大鼠ferroportin 1过表达慢病毒载体构建及其转染PC12细胞

目的:构建含大鼠ferroportin 1(FP1,膜铁转运蛋白1)基因和EGFP(绿色荧光蛋白)基因的过表达慢病毒载体并转染PC12细胞。方法:化学合成含有目的基因FP1的质粒,将酶切获得的目的基因连接入线性化慢病毒载体,构建重组质粒PGC-FU-FP1并进行测序鉴定;鉴定正确的阳性克隆采用Lipofectamine2000转染293T细胞,通过荧光显微镜和Western Blot检测FP1表达情况;在脂质体介导下将PGC-FU-FP1、pHelper1.0和pHelper2.0三质粒系统共转染入293T细胞,包装产生慢病毒,并通过实时荧光定量PCR法检测病毒滴度。以重组慢病毒载体质粒PGC-FU-FP1转染PC12细胞,荧光显微镜下观察EGFP的表达,实时荧光定量PCR和Western Blot法分别检测FP1mRNA和蛋白表达情况。结果:FP1基因序列经测序后与GeneBank报道的序列完全一致;重组质粒PGC-FU-FP1中携带有正确的FP1基因并能在293T细胞中表达;病毒滴度为2×108TU/ml。荧光显微镜、实时荧光定量PCR和Western Blot法证实目的基因FP1能被重组慢病毒高效导入PC12细胞并得到过表达。结论:成功构建携带FP1基因的慢病毒载体,并获得FP1基因修饰的PC12基因工程细胞。为进一步研究FP1在帕金森病中的作用及基因治疗奠定基础。     

FasL基因重组慢病毒载体感染SD大鼠树突状细胞的研究

目的 探讨FasL基因重组慢病毒载体感染SD大鼠树突状细胞的效率和FasI 蛋白的表达情况,为进一步研究转FasL基因在同种异体器官移植中诱导免疫耐受和保护移植物打下基础.方法 将培养一周的细胞重铺于六孔板中,每孔细胞数量为5×105,24 h后观察,细胞适合感染,按照MOI=10感染细胞,使用GFP阳性对照质粒作对照实验,感染24 h后,培养皿中添加1 ml新鲜培养基,每隔1 d加细胞因子继续培养,荧光显微镜观察荧光强度和数量,添加病毒液后10 d收集细胞进行实时定量检测和WB检测.结果 FasL基困重组慢病毒载体感染DC 8 d后,细胞开始出现荧光,10 d感染效率为100%;实时定量PCR检测瞬时转染后目的 基因的表达显示以细胞的1.00%为参照,Cell+FasL质粒为167.03%;免疫印迹检测转染后FasL蛋白的表达显示以细胞的1.00%为参照,细胞+FasL质粒为34.15%.结论 FasL基因重组慢病毒载体成功感染DC,实时定量PCR及Western印迹证实感染的Dc表达FasL明显提高.为进一步研究转FasL摹因在同种异体器官移植中诱导免疫耐受和保护移植物打下基础.     

表达丙型肝炎病毒核心蛋白的人肝癌稳定转染细胞株的建立与鉴定

目的建立能表达丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV core)的人肝癌细胞SMMC-7721的稳定转染细胞株。方法构建含目的基因HCV core的重组质粒,转染HEK293T细胞,包装获得含ZsGreen和HCV core基因的慢病毒后,感染SMMC-7721人肝癌细胞,采用实时荧光定量PCR检测HCV core mRNA表达,采用免疫荧光细胞化学染色和Western blot法检测HCV core蛋白表达,筛选稳定表达HCV core的细胞株。结果质粒酶切和序列测定证实重组载体构建正确;慢病毒包装48 h后可见清晰ZsGreen表达,感染SMMC-7721细胞后筛选获得稳定转染的细胞株,实时荧光定量PCR检测到HCV core mRNA,免疫荧光细胞化学染色和Western blot法均检测出HCV core蛋白表达。结论成功构建了表达HCV core蛋白的SMMC-7721人肝癌细胞的稳定转染细胞株。     

