小鼠腔前卵泡三维培养成熟后受精体系的建立及优化

目的： 建立小鼠腔前卵泡体外海藻酸盐包埋培养的三维培养 (3-dimensions in vitro growth,3D-IVG)方法以及成熟卵母细胞体外受精体系。方法：采用机械法分离12日龄雌性昆明小鼠卵巢,获取结构完整的腔前卵泡,腔前卵泡经过包埋后体外立体化培养,激素超排,收集黏液化的卵丘-卵母细胞复合体 (cumulus-oocyte-complex,COCs),分别计数发泡期 (germinal vesicle, GV)卵母细胞、生发泡破裂期 (germinal vesicle breakdown ,GVBD)卵母细胞和含有第一极体 (first polar body,PB)卵母细胞,制备卵母细胞染色体并进行C带染色分析。同时设小鼠体内超排卵母细胞 (in vivo convention,IVC)作为对照。再将体外培养成熟的卵母细胞与获能后的小鼠精子受精,观察受精情况。结果：经过3D-IVG,卵泡存活率为82.5%,卵泡发育过程维持完整的三维结构,卵泡直径增长迅速,培养6 d后,有91.7%成腔;在激素超排后,有82.6% COCs黏液化。GV、GVBD和含有PB的成熟卵母细胞分别为6.1%,45.4%和48.5%。3D-IVG获得的成熟卵母细胞百分率 (48.5%)明显低于体内超排成熟卵母细胞百分率 (82.9%),差异有统计学意义 (P<0.05)。但3D-IVG所获得的卵母细胞染色体C带分析表明染色体数目为20条,结构未见异常,与体内超排卵母细胞一致。并观察到3D-IVG培养成熟的卵母细胞可以受精成功。结论：建立并完善了小鼠腔前卵泡的三维体外培养体系,为生殖毒性实验研究和胚胎工程研究提供了新的方法。     

小鼠腔前卵泡体外培养成熟-染色体分析技术的建立

背景与目的：初级卵母细胞生长过程中对理化因子反应敏感，拟建立小鼠腔前卵泡体外培养成熟（IVG）一染色体分析技术，为生殖毒理学提供有效的检测模型。材料与方法：采用机械分离法从12～14日龄昆明小鼠的卵巢中分离出直径为140—160μm的腔前卵泡，单个卵泡放入微液滴培养体系中，隔天半量换液，连续培养10d，对成活卵泡体外诱导超排，于16～24h后，检测卵母细胞成熟情况，分别计数停滞在生发泡期（GV）、生发泡期破裂（GVBD）和排出第一极体（PB）的卵母细胞数，对卵母细胞进行染色体数目与结构分析，并与体内发育体外成熟卵母细胞（IVM）及体内超排成熟卵母细胞（IVC）进行比较分析。结果：从4只小鼠卵巢中分离得到332个腔前卵泡，培养早期卵泡直径增长显著，随后呈“摊鸡蛋”样生长，部分形成假腔。培养10d后存活率为95．78％（318／332），激索诱导排卵后，卵丘-卵母细胞复合体排出率72．01％（229／318），其中11．80％（27／229）停滞在GV期，39．30％（90／229）发生GVBD，47．16％（108／229）发育成熟，排出第一极体（PB），1．74％（4／229）发生孤雌活化。IVG与IVM、IVC两种方法获得的卵母细胞染色体对比分析，未见明显的染色体数目与结构异常。结论：小鼠腔前卵泡体外培养成熟，可获得与体内生长相同的成熟卵母细胞，染色体分析未见异常，可成为一种良好的生殖毒理学体外检测与卵泡发育机制研究模型。     

