腺病毒介导转化生长因子β1基因阻逆兔椎间盘退行性变的实验

目的:观察腺病毒载体搭载的人转化生长因子基因对兔椎间盘退行性变模型的治疗作用。方法:实验于2003-03/2004-09在协和医院骨科实验室进行。取4个月龄健康雌性日本大白兔30只,于协和医院骨科实验室行L4～5,L5～6前外侧纤维环损伤手术以构建椎间盘退行性变模型。术后8周将动物随机分入3组。治疗组14只,注射20μL(10×106pfu)腺病毒载体介导人转化生长因子β1基因;对照组8只,注射20μL(10×106pfu)腺病毒载体介导标志基因(Ad/CMV-LacZ);空白组6只,注射20μL生理盐水。另取2只同类的健康白兔作为正常对照,不予任何手术或治疗。注射后3周取各组椎间盘组织行苏木精-伊红染色、T2加权磁共振成像、蛋白免疫印迹、转化生长因子β1免疫组织化学观察。结果:①兔椎间盘组织切片观察结果:注射3周后,治疗组切口已基本愈合,髓核细胞大量增生;空白组纤维环外侧内2/3部分仍未愈合,部分髓核细胞坏死、凋亡;对照组较空白组改善不明显。②MRI扫描结果:治疗组椎间盘信号较对照组及空白组有所恢复,但并未完全达到正常椎间盘水平。③蛋白质免疫印迹分析结果:治疗组转化生长因子β1含量较对照组和空白组有显著上升(P<0.01)。④转化生长因子β1免疫组织分析结果:治疗组转化生长因子β1为强阳性表达(>50%),空白组几乎没有转化生长因子β1表达,对照组与空白组相似。治疗组显著高于对照组(χ2=20.563,P=0.00)。结论:腺病毒载体介导人转化生长因子β1基因转染退行性变的椎间盘细胞能够有效提高髓核细胞内转化生长因子β1含量,阻逆椎间盘退行性变。     

转化生长因子β3重组腺病毒载体转染退变髓核细胞后的增殖活性

背景:通过基因干扰促进某些基因的表达,调控细胞生物学活性刺激有利于椎间盘组织再生的基质合成来达到治疗目的。目的:构建含有转化生长因子β3的腺病毒表达载体,观察其对退变髓核细胞增殖的影响。方法:制作椎间盘突变模型,从而获取原代退变椎间盘髓核细胞,提取总RNA,调取转化生长因子β3cDNA克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,采用pAdEasy系统进行细菌内同源重组得到含目的基因的腺病毒载体,脂质体转染293A细胞进行包装并扩增病毒。结果与结论:成功构建有较强感染能力的含转化生长因子β3基因重组腺病毒表达载体,滴度达1010pfu/L,MTT法检测表明Ad-TGF-β3可改善退变髓核细胞生物学特性,为研究转化生长因子β3的作用机制及将其用于椎间盘退变的基因治疗提供实验和理论依据。     

转化生长因子β2在兔退行性变椎间盘纤维环中的表达

目的：观察转化生长因子β2在兔椎间盘退行性变过程中的表达情况并探讨其意义。 方法：实验于2005-03／2006-01在协和医院骨科实验室进行，手术后动物饲养于协和医院实验动物房。标本的免疫组织化学及蛋白免疫印迹检测在同济医学院免疫学教研组实验室完成。①健康4个月龄雌性日本大白兔12只，采用随机数字法分为假手术组3只、椎间盘退变模型组9只。构建前路纤维环损伤致兔椎间盘退变模型。②于造模的第1，2，4周采用Thompson评分评价椎间盘退变程度。③采用免疫组织化学法检测纤维环内转化生长因子β2分布情况。④采用反转录-聚合酶链反应检测转化生长因子β2基因表达情况。 结果：12只兔均进入结果分析。①兔椎间盘退行性变程度评价：根据Thompson分级法，假手术组3只均为Ⅰ级，模型组第1周2只为Ⅱ级，1只为Ⅲ级，第2周3只均为Ⅲ，第4周3只均为Ⅳ级。椎间盘退行性变程度随着造模时间的延长而加重。②各组大鼠椎间盘标本免疫组织化学结果：假手术组及造模1，2及4周纤维环内转化生长因子β2染色阳性细胞率分别为73．2％，35．7％，19．6％及3．7％，造模第4周组明显低于假手术组（P〈0．01）。③各组大鼠转化生长因子β2反转录-聚合酶链反应检测结果：转化生长因子β2基因的表达随着造模时间的延长而逐渐减弱，造模第4周组较假手术组下降最为明显。 结论：转化生长因子β2在椎间盘内的含量及表达随着椎间盘退行性变程度的加剧而下降，这种下降可能是椎间盘的退行性变机制之一。     

