曲格列汀诱导高糖条件下肾系膜细胞表达HO-1

目的:观察曲格列汀在高糖条件下对人肾系膜细胞(HRMCs)表达血红素氧合酶1(HO-1)的影响,并初步探讨其分子机制。方法:在正常浓度(5 mmol/L)葡萄糖及高糖(25 mmol/L)条件下培养HRMCs,分别加入1、5和10μmol/L曲格列汀作用8～24 h。随后用RT-qPCR以及Western blot分别检测HO-1的mRNA和蛋白表达,比色法测定HO-1酶活性。此外,采用荧光探针检测细胞内活性氧簇(ROS)的变化,Western blot检测Akt磷酸化水平和核转录因子E2相关因子2(Nrf2)的表达水平。结果:高糖条件下HRMCs中HO-1的表达以及酶活性水平轻微增高,而经1、5和10μmol/L曲格列汀作用后,HO-1的mRNA、蛋白表达以及酶活性显著增高(P0.05);同时,曲格列汀也能增加高糖条件下HRMCs的ROS水平并诱导Akt磷酸化,采用ROS清除剂NAC以及PI3K/Akt抑制剂LY294002处理后,HO-1的表达水平明显降低;此外,曲格列汀也可增强HRMCs核内转录因子Nrf2的表达,且NAC和LY294002能抑制曲格列汀诱导的Nrf2的表达。而沉默Nrf2后,曲格列汀诱导的HO-1表达减少。结论:曲格列汀可能能通过ROS和PI3K/Akt途径激活Nrf2而增加高糖条件下HRMCs表达HO-1。     

DHA激活NADPH氧化酶/ROS/Nrf2通路诱导ARPE-19细胞表达HO-1

目的:观察二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)诱导人视网膜色素上皮细胞表达血红素氧合酶(Heme oxygenase,HO)-1的分子机制。方法:培养人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19,加入30~100μmol/L DHA作用4~24 h。Western blot检测HO-1的表达及NADPH氧化酶p47~(phox)亚基的磷酸化;荧光探针H2DCFDA检测活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的产生;免疫荧光分析Nrf2在细胞核及胞浆中的表达;最后采用NADPH氧化酶抑制剂DPI,ROS抑制剂NAC或采用siRNA干扰Nrf2表达,检测其对HO-1表达的影响。结果:100μmol/L DHA作用ARPE-19细胞30 min即可诱导p47~(phox)亚基的磷酸化,同时能增加细胞内ROS的含量;采用NADPH氧化酶抑制剂DPI处理后,ROS水平显著降低;免疫荧光实验显示DHA作用细胞2 h后,可诱导Nrf2核转位,采用DPI或NAC处理后,Nrf2核转位水平明显减少;采用Nrf2 siRNA沉默其表达,或采用DPI或NAC处理后,可抑制DHA诱导ARPE-19细胞表达HO-1。结论:DHA可能通过NADPH氧化酶/ROS/Nrf2通路途径诱导视网膜色素上皮细胞表达HO-1,从而发挥对细胞的保护作用。     

