大鼠睾丸支持细胞的分离、鉴定与培养

背景与目的:分离培养高纯度的大鼠睾丸支持细胞.材料与方法:选用SD雄性大鼠(18～21 d),处死取出睾丸,采用0.25%胰蛋白酶、0.05%胶原酶二步酶消化法结合低速离心分离支持细胞,置于35℃,5%CO2的培养箱培养,48 h后用20 mmol/LTris-HC1低渗处理培养细胞.0.25%胰蛋白酶消化后二次贴壁培养,用油红0染色和透射电镜观察对所培养的支持细胞进行鉴定,并用MTT法绘制细胞生长曲线.结果:分离培养的支持细胞纯度达95%,体外培养的对数生长期为4～9 d. 结论:采用二步酶消化法与低速离心及低渗处理法分离培养的支持细胞纯度高,用油红0染色鉴定支持细胞是一种简便快速的方法.     

宫腔镜检查致子宫内膜癌细胞脱落因素及脱落癌细胞活性分析

目的 探讨宫腔镜检查影响子宫内膜癌细胞脱落的因素,并进一步鉴定脱落的内膜癌细胞是否具有活性.方法 对29例子宫内膜癌患者手术的离体子宫行宫腔镜检查,在100mmHg膨宫压力下收集宫腔灌流液,进行细胞学检查并对灌流液阳性的细胞进行培养,同时取官腔原位癌灶行细胞培养作为对照.结果 29例宫腔灌流液中内膜癌细胞阳性11例(3...     

人卵巢癌组织肿瘤干细胞的分离和鉴定

目的 从人卵巢癌组织中分离并鉴定卵巢癌干细胞.方法 取新鲜卵巢癌组织,以胶原酶和透明质酸酶充分消化,获得单细胞悬液,经红细胞裂解液处理,CD133磁珠孵育进行磁性细胞分选,流式细胞仪验证分选效率.将阳性细胞置于含人表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、牛血清白蛋白和人胰岛素的无血清培养基中,待细胞成球状生长后进行免疫荧光、分化实验和成瘤实验,鉴定其干细胞特性.结果 从人卵巢癌组织中成功分离出肿瘤干细胞,流式细胞仪检测其CD133的表达率为82.5％.该细胞在无血清培养基中呈悬浮球状生长,具有自我更新能力、分化潜能和更强的致瘤能力,具备干细胞特性.结论 人卵巢癌组织中存在卵巢癌干细胞,利用CD133磁珠分选得到的肿瘤干细胞具备干细胞的相关特性,可用于后续卵巢癌干细胞生物学特性的研究.     

胃癌相关幽门螺杆菌与宿主细胞作用机制的研究

目的:鉴定幽门螺杆菌(Hp)与宿主细胞人类胃上皮细胞(AGS)作用后差异蛋白的改变.方法:应用双向电泳分离菌株26695与AGS细胞相互作用前后的蛋白,应用Image Master 2Dv3.1软件对蛋白图谱进行比较,对目的蛋白进行基质辅助激光解析及电离飞行时间质谱分析,应用Mascot软件进行蛋白搜库.结果:共监测到5个差异蛋白斑点,经质谱分析鉴定为2种蛋白,分别是热体克蛋白60和烷基过氧化还原酶.结论:烷基过氧化还原酶可能进入AGS细胞或结合于AGS细胞膜上,有助于明确Hp与宿主细胞相互作用后的致病过程.     

