticancer compounds by endophytic fungi between 1990 and 2013. Anticancer activity is generally associated with the cytotoxicity of the compounds present in the endophytic fungi. All strains of endophytes producing antitumor chemicals were classified taxonomically and the genera of Pestalotiopsis and Aspergillus as well as the taxol producing endophytes were focused on. Classification of endophytic fungi producing antitumor compounds has received more attention from mycologists, and it can also lead to the discovery of novel compounds with antitumor activity due to phylogenetic relationships. In this review, the structures of the anticancer compounds isolated from the newly reported endophytes between 2010 and 2013 are discussed including strategies for the efficient production of the desired compounds. The purpose of this review is to provide new directions in endophytic fungi research including integrated information relating to its anticancer compounds.     

熟地黄水提液对小鼠单核细胞分泌TNF-α的影响

为研究熟地黄水提液对Balb／C小鼠的抗肿瘤活性,用L929生物法研究熟地黄水提液刺激Balb／C小鼠单核细胞分泌TNF-α的作用。结果表明,熟地黄组单核细胞分泌TNF-α活性与对照组相比有显著性差异（P〈0．05）,提示熟地黄水提液具有抗肿瘤活性。