单倍体相合造血干细胞移植急性移植物抗宿主病小鼠模型的构建和发病机制的探讨

目的:构建单倍体相合造血干细胞移植(HSCT)小鼠急性移植物抗宿主病(aGVHD)模型,并探讨其发病机制。方法:建立以C57BL/6(H-2~b)为供鼠,137Csγ射线11 Gy照射[C57BL/6×CBA/Ca]F1(H-2b×k)为受鼠的单倍体相合造血干细胞移植aGVHD模型。将受鼠随机分为照射对照、去除T细胞的骨髓细胞(TD-BM)、TD-BM+T细胞(1)和TD-BM+T细胞(2)共4组。移植后对受鼠生存期和体重进行评分;比较移植后14 d受鼠的靶器官损伤情况,比较TD-BM和TD-BM+T细胞(1)组的病理评分;比较移植后14和28 d TD-BM和TD-BM+T细胞(1)组的骨髓嵌合率;应用ELISA法分别检测移植后14 d TD-BM和TD-BM+T细胞(1)组受鼠血清中细胞因子IFN-γ、TNF-ɑ和IL-1的浓度。应用流式细胞术检测TD-BM和TD-BM+T细胞(1)组受鼠脾细胞中H-2b+H-2k-CD4+IFN-γ+Th1细胞的百分比和CFSE检测供者T细胞发生的增殖情况。结果:TD-BM、照射对照、TD-BM+T细胞(1)和TD-BM+T(2)组平均活存时间分别为60、13.29±5.50、33±2.35、29.14±1.77 d。移植后14 d,TD-BM+T细胞(1)和TD-BM+T(2)组小鼠出现肝脏、结肠、肺脏和皮肤等多器官损伤,而在TD-BM组多器官损伤不明显。移植后14和28 d,TD-BM和TD-BM+T细胞(1)组小鼠的嵌合率均94%。移植后14 d,TD-BM+T细胞(1)受鼠血清中细胞因子IFN-γ、TNF-ɑ和IL-1水平较TD-BM组明显增高。移植后14 d,TD-BM+T细胞(1)组中H-2b+H-2kCD4+IFN-γ+百分比明显高于TD-BM组[(0.5240±0.08447)%vs(7.912±0.6087)%](P0.05)。移植后14d,供者T细胞在受者体内发生明显增殖。结论:C57BL/6(H-2b)→[C57BL/6×CBA/Ca]F1(H-2b×k)可作为单倍体相合移植aGVHD的实验模型;Th1细胞在单倍体相合移植aGVHD中可能发挥重要作用。     

地塞米松联合IL-2对供鼠体内调节性T细胞选择性扩增作用及对急性移植物抗宿主病反应的抑制作用

目的 通过地塞米松(Dex)联合IL-2处理小鼠,建立体内扩增调节性T细胞(Treg细胞)的方法 .观察用该方法 处理的小鼠脾细胞移植后受鼠急性移植物抗宿主病(aGVHD)的发生与转归.方法 使用Dex和IL-2处理雄性C57BL/6N供鼠3 d后提取脾单个核细胞(MNC),用流式细胞术(FCM)分析CD4~+ CD25~+、CD25~+ FOXP3~+细胞的变化.,以以上方法 处理的雄性C57BL/6N小鼠为供者,对雌性BALB/c受鼠进行非清髓异基因淋巴细胞移植.移植后观测受鼠的生存率、生存时间、组织病理学变化,以及用PCR和FCM分析测定受鼠嵌合体等来评价aGVHD的发生.结果 经过Dex和IL-2联合处理,供鼠脾CD4~+ CD25~+ FOXP3~+ Treg细胞数量[(24.2±7.6)%]明显高于对照组[(4.0±0.8)%](P=0.01).Dex联合IL-2组供鼠Treg细胞与效应T细胞(Teff)的比值(0.43±0.15)显著高于对照组(0.14±0.01)(P=0.01).经过Dex联合IL-2处理供鼠后进行异基因淋巴细胞移植,受鼠aGVHD明显减轻,中位生存时间＞60 d,与对照组的中位生存时间12 d相比明显延长(P=0.0045).对照组出现典型的aGVHD表现,移植后2周Dex联合IL-2组和对照组的总体死亡率分别为29.4%和71.4%(P＜0.05).结论 经IL-2和糖皮质激素处理供鼠后进行主要组织相容性抗原复合物完全不相合脾淋巴细胞移植能明显减轻aGVHD,显著延长生存时间,可能与供者体内诱导扩增的Treg细胞增加有关.     