小鼠光气染毒对肺脏细胞的凋亡作用

背景与目的:小鼠原代肺Ⅱ型细胞的分离、培养方法的建立,探讨光气对肺水肿小鼠的肺脏细胞凋亡的诱导作用.材料与方法:12只二级BALB/c小鼠,雄性,随机分为2组:正常对照组(6只)和染毒组(6只).正常对照组小鼠以空气为对照,染毒组小鼠给予11.9 mg/L剂量的光气,时间为5 min.染毒后4 h,分离、培养肺Ⅱ型细胞,电镜观察两组小鼠肺Ⅱ型细胞、肺Ⅰ型细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和纤毛细胞凋亡情况.结果:单宁酸染色和电镜鉴定培养细胞为小鼠原代肺Ⅱ型细胞;小鼠给予11.9 mg/L的光气染毒5 min,电镜显示光气染毒肺水肿小鼠原代肺Ⅱ型细胞出现凋亡小体,肺Ⅱ型细胞核染色质呈现月牙型,嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和纤毛细胞均出现凋亡征象.结论:建立了小鼠原代肺Ⅱ型细胞的分离、培养方法,证明光气染毒可造成肺水肿小鼠肺脏细胞发生凋亡.     

横纹肌细胞培养液对S-180细胞生长抑制作用的体外实验研究

目的:观察横纹肌细胞微环境对肿瘤细胞生长的影响,探讨横纹肌内转移瘤罕见这一现象的发生机制.方法:采用酶解法原代培养新生Wistar大鼠心肌细胞和骨骼肌细胞,形态学和免疫酶染色方法检测横纹肌α-肌动蛋白进行细胞鉴定,免疫酶染色法进行细胞纯度鉴定,MTT法分析比较骨骼肌和心肌细胞细胞培养液对S-180细胞和正常肾小球系膜细胞的体外生长抑制作用,并运用胰酶消化法,热灭活法初步探讨横纹肌细胞培养液中抑瘤物质的理化性质.结果:S-180细胞与CMCM、MMCM共同培养后,细胞存活率明显下降,与DMEM相比差异均具有显著性(P<0.05),MCs细胞的细胞存活率无明显影响(P>0.05).DDP对S-180细胞和MCs细胞均具有显著性抑制作用(P<0.05).心肌细胞培养液和骨骼肌细胞培养液经胰酶消化后抑制活性仍然存在(P<0.05),经热灭活后活性消失(P>0.05).结论:新生大鼠横纹肌细胞培养液对S-180细胞的增殖有明显的抑制作用;而对正常细胞的增殖无明显影响,与顺铂的抑制作用明显不同.横纹肌细胞培养液中有可能存在一种抑瘤物质,可能是横纹肌转移瘤罕见的关键因素.     

口腔鳞状细胞癌中肿瘤干细胞分离和鉴定的方法研究进展

摘 要：口腔鳞状细胞癌是最常见的头颈部恶性肿瘤之一,复发率高,容易远处转移,对治疗不敏感,严重威胁人类健康。当前临床肿瘤免疫治疗不能有效清除缺乏分化抗原表位的肿瘤干细胞,需要灵敏而又特异的标记物来鉴定肿瘤干细胞。目前,从口腔鳞状细胞癌组织中分离肿瘤干细胞的方法主要有基于细胞表面标志的分离法和侧群细胞分离法。鉴定口腔鳞状细胞癌中肿瘤干细胞的方法包括体外细胞成球实验和体内致瘤能力的鉴定。对口腔鳞状细胞癌中肿瘤干细胞分离和鉴定方法的研究将为研发抗肿瘤干细胞疫苗提供理论基础和实验依据,从而为口腔鳞状细胞癌患者开辟新的免疫治疗途径。     

一种经济高效的人外周血NK细胞纯化方法的建立

目的:建立一种经济并且纯化率高的人外周血NK细胞分离方法.方法:对用RosetteSepR法直接从全血分离NK细胞的方法进行改进,先从全血中获得单个核细胞(PBMC),与红细胞按比例混合后再进行分离,利用流式细胞仪检测纯度,并且用CCK-8法检测NK细胞对K562细胞的杀伤活性.结果:改进后分离每毫升血所需RosetteSep抗体复合物用量仅为直接分离法的1/50;NK细胞的纯度由纯化前的(11.02±3.15)%提高到(96.52±2.42)%,细胞回收率为(70.24±10.51)%;纯化的NK对靶细胞K562有较强的杀伤作用,与直接分离法比较杀伤活性差异无统计学意义(P＞0.05).结论:改进后的方法可以获得高纯度的NK细胞,该分离方法不影响NK的杀伤活性,同时极大的降低了分离成本.初步建立了一种经济高效,快速简便,并且纯化率高的人外周血NK细胞纯化方法.     

