丙肝病毒（HCV）及乙肝病毒（HBV）双表达栽体的构建及表达

目的：为探索HCV/HBV高效联合基因免疫策略，构建具有2套独立表达单元的HCV/HBV真核表达载体。方法：分别将与HCV核心区基因互CDNA和HBC核心区基因克隆于具有2套独立表达单元的真核表达载体pRSC的巨细胞病毒启动子和RSV启动子下游，称为PRSC-HBV/HCV，转染SP2/0细胞，通过免疫荧光和Western印迹法观测蛋白的表达，免疫Balb/c小鼠，用酶联免疫小鼠体液免疫应答。结果：PRSC-HBV/HCV转染SP2/0细胞可见HBCAG及HCV核蛋白染色阳性荧光细胞，SDS-Page电泳显示在14KD及21KD处均可见蛋白条带，与HBCAG及HCV核蛋白的理论预期值一致，Western印迹分析显示在14KD及21KD处可见特异性的蛋白条带。5只免疫鼠中全部 出现抗-HCV及抗-HBV抗体，而对照组全阴性。结论：PRSC-HBV/HCV可分别表达HBCAG与HCV核蛋白，免疫Balb/c小鼠后诱导其体液免疫应答，为进一步开展HCV/HBV联合基因免疫尊定了实验基础。     

丙肝病毒(HCV)及乙肝病毒(HBV)双表达载体的构建及表达

目的 :为探索HCV/HBV高效联合基因免疫策略 ,构建具有 2套独立表达单元的HCV/HBV真核表达载体。方法 :分别将与HCV核心区基因互补的cDNA和HBV核心区基因克隆于具有 2套独立表达单元的真核表达载体pRSC的巨细胞病毒启动子和RSV启动子下游 ,称为pRSC HBV/HCV ,转染SP2 / 0细胞 ,通过免疫荧光和Western印迹法观测蛋白的表达 ,免疫Balb/c小鼠 ,用酶联免疫小鼠体液免疫应答。结果 :pRSC HBV/HCV转染SP2 / 0细胞可见HBcAg及HCV核蛋白染色阳性荧光细胞 ,SDS Page电泳显示在 14kD及 2 1kD处均可见蛋白条带 ,与HBcAg及HCV核蛋白的的理论预期值一致 ,Western印迹分析显示在 14kD及 2 1kD处可见特异性的蛋白条带。 5只免疫鼠中全部出现抗 HCV及抗 HBV抗体 ,而对照组全阴性。结论 :pRSC HBV/HCV可分别表达HBcAg及HCV核蛋白 ,免疫Balb/c小鼠后可诱导其体液免疫应答 ,为进一步开展HCV/HBV联合基因免疫奠定了实验基础。     

HCV复合多表位抗原基因的克隆表达及其免疫学特性分析

目的构建丙型肝病炎病毒（HCV）截短C基因和多表位基因重组原核表达质粒，表达纯化融合蛋白，分析其免疫原性和抗原性。方法PCR方法扩增核心区羧基端部分缺失的基因片段Ct；合成HCVE2区模拟表位与NS3～NS57个表位基因Em；分别将Ct、Em克隆人原核表达质粒pQE30，筛选阳性重组质粒pQE30-CtEm，转化E．coli M15，IPTG诱导融合蛋白表达，薄层扫描分析表达蛋白；可溶性分析后用Ni^2＋-NTA凝胶亲和层析柱纯化、透析并浓缩融合蛋白；Westernblot分析纯化蛋白的特异性和抗原性；纯蛋白免疫小鼠后分析其免疫原性。结果成功构建了HCV复合多表位抗原基因的原核表达质粒pQE30-CtEm，目的基因可高效表达，表达产物主要以包涵体形式存在，Ni^2＋-NTA纯化可获得目的蛋白，纯化蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。结论HCV复合多表位抗原基因融合蛋白可高效表达并得到纯化，该融合蛋白可作为HCV诊断抗原，也为丙型肝炎新型疫苗的研究提供了靶抗原。     

