磷酸化修饰对p53线粒体作用的影响以及与卵巢癌顺铂耐药的关系

目的探讨磷酸化修饰对p53直接线粒体转移的影响以及在顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡中的作用以及与卵巢癌顺铂耐药的关系。方法应用Western Blot检测顺铂作用前后卵巢癌顺铂敏感细胞OV2008、A2780s和顺铂耐药细胞C13＊、A2780cp的线粒体和细胞浆中Smac蛋白含量以及线粒体和全细胞中磷酸化p53（P-p53）的含量,并应用Hoechst染色法检测卵巢癌细胞的凋亡率。结果顺铂能引起卵巢癌敏感细胞OV2008、A2780s线粒体释放Smac至胞浆并引起细胞凋亡,但在C13＊和A2780cp中无此反应。顺铂处理后进入卵巢癌敏感细胞线粒体中的p53蛋白为磷酸化的p53。结论顺铂能引起p53转移至线粒体并导致卵巢癌敏感细胞线粒体释放Smac至胞浆,促进卵巢癌细胞的凋亡,并且磷酸化修饰作用可以影响p53的直接线粒体功能,与卵巢癌化疗耐药有关。     

应用XIAP siRNA逆转卵巢癌顺铂耐药性的研究

目的本研究旨在探讨应用siRNA下调XIAP在卵巢癌耐药细胞中的表达而逆转其对顺铂的耐药性。方法应用Western Blot、Hoechst 33258等检测卵巢癌顺铂敏感细胞株COC1和耐药株COC1／DDP中XIAP表达和卵巢癌细胞的凋亡率,并将XIAPsiRNA导入耐药细胞,比较转染前、后耐药细胞对顺铂耐药性的改变。结果卵巢癌耐药细胞COC1／DDP中XIAP蛋白表达明显比敏感细胞COC1中高（P〈0．05）。XIAP siRNA可下调耐药细胞COC1／DDP中XIAP的表达,并显著增加对顺铂敏感性（P〈0．05）。结论XIAP siRNA可在一定程度上逆转卵巢癌顺铂耐药。     

卵巢癌顺铂敏感与耐药细胞ClC-3蛋白表达及通道功能的差异

目的:从分子和细胞水平研究卵巢癌顺铂敏感(a2780)及耐药(a2780cp)细胞中ClC-3氯通道蛋白表达及通道功能的差异。方法:MTT法检测人卵巢癌a2780和a2780cp细胞对顺铂敏感性的差异;real-time PCR法检测ClC氯通道家族在a2780和a2780cp细胞中的mRNA表达;Western blot检测ClC-3蛋白的表达;免疫荧光法观察ClC-3蛋白在a2780和a2780cp细胞的分布;全细胞膜片钳技术记录细胞氯电流。结果:(1) a2780和a2780cp细胞对顺铂的敏感性存在差异,其IC_(50)值分别为5μmol/L和20μmol/L(P0.01);(2)对ClC氯通道家族mRNA表达的检测结果显示,a2780和a2780cp细胞主要表达ClC-3,且在a2780cp细胞中ClC-3 mRNA表达显著减少(P0.01);(3)在蛋白水平上,与a2780细胞相比,a2780cp细胞的ClC-3蛋白表达量显著降低(P0.01);(4)免疫荧光显示ClC-3在a2780细胞中主要分布在胞膜上,而在a2780cp细胞中则主要表达在胞质内;(5)顺铂能激活a2780细胞的氯通道,产生ClC-3介导的氯电流,但在a2780cp细胞中则不能;(6)ClC-3 siRNA处理a2780细胞后,顺铂诱导的氯电流则不再出现。结论:ClC-3氯通道在顺铂敏感和耐药的卵巢癌细胞蛋白分布、表达和功能上存在差异,可能是引起顺铂耐药的潜在机制之一。     