黄芪甲苷抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌H9c2细胞凋亡

目的:探讨黄芪甲苷(ASⅣ)对血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)诱导的心肌H9c2细胞凋亡的作用及其机制。方法:用不同浓度Ang Ⅱ及ASⅣ处理心肌H9c2细胞,CCK-8法检测Ang Ⅱ及ASⅣ对心肌细胞活力的影响,选取Ang Ⅱ的最佳作用浓度为1μmol/L,ASⅣ浓度梯度设为25、50和100μmol/L。实验分为6组:对照组、ASⅣ组、Ang Ⅱ组、Ang Ⅱ+ASⅣ (25μmol/L)组、Ang Ⅱ+ASⅣ (50μmol/L)组和Ang Ⅱ+ASⅣ (100μmol/L)组。倒置相差显微镜下观察细胞形态并进行细胞计数检测细胞生长情况,TUNEL法检测细胞凋亡,DCFH-DA标记法检测活性氧簇(ROS)的水平, Western blot法检测Bax、Bcl-2、核因子E2相关因子2(Nrf2)及其下游因子血红素加氧酶1(HO-1)的表达情况。用negative control shRNA(NC)或Nrf2-shRNA(shRNA)质粒转染H9c2细胞,转染后实验分为8组,NC+control组、NC+AngⅡ组、NC+ASⅣ组、NC+AngⅡ+ASⅣ组、shRNA+control组、shRNA+AngⅡ组、shRNA+ASⅣ组和shRNA+AngⅡ+ASⅣ组,检测各组ROS水平及Nrf2和HO-1蛋白表达情况。结果:Ang Ⅱ呈浓度依赖性降低心肌H9c2细胞的活力,ASⅣ能逆转Ang Ⅱ对心肌H9c2细胞活力降低的作用,并呈浓度依赖性(P0.05);与对照组相比,Ang Ⅱ组细胞凋亡率显著增加,ROS水平显著升高,Bax蛋白表达水平显著升高,Bcl-2、Nrf2和HO-1蛋白表达水平显著降低;与Ang Ⅱ组相比,ASⅣ可呈浓度依赖性逆转Ang Ⅱ诱导的心肌细胞凋亡率升高情况,降低ROS水平,下调Bax蛋白表达水平,上调Bcl-2、Nrf2和HO-1蛋白的表达水平(P0.05)。转染shRNA后,ASⅣ降低Ang Ⅱ诱导的ROS产生及上调Nrf2和HO-1表达的作用被消除。结论:ASⅣ抑制Ang Ⅱ诱导的心肌H9c2细胞凋亡,这一保护作用与其降低ROS水平、介导Nrf2/HO-1信号通路相关。     

生殖支原体脂质相关膜蛋白诱导胎盘滋养层细胞表达血红素氧合酶1从而负调控细胞因子分泌

目的观察生殖支原体脂质相关膜蛋白(LAMP)能否诱导胎盘滋养层细胞表达血红素氧合酶1(HO-1),从而影响细胞因子的产生。方法体外培养胎盘滋养层细胞,用0.5~5μg/m L LAMP作用4~12 h。实时定量PCR和Western blot法分别检测HO-1 mRNA和蛋白的表达以及核因子相关因子2(Nrf2)的核转位;2',7'-二氯二氢荧光黄二乙酸酯(H2DCFDA)检测活性氧(ROS)产生;采用N-乙酰半胱氨酸(NAC)或Nrf2 siRNA处理滋养层细胞,观察其对HO-1表达的影响。采用HO-1的激动剂钴原卟啉(Co PP),抑制剂锌原卟啉(Zn PP)或HO-1 siRNA处理细胞,ELISA检测处理前后LAMP对诱导肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)分泌的影响。结果 LAMP能诱导滋养层细胞HO-1 mRNA和蛋白表达,并能诱导其产生ROS以及促进Nrf2核转位。ROS抑制剂NAC预处理后,可明显降低HO-1的表达水平以及细胞核内Nrf2含量。同时,Nrf2siRNA转染后,HO-1表达显著减少。采用Zn PP处理滋养层细胞,或RNA干扰HO-1表达后,可促进LAMP诱导滋养层细胞分泌TNF-α和IL-1β,而Co PP处理能进一步降低TNF-α和IL-1β水平。结论 LAMP能通过ROS/Nrf2诱导滋养层细胞表达HO-1,从而抑制细胞因子的过度分泌。     