H5N1禽流感病毒HA假病毒的构建及特性研究

目的 构建包膜蛋白为H5N1禽流感病毒HA蛋白的假病毒,对其生物学特性进行研究,并将其初步应用于H5N1禽流感病毒的血清检测.方法 将我国分离的高致病性H5N1禽流感病毒的HA基因插入真核表达质粒,得到pLP-HA,与假病毒构建体系的三种质粒pLP1,pLF2和pEmGFP,瞬时共转染人胚肾细胞293T,48 h收集假病毒上清,对其感染性,血凝活性进行测定,并应用于微量中和实验.同时,构建了优化HA基因的假病毒以及一株含有越南禽流感病毒HA基因的假病毒,进行比较.结果 电镜下观察到假病毒颗粒的存在;Western-Blot表明HA蛋白存在于假病毒颗粒中;HA假病毒与野生型活病毒的微量中和实验相比,两者结果具有很好的相关性.结论 成功构建了不同高致病性H5N1禽流感病毒HA蛋白的假病毒,所构建的假病毒可以应用于微量中和实验.研究发现不同禽流感病毒株HA蛋白假病毒的包装效率不同,并且真核表达优化基因并不能显著提高假病毒颗粒包装效率.     

荧光定量PCR用于重组杆状病毒鉴定及病毒滴度检测的研究

目的：建立一种高效、简便的荧光实时定量PCR方法,用于重组杆状病毒鉴定及病毒滴度的检测.方法：利用Bac-to-Bac载体系统在E.coli菌株DH10 Bac中构建重组杆状病毒穿梭质粒（Bacmid）和在昆虫细胞中构建含人IL-18基因的重组杆状病毒,纯化的重组Bacmid作为PCR检测的标准模板,由昆虫细胞中收获的病毒母液用于空斑测定和病毒DNA提取.以10倍梯度稀释的重组Bacmid作为标准模板,进行荧光定量PCR扩增IL18基因片段并绘制标准曲线,然后以提取的重组杆状病毒DNA作为模板,采用同样体系进行实时PCR反应检测.同时,以琼脂糖空斑法测定病毒母液的滴度.结果：成功构建了重组杆状病毒并建立了病毒滴度的实时荧光PCR检测方法.运用标准模板进行的PCR反应显示该方法的线形范围为101～108拷贝,病毒母液的DNA拷贝浓度（vg/ml）值约为空斑检测的滴度pfu/ml值的10倍.结论：荧光定量PCR方法可灵敏快速地鉴定重组杆状病毒,并在较大的线性范围内检测重组杆状病毒滴度,较之空斑法更准确地反映了重组杆状病毒的实际数量.     

基于H5N1假病毒的体内中和试验模型的建立

目的建立H5N1假病毒的体内感染模型, 并对抗体FHA3的体内中和活性进行鉴定。方法依据A/Anhui/1/2005/H5N1毒株血凝素(hemagglutinin, HA)和神经氨酸酶(neuraminidase, NA)的序列信息, 构建重组表达质粒pcDNA3.1-HA5和pcDNA3.1-NA1, 并与质粒pNL4-3.Luc.R-E-共转染293T细胞制备H5N1假病毒上清, 电镜观察上清中假病毒颗粒形态。假病毒上清感染MDCK细胞后, 测定病毒滴度;经腹腔注射入BALB/c小鼠体内, 在感染后2、5、8、12 d进行生物发光成像, 检测假病毒体内感染情况。利用建立的小鼠感染模型, 评价抗体FHA3的体内功能活性。结果重组表达质粒pcDNA3.1-HA5和pcDNA3.1-NA1构建正确, 与pNL4-3.Luc.R-E-质粒共转染293T细胞可制备出高滴度的假病毒上清, 电镜下可见圆形的病毒颗粒。H5N1假病毒感染后, 小鼠体内发出较强的荧光, 而攻毒前给予抗体FHA3处理可减弱其荧光信号。结论成功构建出H5N1假病毒体内感染模型, 并证实抗体FHA3对假病毒的感染具有体内...     

反转录酶活性检测实时荧光定量PCR方法的建立

目的 在传统产物增强性反转录酶(PERT)活性检测方法基础上建立检测反转录酶活性的实时荧光定量PCR方法.方法 以噬菌体MS2 RNA为模板,设计、合成引物和探针,并分别以连续10倍倍比稀释的AMV反转录酶(1×10-1～1×10-9 U/μl)标准品催化体外反转录反应合成相应cDNA.采用实时荧光定量PCR法检测底物cDNA模板量,并获得相应的PCR荧光值曲线,分析AMV反转录酶的相对活性.同时应用传统PERT方法对cDNA进行扩增,测定该方法的灵敏度.结果 将AMV反转录酶标准品连续10倍倍比稀释后催化反转录反应,实时荧光定量PCR分析所得的反转录产物cDNA,结果得到与理论值完全相符合的PCR标准荧光值曲线;定量分析结果显示,浓度为1×10-2～1×10-8U/μl的AMV反转录酶均可得到相应的荧光值.不同稀释度的AMV反转录酶,经传统PERT方法扩增后,结果显示浓度为1×10-3～1×10-7 U/μl的AMV反转录酶均可见大小为112 bp的阳性条带,检测灵敏度达到1×10-7U/μl.结论 成功建立了基于实时荧光定量PCR技术的检测反转录酶活性的新方法,实验操作简单,具有高精确性和无污染性,为生物制品外来污染尤其是反转录病毒污染的检测提供了参考指标.     