PCI-hTGF-β1转染体外培养成人退变椎间盘细胞及其表达产物的测定

背景：人转化生长因子β1基因可用于椎间盘退变的基因治疗，但有效载体的构建是实验的关键。目的：测定真核表达载体PCI-hTGF-β1转染体外培养成人退变椎间盘细胞可否表达产物人转化生长因子β1，为椎间盘退变的基因治疗提供实验基础。设计：单一样本实验。单位：山东省创伤骨科研究所，一所市立医院骨科。材料：实验于1999—10／2001—01在山东省创伤骨科研究所实验室进行。椎间盘标本均为椎间盘突出症患者手术中取材（获患者知情同意）。标本1为30岁女性的L4/5椎间盘，标本2为38岁女性的L5／S1椎间盘。方法：①培养成人退变椎间盘细胞：标本离体30min内取回实验室，收集原代培养的纤维环细胞和髓核细胞。②转染：将细胞置于24孔培养板中，每孔细胞数目在5．5&;#215;10^5个，应用构建的PCI-hTGF-β1真核表达载体对其进行转染，并设立转染PCI组和未转染组。③用免疫组织化学方法对转染48h后的细胞进行表达产物测定。主要观察指标：两个标本中，各组原代纤维环细胞和髓核细胞中真核表达载体PCI-hTGF-β1的阳性细胞产物的吸光度值比较。结果：①标本1：原代纤维环细胞和原代髓核细胞中真核表达载体PCI—hTGF—β1的阳性细胞产物的吸光度值为PCI组的3．49，3.69倍，为未转染组的3.55倍。②标本2：原代纤维环细胞和原代髓核细胞中真核表达载体PCI—hTGF-β1的阳性细胞产物的吸光度值为PCI组的3．56，3.46倍，为未转染组的3．43，3.33倍。结论：PCI-hTGF—β1是人转化生长因子β1基因在体外培养退变椎间盘细胞转染中有效的真核表达载体，可以成功转染体外培养的成人退变椎间盘细胞，并可获得人转化生长因子β1基因产物的高表达。     

转化生长因子β1注射退变椎间盘内软骨终板的组织形态变化

背景：椎间失稳能导致软骨终板的退变,是椎间盘退变发病机制中的基础环节。目的：观察退变椎间盘内注射转化生长因子β1后,椎间盘软骨终板的组织形态学变化。方法：将日本大耳白兔随机分为对照组、预防组和治疗组。所有兔均建立L5～6,L6～7椎间失稳模型。预防组在完成椎间失稳建模后立即于损伤侧L5～6,L6～7椎间盘内注射转化生长因子β1,治疗组于椎间失稳建模后3个月行相同方法注射转化生长因子β1。结果与结论：建模后3,6个月,预防组较对照组软骨终板软骨细胞分布均匀,潮线清晰。Mankin评分降低（P〈0.05）。建模后第6个月治疗组较对照组软骨终板表层光滑,细胞排列均匀,潮线清晰,染色均匀,Mankin评分降低（P〈0.05）。结果证实,在兔椎间盘内注射转化生长因子β1可延缓椎间盘软骨终板的退变。     

椎间注射转化生长因子β1对免退变腰椎间盘蛋白多糖表达的影响

背景：体外研究证实转化生长因子β1可以促进蛋白多糖合成,延缓椎间盘退变,但体内实验鲜见报道。目的：观察局部应用转化生长凶子β1对兔退变腰卡傩间盘髓核蛋白多糖表达的影响。方法：取30只新西兰人白兔建立兔腰椎间盘退变模型,造模12周,经x射线证实退变后,随机选择6只模型兔及6只未造模正常兔,处死取材。分刖向剩余24只模型兔L4．5椎间隙注射转化生子因子β1和生理盐水。末次给药2,4周取材,间苯三酚法测定兔椎间盘髓核内蛋白多糖的水平。结果与结论：造模12周,兔退变椎间盘髓核中蛋白多糖水甲明显降低（P〈0.01）。绎局部注射转化生子因子β1后,兔退变椎间盘髓核中蛋白多精表达明显增多（P〈0.01）。说明在兔椎间注射转化生子因子β1可以促进髓核蛋白多糖的合成,延缓椎间盘退变。     