内源性IL-8诱导卵巢癌细胞对顺铂与紫杉醇产生耐药的机制研究

目的探讨内源性IL-8诱导卵巢癌细胞对顺铂和紫杉醇产生耐药的机制及相关信号转导通路。方法在原有工作基础上,以2种人卵巢癌细胞系A2780(不分泌IL-8,对顺铂、紫杉醇敏感)和SKOV-3(高分泌IL-8,对顺铂、紫杉醇耐药)为研究模型,分别将正义(sense,ss)IL-8基因或反义(antisense,as)IL-8基因稳定转染至A2780细胞或SKOV3细胞,应用MTT法、Caspase-3活性测定、RT-PCR及Western blot技术等观察内源性IL-8是否影响卵巢癌细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性,并对其作用的机制和可能的信号传导通路进行研究。结果 1)内源性过表达IL-8可诱导A2780细胞对顺铂和紫杉醇产生耐药,而抑制IL-8表达可恢复SKOV3细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性,IL-8诱导的卵巢癌细胞化疗耐药是通过降低Caspase-3活性来实现的;2)内源性过表达IL-8可上调A2780细胞的耐药相关基因MDR1和凋亡抑制基因Bcl-2、Bcl-xL及XIAP的表达,而抑制IL-8表达可使上述基因的表达明显降低;3)Wortmannin(PI3K抑制剂)和PD98059(MEK1/2抑制剂)能分别阻断IL-8诱导下卵巢癌细胞的Akt和ERK活化及化疗耐药作用。结论 IL-8诱导的卵巢癌细胞化疗耐药可能与其上调耐药相关基因MDR1和凋亡抑制基因Bcl-2、Bcl-xL及XIAP的表达以及活化Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt信号通路相关,提示调节IL-8表达或其相关信号通路可能是治疗耐药性卵巢癌的一种良好策略。     

外源性IL-8诱导卵巢癌细胞对顺铂和紫杉醇产生耐药的机制及相关信号转导通路的初步探讨

目的探讨外源性IL-8诱导卵巢癌细胞对顺铂和紫杉醇产生耐药的机制及相关信号转导通路。方法在原工作基础上,以两种人卵巢癌细胞系A2780(不分泌IL-8,对顺铂、紫杉醇敏感)和SKOV-3(高分泌IL-8,对顺铂、紫杉醇耐药)为研究模型,观察外源性IL-8是否影响卵巢癌细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性,并对其作用的机制和可能的信号转导通路进行研究。结果①体外经IL-8处理的A2780细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性均明显降低即产生部分耐药(耐药倍数分别为6.07和7.23),其耐药程度均低于IL-8高表达的SKOV-3细胞(耐药倍数分别为8.22和9.03)。②IL-8可以剂量依赖的方式上调A2780和SKOV-3细胞的耐药相关基因MDR1和凋亡抑制基因Bcl-2、Bcl-xL及XIAP的表达。③MEK1/2抑制剂和PI3K抑制剂均能阻断IL-8诱导的卵巢癌细胞对顺铂和紫杉醇产生的耐药。结论IL-8-很可能通过上调耐药相关基因MDR1和凋亡抑制基因Bcl-2、Bcl-xL及XIAP的表达而致卵巢癌细胞对顺铂和紫杉醇产生耐药。IL-8的上述作用是由Ras/Raf/MEK/MAPK和PI3K/Akt信号通路介导的。     

Snail在卵巢癌细胞侵袭转移潜能方面研究

目的研究Snail与卵巢癌侵袭转移问的关系,并探讨其分子机制。方法分别构建正义全长Snail真核表达载体和小分子干扰RNA,分别转染卵巢癌细胞系A2780、C13＊。采用Western印迹方法分析相关蛋白表达,Transwell试验检测细胞侵袭转移能力。结果①成功构建Snail正义全长真核表达载体,并合成Snail小分子RNA干扰片段;②在转染PEGFPCI／Snail的卵巢癌细胞株A2780、C13＊中E-eadhefin表达明显下调,Snail和Vimentin则表达上调;而在转染Snail／SiRNA的卵巢癌细胞株A2780、C13‘中E—cadherin表达明显上调,Snail和Vimentin则表达下调;③Snail过表达可显著促进卵巢癌细胞株A2780、C13＊的侵袭转移潜能;封闭Snail表达水平可一定水平抑制卵巢癌细胞株A2780、C13＊的侵袭转移潜能。结论snail可通过促进卵巢癌上皮细胞间质化转变（epithelial—mesenchymaltransition,EMT）而提高其侵袭转移能力;封闭Snail表达可一定程度逆转卵巢癌上皮细胞间质化转变（EMT）而抑制其侵袭转移能力。     

