婴儿双歧杆菌/胞嘧啶脱氨酶肿瘤靶向性基因治疗系统的构建(英文)

目的构建婴儿双歧杆菌/胞嘧啶脱氨酶靶向性基因治疗系统。方法 PCR 扩增 CD 基因,EcoR Ⅰ,BamH Ⅰ对 CD 基因和 pGEX-1LamdaT 质粒同时进行双酶切,获得4.9 kb、1.3 kh 两个 DNA 片段。T4 DNA 连接酶连接这两个片段构建重组的CD/pGEX-1LamdaT 质粒,然后用电穿孔法将重组质粒转染婴儿双歧杆菌。从阳性转染的婴儿双歧杆菌中提取重组质粒,双酶切后检测切取片段长度,采用 Sanger 双脱氧链终止法对提取的重组质粒中的插入片段进行测序。结果从阳性转染的婴儿双歧杆菌中获得了6.2 kb大小的重组质粒,该质粒经双酶切后,得到了4.9 kb 和1.3 kb 两个长度的片段,其长度分别与 pGEX-1LambdaT 及 CD 基因的长度相同。测序结果显示,提取的重组质粒中插入的基因片段全长及核苷酸序列与 CD 基因完全相同。结论外源性 CD 基因被准确插入 pGEX-1LambdaT 质粒并转入婴儿双歧杆菌中,婴儿双歧杆菌/胞嘧啶脱氨酶靶向性基因治疗系统被成功构建。     

人类Survivin基因真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达

 目的　构建带有绿色荧光蛋白的Survivin基因真核表达载体pIRES2-EGFP／Survivin,并转染K562细胞。方法　以 pDNR／Survivin质粒为模板,PCR扩增Survivin基因,T-A 克隆,亚克隆至pIRES2-EGFP上,并对重组表达载体进行酶切、测序鉴定。采用Superfect转染试剂转染K562细胞。提取细胞RNA,RT-PCR检测Survivin基因mRNA表达。结果　经限制性酶切鉴定及测序分析证实pIRES2-EGFP／Survivin载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的K562细胞有绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR证实转染细胞中存在Survivin基因mRNA的表达。结论　pIRES2-EGFP／Survivin表达载体构建成功,并在K562细胞内成功表达。     

婴儿双歧杆菌/胞嘧啶脱氨酶肿瘤靶向性基因治疗系统的构建

目的 构建婴儿双歧杆菌/胞嘧啶脱氨酶肿瘤靶向性基因治疗系统。方法 PCR扩增胞嘧啶脱氨酶(CD)基因，TSS法在大肠杆菌，M109中扩增pGEX-1LambdaT质粒。EcoRⅠ和BamHⅠ对CD基因和pGEX-1LambdaT质粒分别进行双酶酶切。琼脂糖电泳凝胶分离并切取其中4．9kb和1．3kb两个片段长度的凝胶。凝胶DNA提取试剂盒提取其中所含的DNA片段，T4DNA连接酶连接这两个片段，最后用电穿孔法将重组片段转染婴儿双歧杆菌，并挑选阳性菌落，提取质粒双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳检测。结果 应用电穿孔法转染婴儿双歧杆菌，获得含6．2kbp重组质粒的阳性转染婴儿双歧杆菌。结论 成功构建婴儿双歧杆菌/胞嘧啶脱氨酶肿瘤靶向性基因治疗系统。     

分泌型核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

目的构建分泌型核心蛋白聚糖(decorin)真核表达载体,并在肝癌细胞HepG2中表达,为研究核心蛋白聚糖的抗肿瘤作用奠定基础。方法利用特异性引物,应用PCR技术扩增核心蛋白聚糖全长基因cDNA片段,与pcDNA3.1载体进行连接,并转化到大肠杆菌JM109中扩增以获得重组载体,应用双酶切、PCR以及测序鉴定此重组载体;脂质体介导重组载体转染HepG2,经G418筛选建立稳定转染细胞株,分别采用RT-PCR、免疫组化法和westernblot检测其表达。结果获得了约1080bp大小的特异性DNA片段;PCR产物与真核表达载体进行连接,经过双酶切、PCR以及测序鉴定证实分泌型核心蛋白聚糖cDNA片段正确插入真核表达载体pcDNA3.1中。RT-PCR方法可见转染组mRNA表达明显增多,免疫组化和westernblot方法可见转染组细胞decorin蛋白表达明显增高。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-decorin,建立了稳定转染decorin的HepG2细胞株。     

T淋巴瘤TOCRVβ核酸疫苗的构建和生物学活性的初步检测

T淋巴瘤是某种重排的T细胞恶性增殖的结果,这种恶性增殖T细胞上特异的TCR可以看作肿瘤特异性或相关抗原.本研究目的是制备T淋巴瘤TCRVβ核酸疫苗,诱导机体产生针对恶性增殖的T细胞克隆的免疫反应.从人T淋巴瘤细胞Jurkat中提取总RNA.合成cDNA.根据Jurkat细胞TCRVβ的基因序列设计引物,用PCR扩增TCRVβ的基因片段.PCR产物和表达载体pcDNA3经KpnⅠ和BamHⅠ双酶切后,回收酶切片段,用T_4 DNA连接酶连接.连接产物转化E.Coli DH5a,筛选阳性克隆,提取质粒,进行双酶切鉴定.大量提取双酶 切鉴定为正确的重组载体pcDNA3-TCRVβ,PEC法纯化后测序.用磷酸钙沉淀法将重组载体转染SP2/0细胞,24h后加200μg/ml G418筛选培养,挑取阳性克隆扩     