转化生长因子β2在兔退行性变椎间盘纤维环中的表达

目的:观察转化生长因子β2在兔椎间盘退行性变过程中的表达情况并探讨其意义。方法:实验于2005-03/2006-01在协和医院骨科实验室进行,手术后动物饲养于协和医院实验动物房。标本的免疫组织化学及蛋白免疫印迹检测在同济医学院免疫学教研组实验室完成。①健康4个月龄雌性日本大白兔12只,采用随机数字法分为假手术组3只、椎间盘退变模型组9只。构建前路纤维环损伤致兔椎间盘退变模型。②于造模的第1,2,4周采用Thompson评分评价椎间盘退变程度。③采用免疫组织化学法检测纤维环内转化生长因子β2分布情况。④采用反转录-聚合酶链反应检测转化生长因子β2基因表达情况。结果:12只兔均进入结果分析。①兔椎间盘退行性变程度评价:根据Thompson分级法,假手术组3只均为Ⅰ级,模型组第1周2只为Ⅱ级,1只为Ⅲ级,第2周3只均为Ⅲ,第4周3只均为Ⅳ级。椎间盘退行性变程度随着造模时间的延长而加重。②各组大鼠椎间盘标本免疫组织化学结果:假手术组及造模1,2及4周纤维环内转化生长因子β2染色阳性细胞率分别为73.2%,35.7%,19.6%及3.7%,造模第4周组明显低于假手术组(P<0.01)。③各组大鼠转化生长因子β2反转录-聚合酶链反应检测结果:转化生长因子β2基因的表达随着造模时间的延长而逐渐减弱,造模第4周组较假手术组下降最为明显。结论:转化生长因子β2在椎间盘内的含量及表达随着椎间盘退行性变程度的加剧而下降,这种下降可能是椎间盘的退行性变机制之一。     

人转化生长因子β1基因重组腺病毒的构建与鉴定

背景：转化生长因子β1能促进多种细胞的生长增殖,是调控骨髓间充质干细胞向成骨方向定向分化的主要生长因子。目的：利用AdMax系统构建人转化生长因子β1（hTGF-β1）基因的重组腺病毒表达载体。方法：采用PCR方法克隆人转化生长因子β1基因cDNA后,插入线性化表达载体pAV-MCMV-EGFP-3FLAG中,转化E.coliDH5α感受态细胞,构建pAV-MCMV-hTGF-β1重组质粒。结果与结论：含目的基因的重组腺病毒质粒共转染293细胞进行病毒包装、扩增后,经PCR、WesternBlot检测得到转化生长因子β1重组腺病毒,其滴度约为1.25×1010pfu/mL。表明利用AdMax系统成功可构建人转化生长因子β1腺病毒载体,并可满足进一步的转化生长因子β1成骨作用的研究。     

可注射型纤维蛋白凝胶转化生长因子β1复合骨髓间充质干细胞移植治疗椎间盘退变

背景：纤维蛋白凝胶主体胶与催化剂未混合前为液态,具有可注射的优点,注射混合后凝固成凝胶状,与髓核相似,并且凝固时间可控性强,作为间充质干细胞的载体植入到椎间盘内有诸多优点。目的：观察可注射型纤维蛋白凝胶转化生长因子β1复合骨髓间充质干细胞移植抑制椎间盘退变的可行性。方法：将新西兰大白兔随机分为退变模型组、纤维蛋白凝胶组,骨髓干细胞＋纤维蛋白凝胶组。3组采用针刺法诱导建立退变模型后,纤维蛋白凝胶组及干细胞＋纤维蛋白凝胶组分别移植入纤维蛋白凝胶转化生长因子β1复合物及骨髓间充质干细胞纤维蛋白凝胶转化生长因子β1复合物,于植入后2,6,10周行CR、MRI及病理检查。结果与结论：退变模型组与纤维蛋白凝胶组椎间隙高度下降明显,并与时间呈正相关,干细胞＋纤维蛋白凝胶组下降较缓慢（P〈0.01）。免疫组织化学及组织学检查显示,退变模型组髓核细胞的数量及Ⅱ型胶原含量进行性减少,细胞凋亡率明显增加,纤维蛋白凝胶组与退变模型组相似,干细胞＋纤维蛋白凝胶组髓核细胞数量及Ⅱ型胶原含量较退变模型组及纤维蛋白凝胶组明显增多,细胞凋亡率下降。说明骨髓间充质干细胞联合纤维蛋白凝胶转化生长因子β1能很好抑制椎间盘退变,而单纯纤维蛋白凝胶转化生长因子β1移植不能抑制椎间盘退变。     