抑制氯通道CLCN2基因表达对顺铂诱导胶质瘤U251细胞损伤的影响

目的： 探讨使用特异性CLCN2反义寡核苷酸抑制CLCN2基因表达对顺铂诱导的神经胶质瘤U251细胞损伤的影响。方法：U251细胞按处理方法不同分4组,对照组（转染无义寡核苷酸）、转染CLCN2反义寡核苷酸组、顺铂组（无义寡核苷酸与顺铂联用）、CLCN2反义寡核苷酸与顺铂联用组。应用MTT法检测U251细胞生存率;RT-PCR检测CLCN2、cyclinD1 mRNA表达;TUNEL法检测细胞凋亡率。结果：与对照组相比,转染CLCN2反义寡核苷酸组、顺铂组和CLCN2反义寡核苷酸与顺铂联用组U251细胞生存率、CLCN2 mRNA表达降低,凋亡细胞数增加;与顺铂组相比,CLCN2反义寡核苷酸与顺铂联用组细胞生存率（P＜0.05）、CLCN2、cyclinD1 mRNA表达降低,凋亡细胞数增加（P＜0.01）;与CLCN2反义寡核苷酸组相比,CLCN2反义寡核苷酸与顺铂联用组CLCN2 mRNA表达明显降低（P＜0.01）。结论：①转染CLCN2反义寡核苷酸能有效抑制CLCN2 mRNA表达;②抑制CLCN2 mRNA表达能促进顺铂对U251细胞的损伤作用;③CLCN2基因表达降低参与顺铂对U251细胞损伤作用。     

飞燕草素调节Numb/Notch信号通路诱导卵巢癌细胞凋亡

目的 探讨飞燕草素调节Numb/Notch信号通路诱导卵巢癌细胞A2780凋亡的作用机制。方法 使用顺铂（500μmoL/mL）和低剂量（500μmoL/mL）、高剂量（1000μmoL/mL）飞燕草素处理卵巢癌细胞A2780，同时设立卵巢癌细胞A2780对照组，各组设6个平行样，培养72 h后。实验结束后，采用CCK-8试剂盒测定各组细胞增殖水平，流式细胞术检测细胞凋亡率，Transwell法测定细胞侵袭水平，划痕实验检测细胞迁移水平，实时荧光定量（RT-qPCR）及蛋白印记法（West-blot）检测细胞Numb、Notch1 m RNA和蛋白表达水平。结果 与A2780细胞组比较，顺铂组、飞燕草素低、高剂量组A值、存活率、穿膜数、迁移距离、Notch1 m RNA和蛋白表达降低（P<0.05）；与顺铂组比较，飞燕草素低剂量组A值、存活率、穿膜数、迁移距离、Notch1 m RNA和蛋白表达升高（P<0.05），高剂量组A值、存活率、穿膜数、迁移距离、Notch1 m RNA和蛋白表达无明显变化（P>0.05）；与飞燕草素低剂量组比较，飞燕草素高剂量组A值、存活率...     

卵巢癌细胞IL-6、IL-8分泌与其化疗敏感性及耐药相关基因和凋亡抑制基因表达关系的初步探讨

目的 分析比较4种常见的人E皮性卵巢癌细胞系IL-6、IL-8分泌与其化疗敏感性及部分耐药相关基因和凋亡抑制基因表达的关系,为今后研究IL-6、IL-8诱导卵巢癌细胞对化疗药物产生耐药的机制奠定基础.方法 IL-6、IL-8及其受体的表达采用RT-PCR、ELISA及免疫印迹技术进行检测,卵巢癌细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性采用M1Tr试验进行分析,耐药相关基因和凋亡抑制基因的表达则采用RT-PCR进行测定.结果 1)4种卵巢癌细胞除A2780细胞外均组成性分泌IL-6和IL-8,二者转录水平与其蛋白水平基本一致.2)4种卵巢癌细胞均表达IL-6受体和IL-8受体.3)4种卵巢癌细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性不同,其中A2780细胞最敏感,ES-2细胞次之,CAOV-3和SKOV-3细胞则有不同程度的耐药性.4)部分耐药相关基因和凋亡抑制基因在A2780和ES-2细胞中的表达水平均较低,而在CAOV-3和SKOV-3细胞中的表达水平均较高.结论 卵巢癌细胞IL-6、IL-8的自分泌水平(尤其是IL-6的水平)与其对顺铂和紫杉醇的敏感性基本呈负相关趋势,与其部分耐药相关基因和凋亡抑制基因的表达水平相一致.     