叶酸对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

背景与目的： 探讨叶酸(folic acid, FA) 对小鼠卵母细胞体外成熟的影响。 材料与方法： 实验设次黄嘌呤(hypoxanthine,Hx)处理小鼠体外卵母细胞的卵母细胞成熟抑制模型组(Hx 4 mmol/L＋M16培养液)、FA组(500 μmol/L FA ＋4 mmol/L Hx ＋M16培养液)和M16培养液组,各组卵母细胞培养24 h后,在体视显微镜下观测卵母细胞生发泡破裂(germinal vesicle breakdown, GVBD)和第一极体(the first polar body, PB1)排出情况,采用免疫荧光染色方法观察染色体和纺锤体的形态结构。 结果： M16培养液组、Hx模型组和FA处理组的GVBD率分别为98％、22.2％、40.1％,其PB1排出率分别为77.7％、15.5％、27.6％,各组间的差异均具有统计学意义(P<0.05);次黄嘌呤和叶酸对染色体的形态没有影响,而次黄嘌呤使正常的纺锤体变长、变宽、面积变大,FA组较Hx模型组增大的纺锤体有所恢复,并接近于正常水平。 结论： 叶酸可促进小鼠卵母细胞体外减数分裂的重启和成熟。     

人精子染色体离体测试系统中S9混合物的应用

在未加和加入体外代谢激活体系S9混合物2种情况下,将人精子用最终浓度分别为20、40、60μg/ml环磷酰胺处理3.5h,然后与去透明带地鼠卵进行异种体外受精,继而制备精子染色体进行核型分析。在未加S9混合物组,环磷酰胺3种剂量处理的染色体结构畸变精子率依次为10％、12％、10％;断裂均数依次为0.22、0.14、0.20;在加入S9混合物组,畸变精子率依次为18％、24％、32％;断裂均数依次为0.38、0.78、1.64.2组间畸变精子率和断裂均数差异显著(P<0.05)。加入S9混合物组,环磷酰胺3种剂量处理的畸变精子率和断裂均数都高于空白对照组(10％,0.12％),其差异具有统计学意义且畸变精子率和断裂均数随着环磷酰胺剂量增加而增高。本研究结果表明,人精子染色体离体测试系统可以用来检测原诱变剂对人精子中遗传物质的诱变效应。但原诱变剂必须经S9混合物代谢成激活型。     

一种稳定的人卵母细胞体外培养成熟技术

背景与目的：建立一种稳定的人卵母细胞体外培养成熟技术。材料与方法：取术后部分卵巢组织,穿刺卵泡获得未成熟卵母细胞,在含激素的培养基中培养24～36 h。结果：经培养的人卵母细胞合符成熟的判断标准：①含有第一极体;②胞浆匀称,色浅,颗粒均匀。结论：该方法稳定,提示未成熟人卵母细胞经体外培养成熟在人类辅助生殖领域具有广泛的应用前景。     

氟哌啶醇对小鼠卵母细胞染色体的影响

背景与目的:探讨抗精神病药氟哌啶醇(Haloperidol,Hal)在卵子发生过程中对卵母细胞染色体的影响。材料与方法:将40个12周龄健康雌性小鼠随机分为4组,分别按0、0.05、0.50、5.00mg/(kg·d)腹腔注射Hal,连续注射8d,通过超排收集卵母细胞,制备染色体标本进行核型分析。结果: 对照组、0.05、0.50、5.00mg/(kg·d)组的实验参数分别为,①超单倍体率:3.8 %、4.4 %、7.3 %、18 %;②非整倍体率:7.5 %、8.8 %、14.5 %、36.0 %;③退化卵母细胞率:1.3 %、1.4 %、1.8 %、10.0 %;④染色体分离均数:0.013、0.014、0.018、0.100。0.05、0.50mg/(kg·d)组分别与对照组比较,各实验参数间的差异没有统计学意义(P>0.05)。5.00mg/(kg·d)组各实验参数值均比对照组高,其差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:大剂量Hal有可能诱发卵母细胞非整性增加并引起卵母细胞退化。     

纤维蛋白胶对体外培养小鼠胚胎发育的影响

目的: 研究纤维蛋白胶对体外培养小鼠胚胎发育的影响。方法:超排获取昆明小鼠2 细胞期受精卵,常规配制纤维蛋白 胶,比较小鼠胚胎常规培养与在纤维蛋白胶上培养的囊胚发育率及孵化率,以及内细胞团染色体数目变化。结果:小鼠胚胎在 纤维蛋白胶上培养与常规培养,囊胚发育率及孵化率分别为:67. 5 %和66. 7 %( P = 0. 837 , Yetes corrected) , 38. 5 %和34. 0 %( P = 0. 159 , Yetes corrected) 。内细胞团染色体数目绝大部分为2n = 40 ,基本保持核型稳定。结论:纤维蛋白胶对体外培养 的小鼠胚胎无不良影响,可以作为研究胚胎营养因子对胚胎影响的载体基质。     

