乙型脑炎病毒SA14-14-2株E基因的克隆、测序与表达

目的　克隆乙型脑炎病毒E基因并在大肠杆菌中进行表达 ,为今后研制乙脑分子诊断试剂盒和基因工程疫苗奠定基础。方法　根据乙型脑炎病毒株SA14 - 14 - 2E基因的序列设计一对引物 ,采用RT -PCR技术扩增其E基因全长cD NA ,将扩增产物克隆到pBlusecriptIISK(+)载体中 ,然后亚克隆到原核表达载体PGEX -KG中 ,筛选重组质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)表达重组蛋白。结果与结论　获得了含全长乙型脑炎病毒E基因的重组质粒 ,经酶切和测序证实构建正确。表达的目的蛋白经SDS -PAGE和Westernblot分析证实确为乙型脑炎病毒E蛋白且有生物学活性。     

Ⅰ型登革病毒ns1基因克隆及其表达产物的免疫原性研究

目的克隆并表达Ⅰ型登革病毒非结构蛋白1(NS1)基因,初步鉴定其免疫原性。方法登革热Ⅰ型病毒标准株感染C6/36细胞后,抽提病毒RNA,经RT-PCR方法扩增出NS1全长基因片段,经T-A克隆后,在QIA表达系统中表达,表达产物用Ni柱亲和层析纯化后,用兔抗Ⅰ型登革病毒免疫血清及登革热患者血清对重组蛋白进行Western Blot及ELISA鉴定。结果构建的重组质粒pQE-30/DV1NS1经IPTG诱导,重组蛋白NS1高效表达并纯化成功,经Western Blot及ELISA证实重组蛋白NS1可以被免疫血清和病人血清特异识别。结论Ⅰ型登革病毒非结构蛋白NS1表达载体在大肠杆菌M15中高效表达。纯化产物具有较强的免疫原性,为进一步研究NS1的生物学特性和血清学检测奠定了基础。     

登革热病毒外膜蛋白基因的克隆、表达

目的　在大肠杆菌中表达登革热病毒外膜抗原基因 ,获得能作为检测抗原的重组蛋白。方法　登革热 2型病毒NGC株感染C6/ 36细胞后 ,抽提病毒RNA ,经逆转录和套式PCR扩增出E基因片断 ,扩增片段经酶切、连接、克隆 ,构建重组表达质粒。并转化大肠杆菌DH5α。结果　重组质粒经诱导后表达外膜抗原的部分肽链。经过免疫印迹证实其具有免疫反应性。结论　截断的部分E蛋白基因在大肠杆菌中表达成功 ,重组的蛋白可作为血清学检测抗原使用     

丙型肝炎病毒核心蛋白通过自诱导方式可溶性表达及其生物学功能鉴定

目的 构建包含HCV核心蛋白全长基因的重组原核表达质粒,经转化表达型大肠杆菌后自诱导培养以获取可溶性重组核心蛋白,并检测其生物学功能. 方法 以H/FL质粒为模板,通过PCR扩增全长HCV核心蛋白DNA.PCR产物经双酶切后定向克隆到pET28a原核表达载体中.将重组的原核表达载体转化表达型大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS,并通过自诱导培养的方式使其在高浓度状态下表达重组核心蛋白.重组核心蛋白经Western blot检测鉴定生物学功能,并与HCV NS3蛋白进行相互结合后共同纯化实验. 结果 重组核心蛋白大量存在于表达菌破菌上清液中.Western blot检测结果显示其具有核心蛋白抗原性.重组核心蛋白不能单独通过Ni-NTA亲和层析柱纯化,但可以与HCV NS3蛋白结合后共同纯化. 结论 成功表达可溶性的重组核心蛋白,证明了其生物学活性.重组核心蛋白与HCV NS3蛋白存在相互作用.     

乙型脑炎病毒NS5蛋白原核表达与亚细胞定位研究

目的对乙型脑炎病毒NS5蛋白进行原核表达和亚细胞定位研究。方法通过PCR扩增乙型脑炎病毒NS5基因,并将之克隆至原核表达载体pET-28a（＋）中,构建的重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞,经IPTG诱导表达目的蛋白。将表达产物纯化后,免疫BALB/c小鼠,制备NS5蛋白特异性的多克隆抗体。同时,构建NS5基因与绿色荧光蛋白（EG-FP）融合表达的真核表达质粒pcDNA-NS5-EGFP,将之转染BHK-21细胞,利用激光共聚焦荧光显微镜观察NS5蛋白在BHK-21细胞中的亚细胞定位。结果 NS5蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,表达蛋白分子量大小约为103kD,该蛋白在真核细胞中的表达呈颗粒状不均匀分布于整个细胞,且颗粒状主要分布在细胞质中。结论成功表达乙型脑炎病毒NS5蛋白,并对NS5蛋白的亚细胞定位进行了分析,为进一步研究NS5蛋白提供依据。     