携带绿色荧光蛋白基因的单轮感染活性HIV假病毒的建立及其活性检测

目的构建携带绿色荧光蛋白基因的HIV假病毒载体,并研究该载体包装的HIV假病毒的感染活性,为进一步进行HIV生物学研究与中和抗体实验室评价搭建安全的技术平台.方法将增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因插入到骨架质粒pNL43 Luc R-E-的nef基因读码框,获得携带EGFP基因的质粒pNL43 EGFP R-E-;通过将pNL43 EGFP R-E-与编码HIV膜蛋白的质粒共转染293T细胞,收集上清,获得携带EGFP基因的HIV假病毒.该假病毒感染CD4^＋CCR5^＋的HOS细胞后可表达绿色荧光,这样通过流式细胞仪可测定表达绿色荧光的细胞数与细胞感染率.结果携带绿色荧光蛋白基因的HIV假病毒感染CD4^＋CCR5^＋的HOS细胞后,被感染的细胞可以表达绿色荧光蛋白,细胞的感染率与病毒加入量呈线性关系.结论获得了携带绿色荧光蛋白基因的HIV假病毒载体,并建立了具有单轮感染活性的HIV假病毒感染的检测方法.     

狂犬病病毒核蛋白及糖蛋白在杆状病毒表达系统中的共表达及鉴定

目的 利用杆状病毒表达系统共表达狂犬病病毒CTN-1V株核蛋白(nucleoprotein,NP)及糖蛋白(glycoprotein,GP).方法 RT-PCR分别扩增CTN-1V株病毒GP、NP编码区基因,分别依次克隆入转移质粒pFastBacDual的PP10区及PPH区构建杆状病毒重组转移质粒P-NG,转化DH10Bac E.coli感受态细胞获得重组穿梭质粒A-NG,转染Sf9细胞获得重组杆状病毒Bac-NG,高效表达目的蛋白NP、GP,进行Western blot分析.结果 重组杆状病毒穿梭质粒A-NG经PCR鉴定证明构建正确;狂犬病病毒NP、GP在重组杆状病毒感染的Sf9细胞中获得正确表达,表达的重组蛋白NP、GP相对分子质量(Mr)约为51×103、59×103;表达的重组蛋白NP、GP均可与抗RV小鼠血清特异性结合.结论 成功共表达狂犬病病毒CTN-1V株NP、GP,表达产物具有良好的抗原性,为狂犬病病毒基因工程疫苗及诊断试剂的研究奠定了基础.     

慢病毒介导的H7N9禽流感病毒血凝素基因快速真核表达系统的建立

目的利用慢病毒载体构建新型H7N9禽流感病毒血凝素(HA)基因的快速真核表达体系,在人胚肾细胞(HEK293T)中表达并进行功能鉴定。方法提取H7N9禽流感病毒基因组RNA,采用反转录PCR技术扩增HA读码框全长基因,将HA基因连接pMD18-T载体构建pMD18-T-HA重组载体。设计含Kozak序列的引物从pMD18-T-HA质粒中扩增出平末端HA基因,采用Topo克隆构建表达载体pLenti-HA-V5。将表达载体转染HEK293T细胞,通过间接免疫荧光法(IFA)和Western blot法鉴定HA蛋白的表达,通过血凝实验鉴定重组蛋白的生物学活性。结果经反转录PCR获得1 683 bp的HA全长基因,完成真核表达载体的构建并表达出相对分子质量(Mr)为70 000的重组蛋白。IFA和Western blot法结果显示该蛋白与阳性血清具有良好的免疫反应,同时血凝实验证实其具有血凝活性。结论成功利用慢病毒载体建立了HA蛋白的快速真核表达系统,为研制H7N9病毒亚单位疫苗、中和表位研究、假病毒包装奠定基础。     