丙型肝炎病毒核心蛋白转染HepG2细胞对其p53表达的影响

目的 研究丙型肝炎病毒核心蛋白（HCV—core protein，HCV—C）对HepG2细胞周期、细胞凋亡和n53蛋白表达的影响。方法 表达HCV—C的真核表达质粒pcDNA3.1-core，通过Lipofectamine基因转染法转染HepG2细胞，经G418筛选获得稳定转染HepG2细胞，经Westem Blot证实HCV核心蛋白阳性表达。利用四甲基偶氮唑蓝比色（MTT）法，平板克隆实验和流式细胞术，蛋白印迹和免疫细胞化学法检测HCV核心蛋白对细胞生长增殖率、细胞周期、细胞凋亡率和p53蛋白表达的影响。结果 HCV—C转染组细胞增殖率显著高于空白质粒转染组和未转染组；HCV—C转染组细胞S期所占百分率高于未转染组；HCV-C转染组细胞凋亡率显著低于未转染组；HCV—C转染组细胞突变型p53蛋白的表达高于空白质粒转染组和未转染组。结论 HCV核心蛋白可能通过促进突变型p53蛋白的表达，促进HepG2从G0／1期进入S期，促进细胞生长增殖，抑制细胞凋亡。     

丙型肝炎病毒核心蛋白在HepG2细胞中的表达及其对端粒酶活性的影响

目的 建立HCV核心蛋白细胞表达模型，并探讨其对细胞端粒酶活性的影响。方法 用PCR法扩增出HCV核心基因cDNA，将其插入真核表达载体pBK-CMV的HindⅢ和BamHⅠ位点间，构建重组质粒pBK-HCVc。再将重组质粒pBK-HCVc和空载体分别导入肝癌细胞株HepG2中，G418筛选，RT－PCR、免疫组化和蛋白印迹鉴定HCV核心蛋白表达。PCR－ELISA法检测端粒酶活性。结果 构建的pBK-HCVc质粒在HepG2细胞中有稳定表达。表达HCV核心蛋白的细胞HepG2-C的端粒酶活性较转染空载体的细胞HepG2-CMV明显升高。结论 HCV核心蛋白上调了端粒酶活性，可能是HCV诱发肝细胞癌的一种途径。     

HCV核心蛋白在HepG2细胞中对COX-2表达的影响

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白是否影响环氧化酶-2(COX-2)的表达。方法用PCR从含HCVH77株全长基因组序列质粒中扩增HCV核心蛋白基因,并克隆至pcDNA3.1载体中,构建HCV核心蛋白基因的真核表达载体HCV-C/pcDNA3.1。用HCV-C/pcDNA3.1和含COX-2启动子的荧光素酶报告载体COX2pro1.5kb/luc瞬时共转染HepG2细胞,测定萤火虫荧光素酶的活性,并用Westernblot检测COX-2蛋白的表达水平。结果成功地构建了HCV-C/pcD-NA3.1重组质粒。瞬时转染后的HepG2细胞中,COX2启动子荧光素酶的活性显著增强。Westernblot检测,发现COX-2的表达明显升高。结论HCV核心蛋白在HepG2细胞中激活COX-2启动子,并且明显诱导COX-2的表达,为进一步研究COX-2与HCV致病性的关系提供了新的实验依据。     

丙型肝炎病毒E2包膜糖蛋白的研究进展

HCV E2包膜糖蛋白是HCV的结构蛋白之一，具有重要的受体结合位点和抗原表位，在病毒感染和宿主免疫过程中起着十分重要的作用，也是目前疫苗研究的热点。其分子和功能特性的研究对HCV作用机制及预防和治疗的研究有重要意义。近年来，该领域的研究取得一定进展。本文综述了E2蛋白在病毒的入胞作用，在机体的免疫应答及其在疫苗研制方面的作用。     

丙型肝炎病毒核心基因重组腺病毒的构建、鉴定与表达

目的构建HCV C基因重组腺病毒，以期用于HCV C蛋白的功能研究。方法以含有丙肝病毒1b亚型核心基因的质粒pcDNA3.1／HCV-C为模板，PCR扩增HCV C基因，PCR产物双酶切后亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上，与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组，获得重组腺病毒质粒pAd-C，PacⅠ酶切线性化后脂质体法转染293细胞进行包装，获得重组腺病毒Ad-C，继之在293细胞内扩增，利用报告基因GFP监测病毒滴度和感染效率，Western blot检测HCV C蛋白的表达。结果PCR及Western blot结果均证实重组腺病毒Ad-C构建成功。结论成功构建了重组腺病毒Ad-C，为进一步研究核心蛋白的生物学功能奠定了基础。     