树突状细胞的体外扩增和抗肿瘤免疫

树突状细胞 (DC)是体内最重要的抗原提呈细胞 ,具有独特的免疫学功能。综述了DC分离、体外扩增、鉴定和功能检测方法的研究现状 ,分析了DC与肿瘤免疫的关系 ,以及DC抗肿瘤治疗的应用前景     

人子宫肌瘤细胞分离培养及其体外雌孕激素受体的表达

目的:探讨一种短时间内在体外获得大量子宫肌瘤细胞的方法,并对其进行生物学特性鉴定.方法:应用胶原酶消化法分离获得人子宫肌瘤细胞,体外培养扩增,免疫组织化学法对肌瘤细胞进行鉴定,并比较雌孕激素受体(estrogen receptor,ER;progesterone receptor,PR)在体外培养的肌瘤细胞、肌瘤组织及正常平滑肌组织中的表达情况.结果:应用胶原酶消化法体外分离培养并获得大量的纯度较高的子宫肌瘤细胞;镜下观察,体外培养生长良好的子宫肌瘤细胞呈梭形或不规则三角形,呈放射状或旋涡状生长;RT-PCR结果显示,与同源子宫肌瘤组织相比(ER0.91±0.30;PR 0.60±0.11),培养4代的肌瘤细胞ER(0.92±0.24),PR(0.62±0.14)的表达水平无显著差异(P＞0.05),而与正常平滑肌组织(ER 0.64±0.31;PR 0.46±0.16)相比则有显著提高,P＜0.05.结论:成功建立人子宫肌瘤细胞有限细胞系,且在体外培养的子宫肌瘤细胞和人体内肌瘤细胞相似的生物活性,为子宫肌瘤的研究提供了快速有效地实验模型.     

A-NK细胞抗肝癌Walker256瘤株的实验研究

目的:观察A-NK细胞的体外生长与增殖,以及杀伤肿瘤细胞的能力,研究A-NK细胞局部注射的体内抗肿瘤作用。方法:用淋巴细胞分离液分离单个核细胞(PBMC),培养LAK细胞和A-NK细胞,分别将LAK细胞、A-NK细胞和Walker-256瘤株细胞接种于培养板中,培养24h后,用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法测定吸光度,计算肿瘤杀伤率。复制鼠肝癌模型,分别将LAK、A-NK细胞经肝动脉注入鼠肝癌模型中,观察两组动物的生存时间。结果:A-NK细胞的增殖明显快于LAK细胞(P<0.05),A-NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性比LAK细胞强(P<0.01),A-NK细胞能显著延长肝癌动物模型的生存期,与LAK细胞比较,具有显著性差异(P<0.01)。结论:A-NK细胞具有增殖快,抗瘤活性强,在体内能抑制肿瘤生长,延长荷瘤动物的生存期。     

TGF-b1差异性调控HSCs不同亚型

作为成体干细胞,造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)因具有成熟的研究体系以及较为清晰的分化发育途径而成为干细胞研究的典范。HSCs通过分化发育及自我更新维持着整个造血系统的平衡,其研究的难点在于体内数量较少以及表型鉴定困难。随着新技术方法的涌现,尤其是单细胞功能实验的引入,人们对HSCs的生物学功能有了更深入的了解,HSCs异质性便是其中较为突出的一点。在进行单细胞功能实验时,人们发现不同的HSCs向淋系及髓系发育的潜能具有差异,这就是HSCs功能的异质性,由此带来的HSCs亚型的研究成为HSCs研究热点之一。     

膀胱癌来源的外泌体通过促进髓系抑制性细胞的扩增介导毒性T细胞的免疫抑制

目的:探究膀胱癌细胞系MB49来源的外泌体(MB49-Exo)对髓系来源的抑制性细胞(MDSCs)的影响及后者对MB49抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫功能的调控.方法:试剂盒分离MB49-Exo,并应用透射电子显微镜(TEM)观察外泌体形态,纳米粒径颗粒跟踪分析仪(NTA)和Western blot进行鉴定...     