丙型肝炎病毒核心蛋白转染HepG2细胞对其p53表达的影响

目的 研究丙型肝炎病毒核心蛋白（HCV—core protein，HCV—C）对HepG2细胞周期、细胞凋亡和n53蛋白表达的影响。方法 表达HCV—C的真核表达质粒pcDNA3.1-core，通过Lipofectamine基因转染法转染HepG2细胞，经G418筛选获得稳定转染HepG2细胞，经Westem Blot证实HCV核心蛋白阳性表达。利用四甲基偶氮唑蓝比色（MTT）法，平板克隆实验和流式细胞术，蛋白印迹和免疫细胞化学法检测HCV核心蛋白对细胞生长增殖率、细胞周期、细胞凋亡率和p53蛋白表达的影响。结果 HCV—C转染组细胞增殖率显著高于空白质粒转染组和未转染组；HCV—C转染组细胞S期所占百分率高于未转染组；HCV-C转染组细胞凋亡率显著低于未转染组；HCV—C转染组细胞突变型p53蛋白的表达高于空白质粒转染组和未转染组。结论 HCV核心蛋白可能通过促进突变型p53蛋白的表达，促进HepG2从G0／1期进入S期，促进细胞生长增殖，抑制细胞凋亡。     

凋亡抑制蛋白XIAP和促凋亡因子Smac在胰腺癌化疗抵抗中的作用

目的探讨x-相关凋亡抑制蛋白（XIAP）和促凋亡因子Smac在胰腺癌细胞化疗抵抗中的作用，以及转染胞浆表达型Smac基因靶向下凋XIAP对化疗药物诱导的胰腺癌细胞凋亡的影响。方法应用流式细胞术检测顺铂、5-FU介导的Panc-1、BXPC-3的凋亡率及胞浆染色分析细胞XIAP表达变化，Western blot分析XIAP、Smac、Caspase-3表达水平；构建pEGFP-NI／Smac真核表达载体并转染胰腺癌Panc-1细胞，流式细胞术检测转染Smac基因前后Panc-1细胞的凋亡敏感性。结果与BXPC-3细胞相比，Panc-1对顺铂或5-FU介导的凋亡具有较强抵抗性，Western blot分析显示Panc-1细胞高表达XIAP，在化疗药物作用下化疗敏感细胞BXPC-3胞浆内XIAP水平下降明显多于Panc-1细胞，而且凋亡的BXPC-3细胞释放入胞浆内的成熟Smac蛋白水平明显高于Panc-1细胞。转染胞浆表达型Smac基因至化疗抵抗Panc-1细胞，可明显下调其XIAP表达水平，促进效应Caspase-3分子活化，显著提高顺铂、5-FU诱导的细胞凋亡率。结论胰腺癌细胞XIAP的表达水平下调与其化疗敏感性有关，XIAP是克服化疗抵抗的重要靶分子，而上调Smac活性蛋白的胞浆表达作为一种有效调节信号，通过拮抗XIAP的凋亡抑制作用协同化疗药物促进胰腺癌细胞凋亡。     

p53基因与顺铂联合作用对人卵巢癌细胞的杀伤效果

目的 :探讨外源性p5 3基因转染对人卵巢癌细胞系SKOV 3的生物学行为影响及与顺铂联合作用后对人卵巢癌细胞的杀伤效果。方法 :用脂质体介导的转染技术 ,将p5 3基因的真核细胞表达载体 (PcDNA p5 3)导入不表达p5 3的人卵巢癌SKOV 3细胞中 ,经G4 18筛选 ,Northernblot及Westernblot鉴定后 ,观察其对细胞生物学行为的影响及与顺铂联合作用后对细胞集落形成的影响。结果 :转染后获得稳定表达p5 3的转染克隆。外源性p5 3基因的表达明显抑制了卵巢癌细胞的生长及集落形成能力 ,使细胞阻滞于G1 期 ,并增加了卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。结论 :外源性野生型p5 3基因能抑制卵巢癌细胞的生长 ,与顺铂联合作用后增强了对人卵巢癌细胞的杀伤效果。     

Adenoviral-mediated transfer of p53 gene enhances TRAIL-induced apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells

p53 is a tumor suppressor protein with numerous biological functions including transformation, regulation of cell growth, differentiation and apoptosis. The TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) can induce apoptosis in various transformed cell lines. We investigated the effects of combining wild-type p53 gene transduction by adenoviral infection (Ad-p53) with addition of TRAIL on cell death, expression levels of TRAIL receptors (TRAIL-R1, TRAIL-R2), FLICE inhibitory protein (FLIP) and X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) on human hepatocellular carcinoma (HCC) cell lines. HCC cell death was increased by combination of Ad-p53 infection and addition of TRAIL compared to either alone. Western blotting demonstrated decreased TRAIL-R1 and TRAIL-R2 levels after infection with Ad-p53. FLIP levels decreased in Huh7 cells and Hep3B cells, and XIAP levels decreased in all three HCC cell lines after infection with Ad-p53. Thus, death of HCC cells due to combined p53 gene transduction and exogenous TRAIL may be due to down regulation of FLIP or XIAP.     