单核细胞乙型肝炎病毒cccDNA检测方法及应用价值

目的 建立检测HBV共价闭合环状DNA（ cccDNA）的巢式-荧光定量PCR法,检测外周血单核细胞（ PBMC）及骨髓单核细胞（MMNC）中cccDNA。方法 根据HBV cccDNA与松弛结构DNA（rcDNA）结构上的差异,设计2对跨缺口的特异性引物及下游的特异性TaqMan探针。根据Mung Bean Nuclease对rcDNA与cccDNA作用的不同,使cccDNA扩增而使rcDNA降解,分别用外引物及内引物进行PCR反应,再用荧光探针进行实时荧光定量PCR,根据阳性参照物,计算出检测标本定量值。结果 成功建立了HBV cccDNA巢式-荧光定量PCR的检测方法,线性范围为5.0× 10２～3.9×107拷贝/ml。用上述方法检测25例慢乙肝及肝硬化血清HBV DNA阳性患者外周血单核细胞中cccDNA,7例骨髓单核细胞中cccDNA,21例健康献血者外周血单核细胞中cccDNA,骨髓标本中有3例cccDNA阳性,25例外周血标本中有9例cccDNA阳性。结论 巢式-荧光定量PCR法可检测乙肝患者PBMC及MMNC中的HBVcccDNA含量。PBMC及MMNC中可检测到HBVcccDNA.     

肾移植后BK病毒感染者实时荧光定量PCR检测

背景：对于BK病毒感染、BK病毒相关性肾病的认识缺乏规范的实验室诊断程序和标准化的无创性检验方法。 目的：建立肾移植后患者尿液和外周血BK病毒感染负荷实时荧光定量PCR检测方法。 方法：针对BK病毒基因组,自主设计特异性引物BKV-F和BKV-R,Taqman荧光探针BKV-P,Taqman荧光探针BKV-P的5’端标记有荧光基团,在除5’端外的任意一个位置上标记有淬灭基团;然后处理待测样本,进行PCR反应。 结果与结论：将检测阳性的扩增产物进行基因测序,测序结果经BLAST比对后证实为BK病毒基因序列;利用上述方法对56份样本进行检测,其中,20份BK病毒血清样本及20份BK病毒尿液样本检测均为阳性,有S型扩增曲线。动态范围测定显示在103~1010 copies/mL之间标准曲线具有良好的相关性。5份健康人尿液样本,5份血液样本及6份临床常见的其他病原体血液样本检测均为阴性,无S型扩增曲线。结果表明该方法可进行定性、定量检测,特异性好,反应快速,一般30 min即可得到反应结果,并且成本低、假阳性少。     

聚合酶链反应检测致瘤性人类疱疹病毒6型方法的建立及应用

目的　建立致瘤性人类疱疹病毒 6型 (HHV 6 )荧光定量聚合酶链反应 (FQ PCR)检测方法 ,为快速、准确地定量检测HHV 6奠定基础。方法　根据HHV 6型基因序列 ,设计并合成引物、荧光标记探针。先用特异性引物筛选HHV 6 ,其PCR片段克隆入载体 ,再对重组质粒进行筛选、测序及鉴定。确证后的HHV 6DNA片段制成标准品并作为阳性模板 ,开发HHV 6FQ PCR检测系统。用该系统测定研究样品。结果　重组质粒获得的HHV 6DNA产物经 1∶10梯度稀释后 ,制作定量曲线的循环阈值 (Ct)与模板浓度具有良好的线性关系 ,相关系数为 0 99。经本反应系统检测的临床标本共135份 ,检测到 16份HHV 6DNA阳性。结论　建立了检测致瘤性HHV 6的FQ-PCR方法 ;此方法较定性PCR技术更为简便、快速、准确 ,且具有很好的应用前景和推广价值     

Real-time PCR检测风疹病毒方法学建立及临床应用

为了建立一种能广泛应用于临床快速、简便、灵敏度和特异性较好的风疹病毒(RV)定量诊断方法。针对RV基因保守序列设计两对引物和一条荧光双标记探针。将PCR扩增所得到的产物片段克隆,作为定量检测的标准品,进行Real-time PCR检测,绘制标准曲线。将此方法和ELISA试剂盒平行检测50份孕妇血清,评估两种方法检出阳性率的差异显著性。Real-time PCR法能较好地检出RVcDNA载量。曲线的相关系数(r)为0.998,可检测线性范围大约在103~109copies/μl,灵敏度接近103copies/μl;批间、批内CV值分别为3.36%、0.94%;也有较好的特异性。与经典的ELISA方法相比,有显著性差异。Real-time PCR方法操作简单、快速,并能避免PCR后处理导致的假阳性污染,实现实时定量。此方法对RV感染的临床诊断和疗效判断等方面有较大的指导意义。     