tBHQ对亚砷酸钠致胰岛β细胞氧化应激损伤的影响

目的探讨核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)激活剂叔丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone,tBHQ)对急性亚砷酸钠(sodium arsenite,NaAsO_2)所致小鼠胰岛β细胞MIN6氧化应激损伤的影响及其作用机制。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞的存活率,并筛选tBHQ最适的处理浓度。根据MTT结果将MIN6细胞分为3组:正常对照组、4μmol/L NaAsO_2组、50μmol/L tBHQ预处理+4μmol/L NaAsO_2组。通过光学显微镜观察细胞的形态和贴壁数量;二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针法检测细胞活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)含量;Western Blot检测细胞内Nrf2蛋白表达;Real-time RT-PCR检测血红素氧化酶1(HO-1)和硫氧还蛋白(SRX)mRNA表达。结果与正常对照组相比,4μmol/L NaAsO_2组细胞体积、贴壁数量、存活率均显著下降;而细胞内的ROS含量明显升高。与4μmol/L NaAsO_2组相比,50μmol/L tBHQ预处理后,显著降低NaAsO_2对MIN6细胞氧化应激损伤。tBHQ预处理能够显著增加细胞内的Nrf2蛋白水平,且HO-1和SRX的mRNA表达均明显高于4μmol/L NaAsO_2组。结论 tBHQ可以通过预先激活Nrf2/ARE信号通路,减轻亚砷酸钠所致小鼠胰岛β细胞的氧化应激损伤,在此过程中发挥重要保护作用。     

红景天苷通过Nrf2/HO-1通路减轻6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞损伤

目的:研究红景天苷(salidroside,Sal)对6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及可能机制。方法:4-甲基偶氮唑蓝(MTT)检测SH-SY5Y细胞活性,CM-H2DCFDA染色检测活性氧(ROS);Western Blot检测核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)与血红素氧合酶-1(HO-1)的蛋白表达;结果:与对照组比较,6-OHDA(150μmol/L)处理SH-SY5Y 24 h后,细胞存活率降低至44.1%±4.6%(P0.05),ROS水平增加;红景天苷(25,50μmol/L)预处理24 h后,与6-OHDA组比较,细胞存活率分别增加至68.3%±4.1%(P0.05)和80.0%±6.2%(P0.01)同时ROS减少。此外,6-OHDA(150μmol/L)可使细胞内Nrf2与HO-1的蛋白表达减少,红景天苷预处理24 h后,Nrf2与HO-1的蛋白表达依次增加。结论:Sal能减少细胞内ROS的水平,对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞凋亡具有浓度依赖性的保护作用,其作用机制可能与激活Nrf2/HO-1通路有关。     

紫草素对高糖诱导的血管内皮细胞凋亡和氧化应激的影响

目的:探讨紫草素(shikonin)对高浓度葡萄糖诱导的血管内皮细胞凋亡和氧化应激水平的影响及其可能的作用机制。方法:体外培养的大鼠胸主动脉内皮细胞随机分为5组:正常对照组(培养基中葡萄糖浓度为5.5 mmol/L)、高糖组(培养基中葡萄糖浓度为33 mmol/L)、高糖+低浓度紫草素组(培养基中葡萄糖浓度为33mmol/L,紫草素浓度为0.1μmol/L)、高糖+中浓度紫草素组(培养基中葡萄糖浓度为33 mmol/L,紫草素浓度为1μmol/L)和高糖+高浓度紫草素组(培养基中葡萄糖浓度为33 mmol/L,紫草素浓度为10μmol/L)。各组细胞经相应处理后,CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞的凋亡率;此外,检测细胞中丙二醛(malondialdehyde,MDA)、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的水平,以反映细胞的氧化应激状态;Western blot检测Nrf2/HO-1信号通路的活性。结果:相较于高糖组,紫草素处理可呈剂量依赖性地逆转高糖所致的内皮细胞活力降低及凋亡率增加。与正常对照组相比,高浓度葡萄糖可升高内皮细胞中MDA和ROS的含量,同时降低SOD和GSH-Px的活性;相较于高糖组,给予紫草素干预后,细胞内MDA和ROS的含量降低,SOD和GSH-Px的活性升高。此外,高糖可致内皮细胞中cleaved caspase-3、HO-1及核内Nrf2蛋白表达的增加;与高糖组相比,给予紫草素干预后细胞中cleaved caspase-3、HO-1和核内Nrf2的表达部分下降。结论:紫草素可显著改善高糖所致的血管内皮细胞凋亡,其作用机制可能与激活Nrf2/HO-1信号通路并降低细胞的氧化应激水平有关。     