供体Treg细胞对小鼠异基因骨髓移植后GVHD和GVL效应的影响

本研究探讨供体CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cells,Treg cells)输注对异基因骨髓移植(allo-BMT)后小鼠移植物抗宿主病(GVHD)及移植物抗GVL)效应的影响。建立BALB/c→C57BL/6小鼠EL4白血病骨髓移植模型,体外磁珠分离纯化供鼠CD4+CD25+T细胞,在骨髓移植的同时分别予尾静脉输注CD4+CD25+T细胞、CD4+CD25-T细胞。以移植后生存期、GVHD临床评分、组织病理形态等为观察指标并进行组间比较。结果显示:白血病对照组小鼠平均生存时间为(17.9±0.7)天,均存在白血病细胞浸润;移植对照组及效应T细胞组平均生存时间为(23.2±1.6)天和(22.3±1.9)天,肝脏、皮肤和小肠病理切片显示均存在GVHD病理改变;Treg细胞组小鼠平均生存时间为(47.3±6.5)天,70%的受鼠获得长期存活,病理显示无GVHD及白血病细胞浸润,其GVHD评分较移植对照组及效应T细胞组明显降低(p0.05)。结论:在小鼠allo-BMT中联合输注供体CD4+CD25+T细胞可减少及减轻GVHD,并保留GVL效应。     

体外阻断CD40-CD40L共刺激途径减轻小鼠异基因骨髓移植中移植物抗宿主病的研究

目的在异基因骨髓移植移植物抗宿主病(GVHD)小鼠模型中,观察抗CD40L单克隆抗体(单抗)体外预处理供鼠T细胞输注,观察其减轻GVHD的作用并探讨其作用机制.方法供鼠(C57BL/6H-2b)脾T细胞作为反应细胞,受鼠(BALB/cH-2d)脾细胞作为刺激细胞,分别加抗CD40L单抗或不加单抗进行混合培养,培养第5天的细胞作为经体外诱导后的脾T淋巴细胞,分别混合供鼠骨髓细胞后移植给接受8.0 Gy全身照射预处理的受鼠.比较受鼠GVHD发生和造血重建.在移植后不同时间点采用流式细胞仪检测受鼠脾细胞中T细胞表型的改变,用ELISA法检测外周血血清中Th1和Th2类细胞因子的水平.结果移植后对照组受鼠均于25 d内死于GVHD,实验组GVHD的发生率为20%,与对照组小鼠相比,存活率和存活时间明显增高和延长(P<0.01);存活的实验组小鼠(8只)第40天时骨髓细胞中H-2Db阳性细胞为(93.54±2.32)%.实验组小鼠CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+、CD4+CD69+、CD8+CD25+、CD4+CD40L+和CD8+CD69+T细胞比例明显低于对照组(P<0.05),CD8+CD40L+和CD4+CD45RA+T细胞比例在两组中变化差异无显著性(P>0.05).实验组受鼠血清中细胞因子水平明显低于对照组(P<0.05).结论应用抗CD40L单抗体外孵育的脾T细胞与骨髓细胞混合移植,可明显减少GVHD的发生率,且不影响供鼠造血干细胞的植入,CD4+和CD8+T细胞对异体抗原发生耐受,耐受化T 细胞的活化障碍发生于活化的早期和成熟阶段,同时抑制了Th1和Th2类细胞因子分泌,为抗CD40L单抗应用于临床移植预防GVHD提供了实验依据.     

CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞与急性移植物抗宿主病的关系

背景：CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞具有免疫抑制作用,推测可能减少异基因造血干细胞后急性移植物抗宿主病的发生率。目的：观察粒细胞集落刺激因子动员前后,供者外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞比率变化,并探讨CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞与异基因造血干细胞移植后发生急性移植物抗宿主病的关系。方法：以异基因造血干细胞移植受者90例及其供者为研究对象,供者皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子(5μg/kg),1次/12 h,连续5 d后,采集干细胞;分别于动员前后采集供者外周血,流式细胞仪检测其中CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞含量,及受者接受移植物中此类细胞含量;根据接受CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞数分为高剂量组(细胞比例≥5%)及低剂量组(细胞比例<5%),比较两组移植后急性移植物抗宿主病的发生率。结果与结论：供者在应用粒系集落刺激因子动员前后CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞比例分别为11.3%和1.5%,差异有显著性意义(P<0.05);急性移植物抗宿主病阳性组所接受移植物中该群细胞比例为3.4%,阴性组为15.7%,差异有显著性意义(P <0.05);移植造血重建后高剂量组急性移植物抗宿主病的发生率为18.4%,低剂量组急性移植物抗宿主病的发生率为48.1%,二者差异有显著性意义(P<0.05)。因而,粒系集落刺激因子应用能降低正常人外周血中CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞比例;CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞增加可以降低急性移植物抗宿主病的发生率。     

自然杀伤细胞对异基因骨髓移植中移植排斥和造血及免疫重建的影响

背景:近几年,自然杀伤细胞与异基因骨髓移植的关系备受关注.目的:探讨自然杀伤细胞在小鼠异基因骨髓移植中对移植排斥、造血及免疫重建的影响.方法:以C57BL/6(H-2b)小鼠为供鼠、BALB/c(H-2d)小鼠为受鼠,分别在致死剂量和非致死剂量(≤7.0 Gy)全身照射的预处理条件下进行异基因骨髓移植,移植同时输注供鼠外周T细胞和(或)自然杀伤细胞.结果与结论:在致死剂量全身照射的移植中,输注自然杀伤细胞与不输注自然杀伤细胞的移植组比较,存活率显著增高;白细胞计数、CD19+细胞表达及骨髓CD34+细胞计数恢复快;H-2Kb+细胞的表达水平高.移植后28 d,输注自然杀伤细胞组CD3+细胞表达水平明显低于不输注自然杀伤细胞组,60 d两组比较差异无显著性意义(P＞0.05).在非致死剂量全身照射的移植中,移植30 d,异基因骨髓组H-2Kb+细胞表达百分率明显下降,60 d已下降至移植前水平;而输注高浓度和低浓度自然杀伤细胞的两组在移植后60 d仍能检测到80%以上的H-2Kb+细胞表达.提示,在小鼠异基因骨髓移植中,同种异基因反应性自然杀伤细胞可以抑制移植排斥,提高造血干细胞的植入水平,促进造血及免疫重建并增加移植受鼠的生存率.     

NKG2D及其配体RAE-1、H60在移植物抗肿瘤中的作用

为探讨NKG2D及其配体RAE-1、H60在单倍体相合(haploidentical)造血干细胞移植介导的移植物抗肿瘤效应中的作用,以皮下接种H22细胞的BABL/c×C57BL/6杂交F1代(CB6F1)小鼠为受鼠,以C57BL/6小鼠的骨髓+脾细胞为供者细胞,分别用抗CD90.2、NK1.1和NKG2D单克隆抗体清除供者T细胞、NK细胞和封闭NKG2D受体,进行单倍体相合细胞移植,观察移植后的抗肿瘤效应,并以半定量RT-PCR法检测移植后小鼠肿瘤组织RAE-1、H60的mRNA表达水平。结果发现:清除供者T细胞、NK细胞和封闭NKG2D的移植均导致移植物抗肿瘤效应的下降,MHC单倍体相合细胞移植后肿瘤细胞RAE-1、H60的mRNA表达水平上升。结论:NKG2D及其配体RAE-1、H60在移植物抗肿瘤效应中的起着重要的作用。     