实时荧光PCR快速检测嗜肺军团菌的研究

目的 建立TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测嗜肺军团菌技术,为临床和环境样品检测嗜肺军团菌提供可实用工具.方法 在对嗜肺军团菌mip序列进行分析、比较基础上,设计一对特异性引物和TaqMan-MGB探针,通过实时荧光PCR反应条件和反应体系的优化,实现对嗜肺军团菌的快速检测;用克隆到pMD-19T载体上的嗜肺军团菌mip基因阳参片段和不同菌株验证方法的敏感性和特异性.结果 当用热裂解法提取DNA,25μl的反应体系中包括上、下游引物(20μmol/L)各0.6μl,探针(20μmol/L)0.4μl,模板DNA 6.0μl,反应条件为预变95℃20 S,变性95℃10 s,退火50℃ 40 s,40个循环时,TaqMan-MGB探针实时荧光PCR技术对嗜肺军团菌mip基因阳参片段最低检测浓度为0.71拷贝/μl,其循环阈值(Ct值)与模板浓度具有极好的对应关系(r=0.999);1株嗜肺军团菌标准株、12株嗜肺军团菌分离株的Ct值在13.23～16.04之间,而包括金黄葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌、副溶血性弧菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、痢疾志贺菌共计76株其他菌PCR Ct值均大于30;整个检测过程仅需1.5 h.结论 TaqMan-MGB探针的嗜肺军团菌实时荧光PCR检测方法具有特异性和敏感性、易操作、结果准确可靠等优点,可用于嗜肺军团菌检测.     

马尔堡、埃博拉病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立

目的 建立一种快速、敏感、特异的双重实时荧光定量PCR方法,可同时检测马尔堡病毒和埃博拉病毒.方法 通过序列比对挑选出两种病毒基因组中高度保守的序列,分别设计引物及Taqman探针,两条探针分别标记FAM和Texas Red荧光报告基因,建立双重实时荧光定量PCR反应体系.结果 双重荧光定量PCR方法检测两种病毒阳性标准品的灵敏度分别为30.5拷贝/μl和28.6拷贝/μl,通过检测日本脑炎病毒、黄热病毒、登革热病毒无交叉反应,有较好的灵敏度和特异性.结论 建立了马尔堡、埃博拉病毒双重荧光定量PCR检测方法,实现了两种病毒同时实时定量检测,在传染病防控领域有较好的应用前景.     

实时荧光定量PCR在铁路运输动物携带甲型流感病毒检测中的应用

目的探讨应用实时荧光PCR对铁路运输动物携带甲型流感病毒进行快速检测的可行性,为制定铁路系统有效的流感监测方案奠定基础。方法采集死禽咽喉部和泄殖腔拭子,活体动物用拭子涂抹泄殖腔外周,粪便和毛用拭子涂抹表面。依据《全国流感监测实施方案》、甲型流感病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书以及ABI7500F型实时荧光定量PCR的SDS软件操作。结果共采集广州中铁快运货场动物样本250份,检出甲型流感病毒核酸阳性11份,阳性率4.4%,其中以鸽类样本的阳性检出率最高,鹅次之,鸭最低。结论实时荧光PCR检测方法适合铁路运输的实际要求,结合进一步病毒分型和病毒基因测序,对掌握病毒流行趋势,做好预防控制工作具有重要意义。     

实时荧光PCR检测手足口病病原体方法的建立及初步应用

目的 建立一种能同时检测肠道病毒、肠道病毒71型和柯萨奇病毒16型等手足口病病原体核酸的实时荧光PCR方法.方法 针对上述病毒的基因序列,设计、合成引物、探针.对38例手足口病患者在实时荧光PCR仪上进行扩增、检测和结果分析;并与常规RT-PCR方法的检测结果进行比对.结果 38例患者肠道病毒、肠道病毒71型和柯萨奇病毒16型实时荧光PCR方法与常规RT-PCR方法的阳性率分别为:73.7%、60.5%、13.2%、71.1%、55.3%、13.2%.统计分析表明,两种方法差异不具有统计学意义.结论 成功建立了肠道病毒、肠道病毒71型和柯萨奇16型病毒核酸的实时荧光PCR检测方法.