分泌型人白细胞介素18重组质粒的构建及其真核表达

目的：构建带IL—12 P40信号肽序列的分泌型IL—18质粒，使其在真核细胞中稳定表达。方法：根据IL—12 P40的信号肽cDNA序列及人成熟IL—18序列设计4条特异性引物，用RT—PCR法自人树突状细胞中分别扩增IL—12 P40信号肽序列(片段A)及成熟IL—18基因(片段B)，用重叠延伸PCR法拼接和扩增融合基因(片段C)，连接制备pGEM—T克隆载体，亚克隆至pcDNA3．1^ 。转染NCI—H460人肺癌细胞株，经RT—PCR和Western blot检测IL—18的表达。结果：表达质粒的酶切图谱符合预期的结果，测序结果与预期的cDNA序列完全一致，转染细胞株表达了IL—18。结论：成功地构建了含IL—12 P40信号肽序列的IL—18表达质粒，并在人肺癌细胞株中得到了表达。     

VEGF165-PE38重组免疫毒素真核表达载体的构建及表达

目的构建血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因和铜绿假单胞菌外毒素衍生物（PE38）基因的真核融合表达载体,研究其在HEK293细胞中的表达情况。方法通过PCR获得实验需要的VEGF165基因片段,通过酶切pRB391质粒获得铜绿假单胞菌外毒素衍生物PE38基因,再通过适当的酶切及连接反应,构建VEGF165与PE38融合基因的真核表达载体pIRES2-VEGF165-PE38-EGFP,重组质粒经限制性内切酶及DNA序列测定证实构建成功后,用Lipofectamine2000脂质体转染HEK293细胞,然后用RT—PCR及ELISA法检测VEGF165-PE38融合蛋白在HEK293细胞的表达。结果酶切分析及DNA序列测定证实,VEGF165-PE38融合基因被成功克隆入真核表达质粒载体pIRES2-EGFP,RT—PCR及ELISA法检测证实重组基因可在HEK293细胞表达。结论VEGF165-PE38融合基因可在HEK293细胞中表达,为进-步研究其对肿瘤血管内皮细胞的靶向毒性及临床应用奠定基础。     

PcDNA3.1-Tum-5基因真核表达载体的构建

构建携带Tum-5基因真核表达载体PcDNA3.1-Tum-5.方法 利用巢式PCR扩增人胚肾细胞株HEK293 cDNA获得Tum-5基因,并利用DNA回收试剂盒进行回收;同时扩增、提取pcDNA3.1质粒,并将其与Tum-5基因分别进行EcoRV和XhoI双酶切,回收相应条带,通过T4DNA连接酶进行连接,转化DH5α感受态细胞,获得阳性克隆.获得质粒DNA后行KpnI和XhoI双酶切,克隆并测序酶切产物.结果 巢式PCR扩增出的产物与目的 基因大小相同;重组质粒经双酶切电泳分析,与预期结果一致;对连接点两端进行测序,结果显示接头两端序列连接正确,插入序列与载体读码框架相匹配.结论 本方法可以成功构建人Tum-5基因表达载体,为进一步研究Tum-5基因功能提供了理论依据.     

Survivin靶向microRNA表达载体的构建和鉴定

目的：设计并构建Survivin靶向的microRNA表达载体，观察其对Survivin基因的抑制作用。方法：以Survivin为靶基因，根据pPRIME载体要求，设计针对Survivin的microRNA序列，PCR扩增获得目的片段并克隆到载体中，序列正确的载体脂质体转染Hela细胞，RT—PCR和Western blotting检测其对Survivin的抑制作用。结果：用Xho I和EcoR I双酶切鉴定、DNA测序证实构建的microRNA表达载体序列正确，后者在mRNA和蛋白水平上均能明显抑制Hela细胞中Survivin的表达。结论：Survivin靶向microRNA表达载体构建成功，并能抑制靶基因的表达，为其在肿瘤基因治疗中的应用奠定了基础。     

GM-CSF基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）基因的重组腺病毒载体，为进一步研究GM-CSF基因在肿瘤基因治疗中的应用提供实验基础。方法：采用PCR方法，从重组质粒pcDNA3．1-GM-CSF扩增出GM-CSF基因片段，通过穿梭质粒pShuttle，将带有CMV启动子的目的片段克隆入Adeno-X腺病毒DNA中，获得重组腺病毒DNA，通过脂质体转染HEK293细胞，经包装扩增后，获得重组腺病毒Adeno-X-GM-CSF，PCR鉴定，ELISA法检测表达产物。结果：含GM-CSF基因的重组腺病毒Adeno-X-GM-CSF构建成功，经PCR鉴定和DNA测序等证实了其正确性，重组腺病毒上清液中GM-CSF表达量达26ng／mL。结论：含GM-CSF基因的重组腺病毒构建成功。