CD4+CD25+Foxp3+T调节细胞与小鼠异基因造血干细胞移植GVHD相关性研究

目的探讨CD4 CD25 foxp3 调节性T细胞与小鼠GVHD发生的相关性。方法取8～10周龄的SPF级CB6F1小鼠(H-2b/d,♀)30只,随机分为正常对照组、同基因移植组和GVHD组,每组10只,正常对照组不接受照射和移植,同基因移植组小鼠照射后接受CB6F1小鼠骨髓细胞(1×107)和脾细胞(3×107),GVHD组小鼠照射后接受C57BL/6(H-2b,♂)小鼠骨髓细胞(1×107)和脾细胞(3×107)。在发生GVHD的时间点检测3组小鼠脾细胞CD4 CD25 T细胞和foxp3 mRNA的表达。结果正常对照组、同基因移植组和GVHD组小鼠脾细胞中CD4 CD25 T细胞的比例分别为(8.47±1.03)%、(15.40±0.80)%和(24.03±0.85)%,均有显著性差异(P<0.01)。GVHD组小鼠脾细胞foxp3 mRNA的表达水平明显低于正常对照组和同基因移植组,有显著性差异(P<0.001)。结论CD4 CD25 foxp3 调节性T细胞与小鼠GVHD发生呈负相关,发生GVHD时小鼠脾细胞中CD4 CD25 foxp3 调节性T细胞明显减低。     

移植物中CD34+细胞及T细胞亚型对HLA相合同胞异基因外周血造血干细胞移植预后的影响

目的 探讨移植物中CD34+细胞及T细胞剂量对HLA相合同胞异基因外周血造血干细胞移植(allo-PBSCT)预后的影响.方法 流式细胞术检测移植物中CD34+细胞,CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T细胞含量,按患者体重计算出移植物中单个核细胞(MNC),CD34+细胞,CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T细胞数量,根据中位数分别将患者分为高剂量组和低剂量组,比较高剂量和低剂量组患者移植后造血重建、移植物抗宿主病(GVHD)、移植相关死亡(TRM)、复发、总体生存(OS)率以及无病生存(DFS)率的发生情况.结果 CD34+细胞高剂量组(34例)移植后中性粒细胞和血小板的恢复速度显著加快(P值均<0.05).CD3+CD4+、CD3+CD8+T细胞高剂量组和相应低剂量组相比,Ⅱ-Ⅳ度aGVHD发生率有增高趋势(P值分别为0.089和0.098).CD3+CD4+及CD3+CD8+T细胞高剂量组和相应低剂量组相比,TRM显著增高(P值均<0.05);多因素分析显示,CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞输注剂量是患者TRM的影响因素(RR分别为13.12和25.90,P值均<0.05).各高剂量组和相应低剂量组比较复发率差异无统计学意义(P值均>0.05).CD3+ CD4+及CD3+CD8+T细胞高剂量组分别和相应低剂量组相比,OS显著降低(P值均<0.05);多因素分析显示,CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞输注剂量是患者OS的影响因素(RR分别为3.71和3.01,P值均<0.05);CD3+CD4+T细胞高剂量组和低剂量组相比,DFS显著降低(P值均<0.05);多因素分析显示,CD3+CD4+T细胞输注剂量(RR=6.91,P=0.011)是患者DFS的影响因素.结论 高剂量CD34+细胞移植可加快移植后造血重建;移植物中高含量的CD3+CD4+及CD3+CD8+T细胞会增加患者TRM,降低OS或DFS.     