横纹肌细胞培养液对鼻咽癌CNE2细胞生长抑制作用的实验研究

目的:通过研究横纹肌细胞(心肌和骨骼肌)培养液对人鼻咽癌细胞(CNE2)增殖的影响来观察横纹肌细胞微环境对肿瘤细胞生长的影响,探讨横纹肌内罕见转移瘤这一现象的发生机制.方法:采用酶解法原代培养新生Wistar大鼠心肌细胞和骨骼肌细胞,根据取材部位、形态学和免疫酶染色方法检测横纹肌α-肌动蛋白进行细胞鉴定,采用免疫酶染色方法进行细胞纯度鉴定.原代培养的细胞达对数生长期后更换新鲜培养液,继续培养24小时后取上清液,用MTT法分析骨骼肌和心肌细胞培养液对CNE2的体外生长抑制作用.以顺铂为阳性对照,以DMEM为空白对照,同时以鼠正常肾小球系膜细胞(MCs)为CNE2的阴性对照,观察心肌细胞培养液、骨骼肌细胞培养液和顺铂对CNE2细胞增殖的作用.采用胰酶消化法,热灭活法初步探讨横纹肌细胞培养液的理化性质.结果:CNE2与CMCM、MMCM共同培养后,细胞存活率明显下降,与DMEM相比差异均具有显著性(P<0.05),而MCs细胞存活率无明显影响(P>0.05).DDP对CNE2和MCs细胞均具有显著性抑制作用(P<0.05).心肌细胞培养液和骨骼肌细胞培养液经胰酶消化后活性仍然存在(P<0.05),而经热灭活后活性消失(P>0.05).结论:新生大鼠横纹肌细胞培养液对鼻咽癌细胞增殖有明显的抑制作用;而对正常细胞增殖无明显影响,与顺铂的抑制作用明显不同;由此推测横纹肌细胞培养液中有可能存在一种抑瘤物质,这可能是横纹肌罕见转移瘤的关键因素.     

CIK、DC-CIK细胞抗鼻咽癌CNE2细胞的作用比较

目的:研究细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)与树突状细胞(DC)共培养后DC-CIK细胞抗鼻咽癌CNE2细胞的作用.方法:正常人外周血单个核细胞诱导DC和CIK细胞,加入CNE2细胞冻融液,将DC与CIK共培养,以CIK细胞单独培养为对照.用MTT法测定杀伤活性.结果:DC-CIK细胞杀伤鼻咽癌细胞活性高于CIK细胞(P<0.05).结论:DC-CIK细胞抗鼻咽癌CNE2细胞的作用显著,为DC-CIK细胞免疫治疗提供了实验和理论依据.     

肺癌患者外周血树突状细胞的体外扩增及鉴定

目的 探索体外扩增成熟树突状细胞(dendritic cell，DC)的方法，并进一步鉴定Dc的形态及表型，为开展肿瘤临床生物治疗奠定基础。方法 取肺癌患者外周血，经淋巴细胞分离液分离得到DC前体细胞，加入生长因子DCGF诱导DC生成，并加入自体肿瘤相关抗原刺激。收集细胞用透射电镜观察，并用流式细胞仪测定细胞表型。结果 应用该法扩增细胞可以得到大量成熟DC。电镜观察DC具有典型的形态。流式细胞仪细胞表型测定CD80为81．8％，HLA—DR为98．3％，CD86为69．8%，CDla为19．7％，CD14为66．9．1％，CD80和HLA-DR较未成熟DC的表达明显增加。结论 肺癌患者外周血体外培养可成功地获得成熟的DC，进一步为肿瘤临床生物治疗奠定了基础。     