HCV多表位抗原融合肽的表达与抗原性的研究

目的观察HCV复合多表位抗原融合肽的抗原性,探讨利用这种抗原融合肽制备的抗体在丙型肝炎抗原检测方面的潜在可行性。方法将人工合成的HCV复合多表位抗原基因B2克隆到表达载体pThioHis A中,并在大肠杆菌中表达融合蛋白(Trx-B2),纯化该蛋白后免疫小鼠及家兔,分析表达产物的免疫特异性及抗原性。结果融合蛋白(Trx-B2)能在原核表达系统中高效表达,并可诱发小鼠及家兔产生高滴度的特异性HCV抗体。结论偶联了融合蛋白的HCV复合多表位抗原具有良好的抗原性,其免疫实验动物后产生的抗体有望用于HCV的抗原检测。     

家蚕过敏原CSP5克隆表达、纯化鉴定及分析

克隆家蚕过敏原CSP5(chemosensory protein 5precursor)基因,表达、纯化该蛋白,鉴定其免疫活性,并进行生物信息学分析。人工合成家蚕化学感受蛋白5前体CSP5基因,将其连接至pMD18-T克隆载体,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后进行纯化,用western blotting和ELISA鉴定其免疫学特性,并采用生物信息学方法预测CSP5蛋白的理化性质、三级结构、潜在B细胞抗原表位。本研究成功克隆了纯度较高的重组CSP5蛋白,测序鉴定蛋白分子质量约为14.25kD。重组过敏原CSP5能与家蚕过敏患者血清IgE发生特异性结合。生物信息学方法推导其潜在B细胞抗原表位为17~22、35~36、51~55、70~74、106~110、112~115。获得的重组蛋白CSP5具有与天然蛋白相似的免疫学活性,为以标准化抗原作为临床特异性诊断和治疗以及由家蚕引起的过敏性疾病的进一步研究奠定了基础。     

HCV核心蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫学特性研究

目的 研究HCV核心蛋白在大肠杆菌中的非融合表达及重组蛋白的免疫学特性。方法 用DNA重组技术在两种表达质粒（pQE3O和pTrcHisA）、4种宿主菌（DH5a,TOP10,BL21和M15）中表达HCV全长及羟基端部分缺失的核心蛋白（aal～191,aal～154和aal～69）,表达蛋白经SDSF-PAGE检测,免疫印亦分析,亲和层析法纯化后免疫BALB/C小鼠,ELISA法检测免疫小鼠血清中抗HCV抗体水平。结果 HCV核心蛋白C154,C191在pQE30/M15中获得了表达,表达量分别占菌体总蛋白的18.2%和9.3%。免疫印迹分析的结果显示在C154和C191相应位置处出现杂交条带。ELISA结果显示C154和C191诱导小鼠产生了抗HCV抗体。结论 表达的重组蛋白具有抗原特异性和免疫原性。“截断”型HCV核心蛋白的抗原性和免疫原性并未因羧端的部分缺失而减弱。     

丙型肝炎病毒F蛋白的原核表达及初步应用

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)F基因的原核表达载体,并在大肠杆菌TG1中进行表达,用以检测丙肝患者体内抗体,并制备抗血清。方法提取患者血清中的HCVRNA,并进行基因分型。取鉴定为HCV1b型的病毒,用RT-PCR扩增HCVF蛋白基因的序列。将扩增产物插入pGEM-T载体中,测序正确后,用EcoRI、BamHI双酶切后,再插入表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌TG1,在IPTG诱导下表达GST-F蛋白。用亲和层析法纯化GST-F蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清。并用纯化的GST-F蛋白进行ELISA法检测丙肝患者血清抗F蛋白抗体。结果在细菌裂解液中检测到重组的融合蛋白,经GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化获得较高纯度的GST-F融合蛋白。应用Westernblot方法检测证实,用纯化的GST-F蛋白免疫BALB/c小鼠得到了特异性的抗体。用纯化的GST-F蛋白进行ELISA检测120例丙肝患者血清抗F蛋白抗体,82例呈阳性。结论通过上述方法制备的融合蛋白纯度较高,免疫小鼠获得的抗体具有良好的特异性。用纯化的目的蛋白检测丙肝患者血清抗F蛋白的抗体的阳性率为68%,与国外的报道接近,说明在HCV感染的自然病程中有F蛋白的产生,为研究HCVF蛋白及与HCV相关疾病的诊断和治疗提供了条件。     