非清髓同种异基因小鼠外周血造血干细胞移植模型的建立及其相关研究

目的探讨不同方式异基因外周造血干细胞移植(allo-PBHSCT)后联合供者淋巴细胞输注(DLI)对嵌合率及移植物抗宿主病(GVHD)发病率的影响。方法 C57BL/6受鼠(H-2b)接受全身照射(TBI)预处理后,4 h内分别经尾静脉(IV)或髓腔内(IBM)输注BALB/c小鼠(H-2d)经rhG-CSF动员后的外周造血干细胞3×107个,并予5×106个供鼠DLI,第2天腹腔注射200 mg/kg环磷酰胺。结果移植后第7天各组均为混合嵌合状态,IBM-PBCST-DLI组嵌合率明显高于其他各组;尾静脉移植组均出现不同程度GVHD症状,以IV-PBSCT-DLI组较为显著,而髓腔内移植组均无明显GVHD症状;IV-PBSCT-DLI组CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)比例明显下降,髓腔内移植组则显著升高。结论经rhG-CSF动员后髓腔内注射可以成功建立非清髓性allo-PBHSCT小鼠移植模型,DLI进一步促进了供者嵌合;IBM明显降低了GVHD的发病率,其机制可能与T细胞亚群的改变有关。     

同种反应性自然杀伤细胞在小鼠主要组织相容性复合物半相合骨髓移植中的作用

目的研究同种反应性自然杀伤(NK)细胞在小鼠主要组织相容性复合物(MHC)半相合骨髓移植(BMT)中对宿主粒细胞和T细胞的清除、造血重建、植入及移植物抗宿主病(GVHD)的影响。方法以(C257BL／6×BALB／c)BCF_1(H-2~(d/b+))为供鼠,BALB／c(H-2~d)为受鼠建立小鼠MHC半相合BMT模型。根据照射剂量及NK细胞处理的不同将受鼠分为8．5 Gy对照组及7,6和5 Gy实验组。 8．5 Gy对照组进一步分为单纯照射组和BMT组,7,6及5 Gy实验组均进一步分为单纯照射组、BMT 组、非同种反应性NK(non-alloNK)细胞组及同种反应性NK(alloNK)细胞组。以外周血白细胞和血小板计数、受鼠型粒细胞及T细胞计数、H-2~(d/b+)细胞表达水平以及病理学检查等指标评价同种反应性 NK细胞的预处理作用。结果8．5 Gy单纯照射组生存期为(6．00±0．82)d,其他组生存期均大于60 d,各组均未观察到GVHD的临床及病理学表现;alloNK细胞组造血重建明显快于其他组(P值均< 0．05);移植后1天各照射剂量alloNK细胞组骨髓及脾细胞中受鼠型H-2~(d+)粒细胞和T细胞明显减少, 与相同照射剂量BMT组及non-alloNK细胞组比较差异有统计学意义(P值均<0．05);7,6和5 Gy alloNK细胞组供鼠H-2~(d/b+)细胞植入率显著高于相同照射剂量BMT和non-alloNK细胞组(P值均< 0．05)。结论alloNK细胞在小鼠MHC半相合BMT中具有清除受鼠体内残存粒细胞和T细胞、提高供鼠细胞植入和促进造血重建的作用,且不引起GVHD。     