脂质体介导的p53基因对肝癌细胞生长的抑制作用

目的 观察外源野生型ｐ５３基因在肝癌基因治疗方面的可行性。方法 将载有人野生型ｐ５３－ｃＤＮＡ的真核表达质粒ｐ５３－ｐｃＤＮＡ３,用阳离子脂质体介导转染人肝癌细胞系ＨｅｐＧ２,用流式细胞仪检测ｐ５３－ｐｃＤＮＡ３对ＨｅｐＧ２细胞生长的影响。结果 通过观察细胞生长曲线与流式细胞仪检测细胞周期和细胞的凋亡指数发现,ＨｅｐＧ２细胞生长受到明显的抑制。结论 脂质体介导的ｐ５３基因可在Ｈ细胞中表达,且明显抑     

MiR-515-5p通过调控硫酸软骨素蛋白聚糖4表达对卵巢癌A2780细胞增殖和转移的影响及其机制

目的 探讨miR-515-5p对硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)的靶向调控作用,以及对卵巢癌细胞系A2780细胞增殖和转移的影响.方法 通过生物信息学工具预测miR-515-5p的靶基因.Real-time PCR和Western blotting法检测65例卵巢癌组织和与其对应的癌旁组织中miR-515-5p和CS...     

p53-independent induction of apoptosis by the HTLV-I tax protein following UV irradiation

Human T cell leukemia virus type 1 (HTLV-1) encodes a transforming protein, Tax. Tax is a promiscuous viral transactivator involved in both cell growth and death control. We have previously shown that Tax sensitizes cells to apoptosis induced by DNA-damaging agents and this report further characterizes the Tax-mediated apoptosis pathway. We found that Tax-mediated apoptosis in response to UV irradiation was inhibited by Bcl-2 and Bcl-X(L) overexpression and by treatment with the caspase inhibitor z-VAd-FMK. Since Tax has been shown to functionally inactivate the apoptosis regulator p53, the effect of Tax on apoptosis in the absence of p53 was examined. In these studies, Tax sensitized p53-negative cells to apoptose, suggesting that Tax can mediate a p53-independent form of apoptosis. In addition, cells expressing both Tax and p53 displayed higher levels of apoptosis than cells expressing either protein alone, suggesting that the apoptosis-inducing activities of Tax and p53 are not completely overlapping. These observations demonstrate that Tax can utilize a p53-independent mechanism to induce apoptotic cell death following UV irradiation.     

Hepatocellular cancer cell lines,Hep-3B and Hep-G2 display the pleiotropic response to resveratrol and berberine

PurposeHuman carcinoma cells with different p53 status exposed to a combination of bioactive substances, resveratrol and berberine, revealed different responses in cell viability via p53-dependant apoptosis pathway activation.Materials and methodsUsing 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) assay, we investigated various and opposing effects in hepatocellular carcinoma cells, Hep-G2 and Hep-3B with different p53-status.ResultsCells decreased in viability after treatment with dose-dependent concentrations of resveratrol and berberine. Hep-3B p53 mutants were more sensitive in comparison to the p53 wild type Hep-G2 cell line. A synergistic effect was observed after treatment of Hep-3B cells with a combination of resveratrol/berberine ratios in favor of resveratrol (2:1, 3:1). The results suggest that an effective concentration of berberine, in the presence of resveratrol, could be decreased even to 50% (half the IC₅₀ for berberine) in cancer treatment. Combined treatment with berberine and resveratrol, at the investigated concentrations and fractions, significantly reduces the viability of wild type p53 Hep-G2 and null p53-mutant Hep-3B cells by 20% and 40%, respectively.ConclusionsStronger toxic effects on viability and proliferation were observed in Hep-3B cells what is consistent with the assumptions that null p53-mutants activate apoptosis canonical pathway. In conclusion, p53 status in human hepatocellular cancer cell lines modulates responses to plant-derived therapies.