寨卡病毒NS1蛋白的原核表达和单克隆抗体的制备

目的 高效表达和纯化重组的寨卡病毒NS1蛋白,制备抗NS1蛋白的单克隆抗体。方法 构建含有寨卡病毒NS1基因的原核表达质粒,利用大肠杆菌大量表达重组NS1蛋白,纯化蛋白后免疫小鼠并进行细胞融合,筛选制备高纯度的单克隆抗体。结果 在大肠杆菌中高效表达了重组NS1蛋白,重组NS1蛋白具有良好的免疫原性,筛选出3株分泌针对寨卡病毒NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为6B8、7D11和3E2,纯化的单克隆抗体与重组NS1蛋白有良好的特异性反应。结论 利用重组NS1蛋白免疫制备了抗NS1的单克隆抗体,为后续建立针对NS1蛋白的ELISA检测方法及相关研究提供了基础。     

编码弓形虫表面抗原P30基因的克隆及在E.coli中的表达

目的　构建编码弓形虫RH株表面抗原P30基因重组表达质粒 ,初步观察P30基因在E coli表达。方法　将P30基因定向克隆到分支杆菌 -大肠杆菌穿梭表达质粒热休克蛋白 70 (hsp70 )起动基因的下游的多克隆位点 ,构建重组表达质粒pBCG -P30 ;采用亚克隆技术 ,将含P30和hsp70起动基因的复合片段 ,插入表达载体 pBK -CMV质粒 ,转化大肠杆菌DH5α ,在卡那霉素阳性LB培养基平板筛选阳性重组子 ,并经双酶切及PCR扩增鉴定。重组质粒 pBK -P30转化大肠杆菌 ,IPTG诱导表达后进行SDS -PAGE和Westernboltting分析。 结果　 1)阳性重组质粒 pBCG -P30、pBK -P30经酶切和PCR鉴定 ,与预期的结果相符合。 2 )序列测定证实克隆的基因为编码P30抗原的基因。 3)P30基因在大肠杆菌诱导表达后获得4 5kDa融合蛋白 ,此抗原未被弓形虫高免兔血清识别。结论　成功构建编码弓形虫表面抗原P30重组表达质粒 ,并在大肠杆菌中获得表达 ,为弓形虫DNA疫苗的研制奠定基础     

乙型肝炎病毒preS1基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建含preS1基因真核表达质粒，探讨乙型肝炎病毒preS1基因在HBV入胞机制中的作用。方法：PCR法扩增含EcoR I与Pst I酶切点的preS1基因序列，PAS2-1载体及preS1基因PCR产物双酶切，经T4DNA连接酶将两者连接并转化到大肠杆菌JM105，对重组质粒经序列测定，命名为PAS 2—1—preS1。经乙酸锂转化法将重组质粒转化入酵母茵AH109，Western Blot法证实重组质粒在酵母细胞中的表达。结果：已构建的质粒PAS2—1-preS1经序列测定合有完整的preS1基因片段，转入酵母后经Western Blot证实酵母细胞正确表达preS1-BD融合蛋白。结论：PAS2—1—preS1的构建为通过酵母双杂交体系筛选体内与preS1蛋白相互作用的preS1相关蛋白，为进一步深入探讨preS1在HBV致病机制中的作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌阿拉伯糖基转移酶AftA的原核表达及鉴定

目的构建高效表达菌株,以大量表达结核分枝杆菌AftA蛋白,为后续的抗结核药物的筛选奠定基础。方法采用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出AftA的基因片段,将其插入原核表达质粒PQE30,构建重组质粒PQE30-aftA。将PQE30-aftA转化大肠杆菌,用IPTG诱导目的基因表达。Western-blotting免疫印迹法鉴定后纯化该表达产物。结果经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功构建了重组质粒PQE30-aftA。在大肠杆菌M15中用IPTG诱导表达后,获得了AftA蛋白。蛋白经SDS-PAGE分析约为69.5kD。免疫印迹分析证实目的蛋白与阳性结核病患者抗血清产生特异性反应。结论成功制备出重组的AftA蛋白,为新型抗结核药物的筛选奠定了物质基础。     