优化H-2半相合造血干细胞移植物治疗急性白血病的实验研究

目的　探讨H 2半相合造血干细胞移植物中分离移植物抗宿主病 (GVHD)与移植物抗白血病 (GVL)作用的T淋巴细胞阈值。方法　建立 (C5 7BL 6× 6 15 )F1(H 2 b)白血病鼠模型作为受者 ,以C5 7BL 6 (H 2 b)小鼠为供鼠 ,应用免疫磁珠 (MiniMACS)纯化供鼠的CD34+ 和CD3+ 细胞 ,纯度分别为 ( 81.5± 2 .4) %和 ( 95 .4± 2 .9) %。 6 9只受鼠分为 7组 ,A为白血病自然生存组 ,其余各组均经6 0 Co 9GyTBI,除B组单纯TBI外 ,其余各组均经尾静脉输注供鼠CD34+ 细胞 10 5 只 ,D、E、F、G组移植物中还分别混合CD3+ 细胞每只 10 7,5× 10 7,10 8和 1.5× 10 8,饲养 6 0d ,根据病理确定死因。结果　E组 10 0 %存活 >6 0d ,明显长于其它组 (P <0 .0 0 0 1) ;生存 >6 0d者异性染色体为 10 0 %,D、E组因白血病复发死亡者明显少于C组 (P <0 .0 0 1) ,G组因GVHD死亡者明显高于E、F组 (P <0 .0 0 1)。结论　单纯CD34+ 细胞移植组白血病复发率最高。移植物中CD3+ 细胞 >10 8时因GVHD死亡者最多 ;5× 10 7 只时能够分离重度GVHD和GVL。     

HLA单倍体相合造血干细胞移植后外周血树突细胞重建

目的探讨HLA单倍体相合造血干细胞移植（HSCT）后外周血树突细胞（DC）亚群重建的特点和临床意义。方法选择21例HLA单倍体相合的HSCT患者进行研究，12名健康供者作为对照。流式细胞术检测外周血DC亚群重建及其与急性移植物抗宿主病（aGVHD）的关系。结果白血病患者外周血DC、髓样树突细胞（MDC）和髓样树突细胞1型（MDC1）的百分比分别为0．13％、0．05％和0．03％，绝对值分别为7．89×10^6／L、1．52×10^6／L和1．33×10^6／L；健康对照百分比分别为0．76％、0．65％和0．44％，绝对值分别为42．66×10^6／L、35．56×10^6／L和26．70×10^6／L，白血病患者均明显低于健康对照（P＜0．05）。而白血病患者髓样树突细胞2型（MDC2）、浆样树突细胞（PDC）的百分比分别为0．01％和0．07％，绝对值分别为0．15×10^6／L和2．60×10^6／L；健康对照百分比分别为0．44％和0．14％，绝对值分别为2．40×10^6／L和8．50×10^6／L，两组比较，差异无统计学意义（P＞0．05）；MDC／PDC比值明显减低（P=0．001）。移植后14天（＋14天）MDC1、MDC2及PDC绝对值分别为1．45×10^6／L、0．32×10^6／L和1．60×10^6／L，达到患者移植前水平，但＋100天内均未能恢复正常水平；MDC／PDC比值＋14天（1．40）与移植前（0．50）相比，差异有统计学意义（P=0．024），至＋30天恢复正常（P=0．602）。＋14天高PDC、DC组和低MDC／PDC比值组Ⅱ～Ⅳ度aGVHD的累计发生率较低PDC、DC组和高MDC／PDC比值组明显增高（P＜0．05）。结论白血病患者移植前外周血DC百分比、绝对值及MDC／PDC比值均减少；移植后MDC／PDC比值恢复较快，＋30天恢复正常，其他指标恢复较慢，＋100天内均未恢复正常；且恢复情况与aGVHD相关。     