HCV HLA-A2限制性复合多表位基因的构建、克隆表达及其免疫特性分析

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)HLA-A2限制性复合多表位基因的原核表达载体,表达纯化,并观察其免疫原性。方法:分别合成HCV HLA-A2限制性多表位基因、人泛素基因,串联后得到融合基因Ub-Mep,克隆入原核表达质粒pRSET-A,转化E.coliBL21,IPTG诱导融合蛋白表达,薄层扫描分析表达蛋白组成;可溶性分析后用Ni2+-NTA凝胶亲和层析柱纯化、透析并浓缩融合蛋白;Western blot分析纯化蛋白的特异性和抗原性;免疫小鼠分析其免疫原性。结果:成功构建复合多表位抗原基因的原核表达质粒pRSET-Ub-Mep,目的基因可高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在,Ni2+-NTA纯化可获得目的蛋白,纯化蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。结论:成功构建HCV HLA-A2限制性复合多表位基因并进行原核表达,表达的多表位基因抗原具良好的免疫原性,为进一步的HCV A2限制性复合多表位诱导的细胞免疫应答研究奠定基础。     

丙型肝炎病毒河北株E2蛋白胞外核心区的真核表达及应用

目的真核细胞表达丙型肝炎病毒(HCV)河北株E2蛋白胞外核心区(E2c)并利用E2c蛋白检测HCV患者血清中特异性抗E2蛋白抗体水平。方法以HCV1b型(河北株)基因序列为基础,设计HCV1b E2c基因序列并通过基因拼接的方法合成;将含有组织型纤溶酶原激活物(t PA)信号肽的E2c扩增产物克隆入p CI-neo真核表达载体,获得p CI-tpa-1b E2c载体;将p CI-tpa-1b E2c真核表达载体转染HEK293T细胞,收集细胞上清后进行浓缩及纯化,Western blot法鉴定蛋白特异性;以获得E2c蛋白为抗原,建立基于雪花莲凝集素(GNA)的改良ELISA检测HCV患者血清特异性抗E2c抗体水平。结果成功利用真核表达系统表达获得E2c蛋白,建立了GNA改良ELISA检测HCV患者血清中抗E2蛋白抗体的方法。结论成功在HEK293T细胞表达HCV-1b E2c蛋白并进行了临床应用。     

HCV IRES介导荧光素酶小鼠体内表达模型的建立

HCV内部核糖体起始位点(internal ribosomal entry site，IRES)含有40S核糖体的有效结合部位和与内部翻译起始因子eIF-3的结合部位，以内部起始方式调控介导HCV蛋白的翻译启动，在翻译调控中具有重要作用，是反义寡核苷酸、核酶和siRNA等药物治疗的重要靶位。王小红等曾构建了CMV     

干扰素刺激基因ISG20真核表达载体的构建及其抗丙型肝炎病毒复制作用的研究

目的：研究IFN—α抗HCV的作用机理及了解ISG20是否参与介导IFN-α对HCV的抑制作用。方法：用RT—PCR法及融合PCR法分别获得野生型及突变型ISG20cDNA，并将其克隆到真该表达载体pcDNA3．1上，转染含HCV复制子的Huh7细胞进行瞬时表达，通过Northern blot及Western blot分别检测HCVRNA及NS5A蛋白水平，研究表达ISG20对HCV复制子的影响。结果：构建的野生型及突变型ISG20真核表达载体在mRNA水平及蛋白水平的表达均得到证实，并且发现表达野生型ISG20对HCV复制子RNA有抑制作用。结论：成功克隆及表达了ISG20，并对其抗病毒作用进行了初步研究，提示ISG20可能介导IFN-α对HCV的抑制作用。     

HCV核心蛋白对HepG2 细胞microRNA表达谱的影响

 摘要：目的 分析HCV核心蛋白（HCV-Core）对HepG2细胞microRNA表达谱的影响。方法 将构建好的重组真核表达质粒pCDNA3.1（+）/HCV-Core用脂质体转染HepG2细胞,经G418筛选得到稳定转染HCV-Core的HepG2细胞,命名为HepG2-HCV Core细胞株。然后用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）,细胞免疫荧光和Western blot对HCV核心蛋白在HepG2细胞里mRNA和蛋白水平的表达情况进行验证。利用博奥生物公司的miRNA Array基因芯片,分析稳定表达HCV核心蛋白的HepG2细胞和转染空质粒pCDNA3.1（+）的HepG2细胞二者microRNA表达谱的差异,最后用Taqman探针荧光定量PCR法进行验证。 结果 感染HCV-Core后,HepG2细胞表达有差异的microRNA有8种,用Taqman探针荧光定量PCR法进行分析,发现HCV核心蛋白可以上调miR-29、 miR-146a、miR-149、miR-192、miR-221、miR-222和miR-193b;下调miR-196a。结论 HCV核心蛋白可以诱导肝细胞microRNA表达谱发生改变,在肝癌发生发展过程中发挥重要作用。     