冻存外周血干细胞扩增CIK细胞及其体外的抗肿瘤效应

目的:探讨患者冻存外周血干细胞体外诱导CIK细胞的增殖能力、表型特征及其对B细胞淋巴瘤细胞系的杀伤效应.方法:复苏患者冻存外周血干细胞悬液,Ficoll密度梯度方法分离单个核细胞及从健康人新鲜外周血分离单个核细胞,经IFNr、IL-2、CD3McAb诱导培养获得CIK:细胞.细胞计数板观察CIK细胞增殖能力;流式细胞术检测CIK的表型;以CFSE标记靶细胞区分效应细胞,PI染色,FACS检测靶细胞死亡率.结果:患者冻存外周血干细胞来源的CIK细胞较健康人增殖速度慢,最大增殖倍数低,但CD3+CD56+细胞比例与健康人差异无统计学意义,分别为(16.14±8.49)%和(17.52±3.30)%,P=0.744.患者及健康人CIK细胞与相应的诱导培养前单个核细胞相比,杀伤活性明显增强,在效靶比10:1时患者及健康人CIK细胞对Daudi细胞的杀伤活性为(29.23±8.85)%、(20.13±2.36)%,与培养前相比P值分别为0.004、0.001;患者CIK细胞杀伤活性强于健康人,P=0.05.结论:患者冻存外周血干细胞可以诱导生成具有抗肿瘤活性的CIK细胞,为其临床应用提供了实验依据.     

宫颈癌患者外周血树突状细胞的体外扩增和鉴定

 目的 探索体外扩增宫颈癌患者外周血来源的成熟树突状细胞(denelritic cell，DC)的方法，并鉴定DC的形态、结构、表型及生物学活性。方法 淋巴细胞分离液分离宫颈癌患者外周血，得到DC前体细胞(PBMC)，以(3M-CSF、IL-4、TNF-α诱导培养。用光镜和透射电镜观察形态结构，流式细胞仪检测细胞表面特异性分子，MTT法测定DC刺激T细胞增殖的活性。结果 联合应用细胞因子可诱导扩增出源自宫颈癌患者外周血的成熟DC，具有典型形态特征，较高表达HLA-DR、CD1a、CD80，能强烈激发同种异体T细胞增殖反应。结论 宫颈癌患者外周血体外培养可成功获得成熟的DC，为开展宫颈癌临床免疫治疗奠定了基础。     

ERCC1在鼻咽癌组织中的表达及其与顺铂化疗敏感性的关系

目的: 用自制的改良细胞冻存液冻存树突状细胞（dendritic cells,DCs）,观察冻存复苏后DCs的细胞存活率及体外诱导CIK(cytokine induced killer cell)对肿瘤细胞的杀伤作用。方法：从外周血分离、培养获得DCs,分别用3种冻存液冻存:（1）含10%二甲基亚砜(DMSO)、20%牛血清的RPMI 1640培养液;（2）日本ZENOAQ公司的Cellbanker细胞冻存液;（3）自制细胞冻存液（含DMSO、羟乙基淀粉及细胞稳定剂）。每组DCs分6管,于-80 ℃和-196 ℃各冻存3管,分别于冻存后第30、60和180 d复苏,用锥虫蓝染色法测定细胞存活率,用MTT法检测冻存复苏后DCs活化的CIK对K562细胞的杀伤活性。结果：每组3种冻存液冻存的DCs随着冻存时间的延长,冻存复苏DCs的存活率和活性均有轻度下降,但经统计学分析3种冻存液的冻存效果无明显差别。结论：自制的改良细胞冻存液能够替代传统冻存液和进口冻存液用于DCs的冻存,有良好的推广前景     

健康人和肝癌患者CIK体外增殖能力及对原代肝癌细胞抗肿瘤作用的比较研究

目的探讨源自健康人和肿瘤患者的细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)体外增殖能力及对原代肝癌细胞的抗肿瘤作用的差异,进一步了解CIK的抗肿瘤作用.方法分离健康人和肝癌患者外周血单个核细胞经细胞因子激活诱导培养为CIK,流式细胞分析检测CIK免疫表型;用机械研磨法将新鲜肝癌组织标本分离成单细胞悬液;四甲基偶氮唑盐法榆测两种CI...