供者活化型KIR2DS5在单倍体相合造血干细胞移植预后中的意义

本研究探讨供者杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）和受者人类白细胞抗原（HLA）基因型在单倍体相合造血干细胞移植（HSCT）预后中的意义。26例患者接受单倍体相合HSCT,均未进行体外T细胞去除（TCD）。采用序列特异性引物聚合酶链式反应（PCR-SSP）分型技术对供、受者HLA和供者KIR基因型进行检测。根据供者KIR和受者HLA-Bw4组、-C1组、-C2组等位基因分析结果进行供受者KIR/HLA分组。对KIR/HLA不合与相合组、Bw4不合与相合组、C2不合与相合组、Bw4和C2均不合组与至少其一相合组在造血重建、移植物抗宿主病（GVHD）、无病生存（DFS）、移植后感染及移植相关死亡（TRM）等方面的差异进行比较;并就供者活化型KIR对单倍体相合HSCT预后的影响进行评价。结果表明：各组在造血重建、急性或慢性GVHD发生率、DFS、移植后感染及TRM等方面均无显著性差异（p均〉0.05）,但C2不合组发生严重GVHD4例。供者活化型KIR2DS5阳性组2年DFS明显优于阴性组,分别为（85.7±13.2）%、（31.2±12.8）%,p〈0.05〕。结论：供者KIR及受者HLA基因型对单倍体相合HSCT预后有影响,供者携带活化型KIR2DS5可能有助于提高患者的DFS。     

低剂量氟达拉滨、环磷酰胺联合供者NK细胞作为非清髓性预处理用于小鼠单倍相合造血干细胞移植

本研究探讨低剂量氟达拉滨、环磷酰胺联合供者异体反应性NK细胞(flu cy allo-NK)作为新的非清髓性单倍相合造血干细胞移植(haploidentical HSCT)预处理方案的可行性。利用免疫磁珠富集F1供鼠(H-2d/b)脾脏NK细胞,检测其中Ly49C 、Ly49A 细胞的比例;LDH法检测其异体反应性。建立小鼠单倍相合造血干细胞移植模型,并比较清髓性方案(9 Gy TBI)、各种非清髓性方案(6.5 Gy TBI,flu cy,及flu cy allo-NK)的体内清髓效果、移植后供者嵌合率、GVHD的发生率及严重程度。结果表明:与其他非清髓性预处理方案相比,flu cy allo-NK组不能增加清髓程度,但可显著提高单倍相合移植后的供者嵌合率,移植后21天的嵌合率在骨髓为(28.70±5.90)%,脾脏为(46.40±5.00)%,并持续2个月。与flu cy组相比,flu cy allo-NK组出现的GVHD反应轻微,仅有50%(5/10)受鼠出现体重减轻,flu cy allo-NK组小鼠的肝脏、小肠、肾脏及皮肤的病理切片均未见明显的组织损伤。结论:供者allo-NK具有促进单倍相合供者造血干细胞植入,减轻GVHD强度的作用;低剂量flu cy allo-NK方案为高龄和一般情况差的肿瘤患者开展单倍相合造血干细胞移植提供了新的途径。     

同种反应性自然杀伤细胞对小鼠单倍体相合骨髓移植后免疫重建的影响

本研究旨在探讨同种反应性自然杀伤(alloNK)细胞对小鼠单倍体相合骨髓移植(BMT)后免疫重建的影响。以(C57BL/6×BALB/c)BCF1(H-2d/b)为供鼠,BALB/c(H-2d)为受鼠,建立小鼠单倍体相合BMT模型,根据回输物不同将实验分为单纯BMT组、非同种反应性NK(non-alloNK)细胞组、alloNK细胞组。移植后2个月以胸腺组织病理、脾脏NK细胞比例、脾细胞增殖反应及脾细胞培养上清中细胞因子浓度等指标评价alloNK细胞对免疫重建的影响。结果显示,光学显微镜下各组小鼠胸腺组织病理学表现无明显差别;移植后2个月non-alloNK组小鼠脾脏NK细胞比例显著低于单纯BMT组(P<0.05);各组小鼠脾细胞体外增殖反应无明显差别;alloNK组小鼠脾细胞培养24和48 h时培养上清中干扰素-γ的浓度均显著低于其他2组(P<0.05),而各组之间白介素4水平无明显差别。结论:alloNK细胞用于单倍体BMT小鼠不损伤胸腺的结构,可能诱导Th2免疫反应的偏移。     