家蚕蚕蛹过敏原表皮蛋白RR-2基序63前体(CPR63)的克隆表达、纯化鉴定及生物信息学分析

目的克隆表达家蚕蚕蛹表皮蛋白RR-2基序63前体(CPR63)基因,纯化鉴定蛋白的过敏原性,并进行生物信息学分析。方法合成家蚕蚕蛹CPR63蛋白的基因(ref|NM_001173223.1|),将其连接至克隆载体p MD18-T,p MD18-T-CPR63阳性质粒与原核表达载体p ET-44a分别用限制性内切酶酶切,构建出重组表达质粒p ET-44a-CPR63,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达;Western blot检测重组CPR63蛋白特异性过敏原性;用clustalw2和MEGA5工具包进行同源性分析;用Prot Param Tools预测其理化性质;用PSIPRED和SWISS-MODEL预测其蛋白质结构。利用网络服务器IEDB、Preprod和DNAStar,对CPR63蛋白T、B细胞抗原表位进行预测。结果经测序鉴定,本研究成功克隆出了家蚕蚕蛹CPR63基因,其开放阅读框549 bp,编码182组氨基酸。通过大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表达CPR63重组蛋白主要以可溶性形式存在,相对分子质量约20 000。Western blot显示重组CPR63能够与家蚕蚕蛹过敏患者血清Ig E结合。家蚕蚕蛹CPR63蛋白与黑脉金斑蝶表皮蛋白RR-2基序63(gb|EHJ69818.1|)同源性为85%。系统进化树结果显示家蚕蚕蛹与小菜蛾亲缘关系比较近。理化性质预测显示CPR63蛋白质较稳定。二级结构及三级结构预测结果显示CPR63的结构主要以无规则卷曲组成。T细胞抗原表位预测得到4个肽序列(5~13、20~28、51~59和87~95)。B细胞抗原表位预测得到4个肽序列(21~40、37~56、47~66和64~83)。结论成功克隆并表达了家蚕蚕蛹CPR63,并证实重组CPR63蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究家蚕蚕蛹过敏原的结构成分及其理化性质奠定理论基础。     

丙型肝炎病毒阳性血清对小胶质细胞TLR7蛋白及炎性因子表达的影响

通过观察丙型肝炎病毒阳性血清处理后小鼠小胶质细胞BV2(BV2细胞)内TLR7蛋白及TNF-α、IFN-α的表达变化,探讨HCV对中枢神经系统损伤的免疫发病机制。用20%HCV阳性血清处理BV2细胞,在处理后24 h收集细胞及培养上清液,应用间接免疫荧光流式细胞术及酶联免疫吸附法(ELISA)分别检测细胞内TLR7蛋白和培养上清液中TNF-α、IFN-α的表达,同时设同型对照、空白组和正常人血清组。结果表明,BV2细胞内有TLR7蛋白的表达,其中HCV阳性血清组表达明显升高,较空白组及正常人血清组比较具有统计学意义(P<0.05),正常人血清组与空白对照组比较无统计学意义。HCV阳性血清处理BV2细胞24h后TNF-α、IFN-α水平均较空白组及正常人血清组增高,具有统计学意义(P<0.05),正常人血清组与空白对照组比较无统计学意义(P>0.05)。本研究初步阐明了HCV阳性血清处理后BV2细胞中TLR7表达显著升高,TLR7激活后能够启动BV2细胞的固有免疫反应,因此TLR7可能在HCV导致的CNS的发病中发挥重要作用。     

丙型肝炎病毒E2包膜糖蛋白的研究进展

HCV E2包膜糖蛋白是HCV的结构蛋白之一,具有重要的受体结合位点和抗原表位,在病毒感染和宿主免疫过程中起着十分重要的作用,也是目前疫苗研究的热点.其分子和功能特性的研究对HCV作用机制及预防和治疗的研究有重要意义.近年来,该领域的研究取得一定进展.本文综述了E2蛋白在病毒的入胞作用,在机体的免疫应答及其在疫苗研制方面的作用.