平阳霉素诱发人精子染色体结构畸变类型

人精子经平阳霉素处理后与去透明带地鼠卵受精，继而制备染色体进行核型分析．结果显示断裂是诱发畸变的主要类型，其后依次为互换、缺失、环和粉碎化；染色体型畸变的比例和均数远高于染色单体型；断裂型畸变的比例和均数远高于重接型．畸变中１７．３％为重接型，表明金黄地鼠卵母细胞中的ＤＮＡ损伤修复系统能够修复化学诱变所致人精子ＤＮＡ损伤．染色体型互换多于染色单体型互换提示：对这类损伤的修复，复制前修复系统可能比复制后修复系统作用更强．研究结果还证实染色体畸变精子和正常精子同样具有与卵受精的能力，提示人精子若反复或是期暴露于环境诱变因子，所产生的ＤＮＡ损伤有可能在精子中积累并在受精时不受选择性淘汰而传递给下一代．     

DNA诱发损伤的修复与染色体畸变的研究—咖啡因对人精子染色体的影响

应用人精子去透明带卵异种体外受精技术，对第１次卵裂中期相的染色体畸变进行分析。实验分为对照、咖啡因后处理、丝裂霉素Ｃ（ＭＭＣ）预处理、ＭＭＣ预处理同时加咖啡因后处理４个组。咖啡因组、ＭＭＣ组和ＭＭＣ＋咖啡因组染色体结构畸变精子率依次为２７．０％，２３．０％和４５．０％；断裂均数依次为０．７２，０．６０和１．６５，各组上述参数均高于空白对照组（８．０％，０．１４），差异非常显著（Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０１）。与ＭＭＣ组和咖啡因组相比较，ＭＭＣ＋咖啡因组诱发的染色体型和染色单体型畸变均明显增加，以染色体型畸变增加更为明显（Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０１）。结果显示，咖啡因可诱发人精子染色体畸变并能通过抑制金黄地鼠卵母细胞的复制前和复制后修复系统，有效地增强ＭＭＣ对人精子染色体的诱变效应。     

重铬酸钾对人精子染色体畸变率的影响

本文介绍了人精子经重铬酸钾体外染毒后，与去透明带地鼠卵受精、体外培养和制备人类精子染色体，结果证明各染毒组(10μg／ml，20μg／ml、40μg／ml)染色体断裂率分别为13．20％、25．0％、30.76％，与阳性对照组(5.3％)比较，中高剂量组均具有非常显著统计学意义（P＜0．01)，而且具有剂量反应关系(r=0.95 P＜0．05)．     

一种稳定的人卵母细胞染色体荧光原位杂交技术

目的: 建立一种稳定、简便的人卵母细胞染色体荧光原位杂交技术,为揭示母方减数分裂错误及其发生原因、探讨非整倍性发生机制、评价外环境因素对人卵母细胞的遗传学效应提供有力工具。方法: 经签订知情同意书后,取体外受精术后废弃的人卵母细胞,经低渗、渐进固定处理、制备人卵母细胞染色体核型。应用人16号染色体着丝粒荧光探针,经变性处理后与人卵母细胞核型进行荧光原位杂交,再经洗脱和染色等步骤,在荧光显微镜下分析。结果: 经过上百批次重复实验,人卵母细胞染色体形态与分散良好,荧光信号明亮清晰、背景干净。结论: 成功建立人卵母细胞染色体荧光原位杂交技术。     