体外阻断CD137-CD137L途径控制小鼠移植物抗宿主病的研究

目的探讨体外阻断活化的供鼠T淋巴细胞CD137-CD137L共刺激途径控制小鼠异基因骨髓移植（allo-BMT）后急性移植物抗宿主病（aGVHD）及其机制。方法供、受鼠的淋巴细胞体外混合培养，分别加入抗CD137L单抗或不加抗CD137L单抗培养后与供鼠骨髓细胞混合移植给受鼠。采用流式细胞术检测移植后受鼠T细胞亚群的变化，RT-PCR法检测细胞因子mRNA表达水平的变化，观察移植后受鼠GVHD的临床及病理改变。结果与未用抗CD137L单抗组相比，应用抗CD137L单抗组CD3^＋CD8^＋T细胞明显降低（P＜0．01）；IFN-γ表达水平明显减低（P＜0．01），IL-10的表达水平明显升高（P＜0．01）。移植后未预防GVHD组（A组）小鼠移植后15d内均死于aGVHD。采用甲氨蝶呤＋环孢素预防GVHD组（B组）小鼠100％发生aGVHD，但临床及病理改变程度较A组轻，平均存活时间[（9．5±2．5）d]较A组[（7．5±1．5）d]略有延长。采用抗CD137L单抗预防GVHD组（C组）受鼠aGVHD的发生率为70％，程度比A、B两组轻，与A、B两组相比生存率明显提高（P＜0．01），平均存活时间[（16．0±2．5）d]明显延长（P＜0．01），30％的小鼠生存时间大于30d。结论抗CD137L单抗体外阻断CD137-CD137L共刺激途径能有效控制小鼠GVHD，可能与影响Ⅰ类和Ⅱ类T细胞因子平衡有关。     

供体NK细胞在白血病小鼠半相合骨髓移植中的作用

目的 观察供体NK细胞在白血病小鼠半相合骨髓移植中的作用.方法 建立荷EL9611(H-2d)红白血病细胞的CB6F1H-2b/d小鼠动物模型,5 d后随机分为7组,每组10只,移植组在9Gy照射后行C57BL/6H-2b/d→CB6F1H-2b/d骨髓移植.对照组共有5组,对照1组为未治疗组;对照2组为单纯照射组;对照3组为阿糖胞苷治疗组(小鼠腹腔注射阿糖胞苷每只50 mgg/kg×6 d);对照4组为单纯骨髓细胞移植组(小鼠照射后4 h移植C57BL/6H-2b/d小鼠骨髓细胞);对照5组为移植物抗宿主病(GVHD)对照组(小鼠照射后4 h移植C57BL/6H-2b/d小鼠骨髓细胞和脾细胞).实验组共有2组,实验1组:照射后输注C57BL/6H-2b/d小鼠NK细胞1×106/只,4 h后移植C57BL/6H-2b/d小鼠骨髓细胞;实验2组:照射后处理同实验1组,4 h后移植C57BL/6H-2b/d小鼠骨髓细胞和脾细胞.以血象、体重、生存期和病理组织学变化为观察指标并作组间比较.结果 对照1、2、3、5组小鼠生存期分别为(10.1±0.9)d、(9.8±0.9)d、(22.7±3.2)d、(20.1±1.7)d,对照4组为(30.1±16.O)d,其中2只小鼠生存期超过30d;实验1、2组生存期分别为(39.1±18.1)d、(49.3±17.2)d,实验1组4只小鼠超过30 d,实验2组7只超过30 d,其中实验1组同对照1…2、3、5组比较差异均有统计学意义(P<0.01),实验2组同其他组比较差异均有统计学意义(P<0.05).死于白血病的小鼠可见肝脾明显肿大,结构破坏,有大量白血病细胞浸润.实验组长期存活的小鼠出现Y染色体(嵌合率80%～90%).结论 利用荷EL9611(H-2d)红白血病细胞CB6F1H-2b/d小鼠模型,从C57BL/6H-2b/d→CB6F1H-2b/d方向移植模型上,证明供者NK细胞具有杀灭白血病细胞及降低GVHD的双重作用.