华支睾吸虫Rap2B样基因的生物信息学分析及其克隆、表达

目的从华支睾吸虫cDNA文库中筛选Rap2B样基因并分析其结构和功能,初步进行克隆和表达纯化,为进一步研究其功能奠定基础。方法利用多种生物信息学分析软件,分析华支睾吸虫Rap2B蛋白的拓扑学结构、生物学和免疫学功能特征。设计引物,从华支睾cDNA质粒文库中扩增目的基因cDNA序列,构建原核重组质粒并初步表达纯化。结果华支睾吸虫Rap2B样基因长度为847bp,其全长编码序列为426bp,编码141个氨基酸,理论分子量是15851.1。重组的原核表达质粒pET-28a(+)-Rap2B经PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒构建成功。该基因在大肠杆菌中能高效表达。经His亲和层析柱获得了纯化的重组蛋白,Western blotting证实Rap2B重组蛋白能被感染华支睾吸虫的大鼠血清识别。结论华支睾吸虫Rap2B蛋白经生物信息学预测为ras原癌基因家族成员,可能在华支睾吸虫致癌过程中有一定作用。该基因可在原核表达系统中高效表达,并得到了纯化的重组蛋白,为进一步研究该蛋白的功能以及在致病尤其是可能促发肿瘤的作用方面奠定一定基础。     

流行性乙型脑炎患者血清IgG抗体对乙脑病毒蛋白的识别

目的：了解流行性乙型脑炎病毒各蛋白成分在刺激机体免疫应答方面所起的作用，给亚单位疫苗研制提供理论依据，进行该项研究。方法：建立乙脑病毒免疫转印方法，应用该法检查乙脑病人血清IgG抗体对乙脑病毒蛋白的反应情况，分析正常人群中筛选出的乙脑病毒隐性感染者血清IgG对乙脑病毒蛋白的反应性，并比较二者的差异。结果：经检测，绝大部分病人血清IgG可识别E蛋白，部分病人尚可识别NS5，NS3，NS1蛋白，而隐性感染者血清IgG对98kd（NS5）乙脑病毒蛋白的反应性显著低于乙脑患者。结论：研究结果显示，E蛋白是乙脑病人血清IgG识别的主要蛋白，在免疫保护方面起着主要作用。隐性感染者对NS5蛋白的反应机率明显低于显性感染者，提示NS5蛋白在乙脑病毒的致病过程中起重要作用。     

Impaired T helper 1 function of nonstructural protein 3-specific T cells in Japanese patients with encephalitis with neurological sequelae

Japanese encephalitis virus (JEV) is the principal cause of viral encephalitis. The predominance of children among patients with encephalitis in areas where JEV is endemic that do not have immunization programs suggests that acquired immunity is critical in protecting adults against symptomatic JEV encephalitis. We characterized and compared the T cell response to nonstructural (NS) protein 3 between healthy individuals naturally exposed to JEV and patients in the convalescent phase of JEV encephalitis. The NS3 protein, used as a fusion to the 11-amino acid protein transduction domain of human immunodeficiency virus Tat, elicited CD4(+) and T helper-dependent CD8(+) T cell responses. The production of interferon (IFN)- gamma by responding T cells was significantly higher in healthy donors than in patients, correlating strongly with acquired protective immunity to JEV. Furthermore, a striking inverse association between IFN- gamma levels and the severity of postencephalitic sequelae in patients implicated a role of IFN- gamma in recovery.     

黄热病毒NS1蛋白的制备及免疫原性鉴定

目的 原核系统克隆表达黄热病毒(yellow fever virus, YFV)非结构蛋白1(nonstructural protein 1,NS1),鉴定其免疫原性。方法 以YFV-17D疫苗株为模板,常规分子生物学方法构建pQE30-YFV NS1表达载体,原核表达纯化YFVNS1重组蛋白;免疫印记、免疫荧光和酶联免疫吸附实验验证其免疫原性。结果 成功构建重组质粒pQE30-YFV NS1,制备纯化可溶性YFV NS1蛋白;该重组YFV NS1蛋白与登革病毒、黄热病毒、乙脑病毒、西尼罗河病毒免疫小鼠腹水及寨卡病毒NS1、YFV NS1蛋白免疫小鼠血清均发生反应,重组YFV NS1蛋白免疫小鼠血清与YFV感染细胞超声上清也发生反应。结论 获得高纯度YFV NS1重组蛋白,且具有较好的免疫原性,含天然NS1蛋白表位,为基于NS1黄热病毒早期抗原诊断方法和蛋白功能研究奠定基础。     

Phylogenetic analysis of Japanese encephalitis virus: envelope gene based analysis reveals a fifth genotype, geographic clustering, and multiple introductions of the virus into the Indian subcontinent

We report the analysis of the complete nucleotide sequence for the Indian isolate (P20778; Genbank Accession number AF080251) of Japanese encephalitis virus (JEV). The phylogenetic tree topology obtained using thirteen complete genome sequences of JEV was reproduced with the envelope, NS1, NS3, and NS5 genes and revealed extensive divergence between the two Indian strains included. A more exhaustive analysis of JEV evolution using 107 envelope sequences available for isolates from different geographic locations worldwide revealed five distinct genotypes of JEV, displaying a minimum nucleotide divergence of 7% with high bootstrap support values. The tree also revealed overall clustering of strains based on geographic location, as well as multiple introductions of JEV into the Indian subcontinent. Nonsynonymous nucleotide divergence rates of the envelope gene estimated that the ancestor common to all JEV genotypes arose within the last three hundred years.     