肺动脉高压转基因治疗的可能机制研究：不同剂量重组腺病毒转染大鼠肺脏的对比观察

目的：经气道转染不同剂量重组腺病毒载体AdCMVLacZ，探讨腺病毒介导的外源基因在大鼠呼吸道上皮转基因表达的有效性、量效关系、毒副作用及其在肺内表达的适宜剂量，为基因治疗肺动脉高压提供实验依据。方法：Wistar大鼠20只随机分为4组(每组5只)，应用高(高剂量组，5&;#215;10^12pfu／L)、中(中剂量组，1．67&;#215;10^12pfu／L)、低(低剂量组，1．67&;#215;10^12pfu／L)3种滴度的复制缺陷型重组腺病毒AdCMVIacZ或病毒保存液(对照组)各600μL，经气管导管分别注入大鼠肺脏。7d后行肺组织x-gal染色和组织病理学检测，光镜下计算转基因阳性细胞率。结果：高、中、低剂量组大鼠肺组织均出现转基因阳性表达，且高、中剂量组的阳性细胞率[分别为(67．8&;#177;13．5)％和(63．8&;#177;12．6)％]明显高于低剂量组[(5．86&;#177;1．68)％]和对照组[(0．45&;#177;0．61)％，F：76．023，P&;lt;0．01]，但高剂量组与中剂量组以及低剂量组与对照组间无显著性差异。HE染色显示，仅高剂量组中3只大鼠肺组织有轻度炎性浸润，余3组均未发现炎性反应。结论：外源基因可通过腺病毒介导在呼吸道上皮呈高效稳定表达，且在一定剂量范围内基因表达效率与所用腺病毒载体剂量呈正相关，载体用量过大(5&;#215;10^12pfu／L)，不能提高转染效率，反可造成机体免疫炎性反应。     

脓毒症大鼠小肠功能变化的研究

目的　探讨脓毒症大鼠小肠屏障、吸收、通透及其蠕动功能的变化。方法　以 Wistar大鼠缺血再灌注复合内毒素血症制备动物模型。将动物随机分为正常对照 ( N)、肠系膜上动脉夹闭 1h后再灌注 1h( I/ R1)、2 h( I/ R2 )和 4 h( I/ R4 )以及再灌注 2 h后复合内毒素 2 h( I/ RL)共 5个组。分别测定各组动物血或小肠组织二胺氧化酶 ( DAO)、D 乳酸、D 木糖水平及肠蠕动 ,同时进行小肠普通光镜检查。结果　 I/ R1、I/ R4和 I/ RL组血浆 DAO活性均显著升高 ( P均 <0 .0 5 ) ,小肠组织 DAO在 I/ R2和 I/ RL 组均显著降低( P均 <0 .0 5 ) ,从 N、I/ R1、I/ R2、I/ R4到 I/ RL,各组血浆 DAO和小肠 DAO的相关分析可见呈高度负相关( r= 0 .90 9,P<0 .0 0 1) ;I/ R 1、I/ R 2和 I/ RL组血浆 D乳酸均显著升高 ( P均 <0 .0 5 ) ;与 N组比较各组肠传输速度显著加快 ( P均 <0 .0 5 ) ;I/ R 1和 I/ RL组血中 D木糖浓度较 N组高 ,3h后仍高于 N组 ;血 DAO浓度与血 D乳酸浓度变化相关 ( r=0 .5 5 9,P<0 .0 5 )。结论　缺血再灌注后小肠的屏障、吸收、通透和蠕动功能均有不同程度的改变 ;缺血再灌注复合内毒素血症时再次加速或加重了小肠屏障、吸收、通透和传输功能的变化     

浙江省岱山县居民死因分析

目的 为掌握浙江省岱山县海岛地区居民健康状况和主要疾病死亡原因,评价居民健康水平,为政府和相关部门制定疾病预防控制策略提供参考依据.方法 对岱山县1986 -1988年和2009-2010年两个时期居民死亡资料进行比较分析,采用国际疾病分类法进行编码,以2000年全国标准人口构成比进行死亡率标化.结果 岱山县两个...     

Achievements in hip joint surgery in adults in Poland

The treatment of diseases and injuries of the hip joint in both children and adults has been a major area of interest for surgeons treating injuries and non-traumatic conditions of the organs of locomotion. The work of prominent Polish surgeons and orthopaedists has contributed to progress in this branch of medicine over the last century.     

论护理工作中的“慎独”与“慎众”

"慎独"一词出自《礼记·中庸》中"莫见乎隐,莫显乎微,故君子慎其独也"。即当君子独处,无人监督的时候,总是小心谨慎地不做任何不道德的事情。"慎众"则是指在许多人违反原则时,君子却不随波逐流,不盲目