柠檬酸铁铵通过活性氧途径影响人丙型肝炎病毒的蛋白翻译

目的研究铁对HCV IRES依赖的病毒蛋白翻译的影响,以及其与细胞ROS活性变化的关系。方法以脂质体细胞转染法,将双荧光素酶报告基因表达载体p CI-Rluc-HCV IRES-Fluc转染人肝癌细胞系Huh-7细胞。在0、50和300μmol/L浓度的柠檬酸铁铵(FAC)作用24 h后,双荧光素酶报告基因检测系统检测HCV IRES依赖的病毒蛋白翻译的变化。ROS荧光染色方法检测细胞ROS活性变化,Western blot法检测细胞中Nrf2蛋白表达的变化。加入100μmol/L的DPI后,检测300μmol/L FAC实验组中HCV蛋白翻译的变化和细胞ROS的变化。结果与对照组相比,FAC增加了Huh-7细胞HCV IRES依赖的病毒蛋白翻译、增加了ROS活性,并且可以引起核转录因子Nrf2表达增加(P0.05)。加入ROS抑制剂DPI后,可以显著抑制FAC诱导的HCV IRES依赖的病毒蛋白翻译及Nrf2蛋白的表达(P0.05)。结论 FAC可以诱导细胞HCV IRES依赖的病毒蛋白翻译增加,可能与FAC促进Huh-7细胞产生过多的ROS有关。     

Wnt3a减轻黑素细胞iMC65氧化应激损伤

目的探讨Wnt3a对氧化应激损伤的i MC65黑素细胞的保护作用及机制。方法将黑素细胞分成对照组,Wnt3a组,H2O2处理组,Wnt3a干预组,750μmol/L的H2O2作用模拟黑素细胞的氧化应激损伤。MTT实验检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞产生活性氧(ROS),荧光素酶报告基因检测Nrf2/ARE通路的激活,Western blot检测Nrf2/ARE通路的相关蛋白表达。结果与对照组相比,H2O2处理组的细胞活性明显下降(P0.01),凋亡比率明显上升(P0.01),ROS的产生明显增加(P0.01)。而Wnt3a干预组能显著缓解H2O2处理组细胞活性的降低(P0.05)、降低凋亡比率(P0.05),减少ROS的产生(P0.05)。Wnt3a也能上调Nrf2和HO-1蛋白水平的表达。结论 Wnt3a可以保护氧化应激状态下的黑素细胞,其机制可能与激活Nrf2/ARE有关。     

二十二碳六烯酸抑制氧化应激状态下人视网膜色素上皮细胞凋亡

 目的: 观察二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)对外源性H₂O₂诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡的影响及分子机制。方法: 体外培养人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19,加入终浓度为12.5 mol/L的H₂O₂诱导氧化应激,随后用30~100μmol/L DHA作用细胞4~24 h;real-time PCR和Western blot分别检测血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1) mRNA和蛋白的表达;比色法分析HO-1酶活性;荧光探针检测活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的产生;免疫荧光检测转录因子NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)的核转位。最后通过HO-1 siRNA干扰后,流式细胞术观察其对ARPE-19细胞凋亡的影响。结果: DHA能以浓度依赖性方式诱导ARPE-19细胞表达HO-1 mRNA和蛋白,同时,HO-1的酶活性也随着DHA浓度的递增而增强;DHA处理也能诱导Nrf2核转位。此外,H₂O₂处理可促进ARPE-19细胞凋亡,并诱导其产生ROS。同时给予100μmol/L DHA处理后,细胞凋亡率和ROS生成显著降低。转染HO-1 siRNA或用HO-1抑制剂ZnPP处理后,可明显降低DHA对细胞凋亡率和ROS的抑制作用。结论: DHA可能通过Nrf2途径诱导视网膜色素上皮细胞表达HO-1,从而发挥对细胞的保护作用。