乙型脑炎病毒E基因在杆状病毒中的表达及其初步应用

目的克隆表达日本乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitis virus,JEV)的E基因,研究其抗原性,并初步作为诊断抗原建立JEV抗体检测方法。方法用RT-PCR方法扩增E基因全长,然后克隆到pFastbacTM载体中,转化宿主菌DH5a中,提取阳性克隆质粒转导到DH10Bac,利用通用引物鉴定阳性,提取其基因组转染昆虫细胞sf9,而后经IFA和Western blot进行鉴定。挑蚀斑纯化获得高纯度和高滴度的重组病毒,收集细胞裂解上清作为抗原建立间接ELISA方法,对不同年龄段猪血清进行检测。结果从JEV中成功克隆E基因,并在昆虫细胞中得到表达,分子量约53kD,具有良好的抗原性。建立的ELISA方法的抗原最佳包被浓度为30μg/ml,待检血清的最佳稀释度为1:40,阳性判定标准初步定为OD450≥0.3,且OD值待检血清/OD值阴性血清≥2。结论JEV的E基因经过体外昆虫细胞表达,获得抗原性良好的蛋白作为诊断抗原,用其建立的ELISA方法能很好用于猪群JEV抗体水平的检测。     

Vero cells infected with vaccinia viruses expressing Japanese encephalitis virus envelope protein induce polykaryocyte formation under neutral conditions

Flavivirus membranes fuse with cellular membranes by low pH-induced mechanisms. Although Japanese encephalitis virus (JEV) has similar mechanisms, fusion induced under neutral conditions has been observed. We report herein polykaryocyte formation using Vero cells infected with recombinant vaccinia viruses, vP829 expressing JEV premembrane (prM) and envelope (E), or vP555 expressing prM, E, and the nonstructural proteins NS1 and NS2A. Polykaryocytes were detected under pH 7.0 as early as 9 h after infection. Higher fusion indices were shown with vP555 than vP829. A monoclonal antibody to E suppressed vP829/vP555-induced polykaryocyte formation. Polykaryocytes were also formed under alkaline conditions (pH 8.0).     

Encephalitis and retarded growth of chicks caused by Sitiawan virus, a new isolate belonging to the genus Flavivirus

A new virus named Sitiawan virus (SV) was isolated from sick broiler chicks in chicken embryos. The virus replicated well with cytopathogenic effect (CPE) in the chicken B-lymphocyte cell line LSCC-BK3. The virus was an enveloped RNA virus of approximately 41 nm in size with hemagglutinating activity (HA) to goose erythrocytes. It was cross-reactive with Japanese encephalitis virus (JEV), a member of flaviviruses by HA inhibition tests but not by cross-virus neutralization tests. The cDNA fragment of NS5 gene was amplified with primers corresponding to NS5 gene of flaviviruses. The nucleotide sequences were 92% homologous to Tembusu virus, a member of the mosquito-borne virus cluster of the genus Flavivirus. In cross-neutralization tests with Tembusu virus, antiserum to SV did not neutralize Tembusu virus, and antiserum to Tembusu virus neutralized more weakly to SV than against homologous virus. These results indicate that SV is a new virus which can be differentiated serologically from Tembusu virus but is otherwise similar with respect to nucleotide sequence. The virus causes encephalitis, growth retardation, and increased blood glucose levels in inoculated chicks.     

Protection of mice against lethal Japanese encephalitis with a recombinant baculovirus vaccine

Genes coding for the E and NS1 glycoproteins of Japanese encephalitis virus (JEV) were cloned into baculovirus expression vectors. The recombinant baculoviruses obtained were used to infect Spodoptera frugiperda cells. The infected cells were used to immunize C57/B mice, which were then challenged with live JEV. Survival was increased from about 30% in unimmunized mice to 70% in E and polyprotein recipients (P less than 0.005), but was not increased in NS1 recipients despite the development of antibody against NS1 by these mice. Virus neutralizing antibody was demonstrated in 18/20 E glycoprotein recipients and 15/20 polyprotein recipients. The baculovirus expressed E glycoprotein stimulated antibody which was protective and neutralizing in this system.