静磁场对体外三维培养小鼠腔前卵泡发育成熟的影响

目的： 用三维小鼠腔前卵泡体外培养成熟体系检测静磁场对生殖细胞发育成熟的影响。方法：从12日龄昆明小鼠的卵巢中,机械分离出直径为 (130±10) μm的腔前卵泡,用海藻酸钠凝胶将单个卵泡包埋后,放入预平衡的培养液滴中培养,并随机分成对照组、5 和450 mT暴磁组,隔天半量换液,在倒置显微镜下测量其直径,连续培养8 d,对成腔的卵泡进行体外人绒毛膜促性腺激素 (HCG)刺激16~18 h后,检测卵母细胞成熟情况。结果：各组卵泡形态学发育均良好,随着体外培养时间的延长,卵泡逐渐增大,在第4天450 mT暴磁组卵泡直径与对照组相比增大显著 (P<0.05),第6天5 和450 mT暴磁组均明显高于对照组 (P<0.05)。随着磁场强度增强,卵泡成腔率亦比对照组显著提高 (P<0.05)。而5 mT暴磁组成熟率与对照组相比无明显变化 (P>0.05),但450 mT组与对照组相比显著降低 (P<0.05)。结论：海藻酸盐凝胶可维持昆明小鼠腔前卵泡体外正常生长发育。随着磁场强度增强,卵泡的成腔率显著性提高,成腔卵泡直径显著增大,但高强度的静磁场可能会影响卵母细胞的成熟过程。     

Effects of alphafetoprotein on isolated mouse oocytes

The supposition of an effect of alphafetoprotein (AFP) on female germinal cells is put forward. The spontaneous in vitro maturation of adult mouse oocytes is significantly inhibited when mouse AFP replaces albumin in culture medium. Furthermore, the very unusual degenerative appearance of the cells subjected to AFP seems to indicate that this meiotic inhibition is linked to a premature degeneration of the oocytes rather than to a blockage of the cells at an earlier stage of maturation. Accordingly AFP, perhaps through its ligands, may play a role in reducing the number of gonocytes during fetal and immediate post-natal life rather than in stopping oocyte meiosis at the diplotene stage.     

巯基乙酸对爪蟾卵母细胞体外核成熟的影响

背景与目的:探讨巯基乙酸(thioglycolic acid,TGA)对孕酮诱导的爪蟾卵母细胞核成熟的影响.材料与方法:用不同浓度的TGA(5、25、125 μg/ml)在体外预处理爪蟾卵母细胞2 h后,再用孕酮诱导成熟,实验并设不经TGA预处理的对照组.在培养过程中观察卵母细胞的外观和核形态,以判断生发泡破裂(GVBD)情况;在培养结束时(加入孕酮后8 h),收集卵母细胞进行荧光染色.观察染色体的状态. 结果:经不同浓度TGA处理后卵母细胞的GVBD50 明显缩短,与对照组比较均具有统计学意义(P均<0.05),说明TGA加快卵细胞GVBD的发生;荧光染色观察GV期卵母细胞未见凝集的染色体,第一次减数分裂中期细胞可见赤道板形成,第二次减数分裂中期细胞除染色体赤道板外,还可见第一极体(PB1).经25 mg/ml和125 mg/ml浓度的TGA处理后,排出PB1的爪蟾卵母细胞比例明显降低(P<0.05),即抑制了MI-MII转变和第一极体的释放.结论:TGA可抑制孕酮诱导的爪蟾卵母细胞体外成熟.     

Requirement of the c-mos protein kinase for murine meiotic maturation

Anti-sense mos oligonucleotides have been shown to block steps required for meiotic maturation of oocytes. In Xenopus oocytes, the block prevents germinal vesicle breakdown (GVBD), an early step in oocyte maturation. In mice the block induced by anti-sense mos occurs at a later step in oocyte maturation concerned with the first polar body emission. Here, we show that mouse oocyte maturation is blocked by introduction of anti-mos antibodies into immature functional oocytes. Antibodies that inhibit the mos kinase blocked GVBD. In contrast, anti-mos antibodies that permit the mos kinase to function do not block GVBD, but interfere with polar body formation. Antibodies pre-reacted with excess cognate peptide had no observable effects on maturation. These results indicate that the c-mos kinase function is required for activation of maturation-promoting factor (MPF) during meiosis. These findings are also consistent with our previous studies which show that the mos kinase directly phosphorylates cyclin B2, a component of MPF (Roy et al., 1990).