HOXC6同型蛋白2对根尖牙乳头干细胞成骨/成牙分化功能的影响

目的 探讨同源盒基因C6同型蛋白2对牙源性间充质细胞成骨/成牙分化的影响.方法 成骨诱导培养基诱导人根尖牙乳头干细胞体外成骨/成牙分化;逆转录病毒转染构建过表达HOXC6-ISO2稳定转染牙乳头干细胞进行HOXC6-ISO2获得性功能研究;碱性磷酸酶活性实验检测成骨/成牙早期分化指标-碱性磷酸酶活性;茜素红染色及钙离子定量分析检测干细胞体外矿化能力;实时荧光定量反转录PCR检测成骨/成牙分化相关基因-Sp7转录因子、Runt相关转录因子2和骨钙素及同源盒基因C6下游基因胰岛素结合蛋白5的表达.结果 结果显示过表达同源盒基因C6同型蛋白2明显抑制牙乳头干细胞的碱性磷酸酶活性;茜素红染色及钙离子定量分析结果显示过表达同源盒基因C6同型蛋白2明显抑制牙乳头干细胞体外矿化能力;实时荧光定量反转录PCR显示过表达同源盒基因C6同型蛋白明显抑制骨钙素的表达,并且抑制下游基因胰岛素结合蛋白5的表达.结论 同源盒基因C6同型蛋白2通过抑制下游基因胰岛素结合蛋白5抑制牙乳头干细胞体外成骨/成牙分化的功能.     

组蛋白去甲基化酶FBXL11抑制牙髓干细胞成骨和成牙本质分化

目的 研究组蛋白去甲基化酶FBXL11对牙髓干细胞定向分化能力的影响.方法 成骨分化诱导培养基诱导牙髓干细胞体外成骨/成牙本质分化.逆转录病毒转染构建过表达FBXL11的牙髓干细胞稳定转染细胞,进行FBXL11获得性功能研究.碱性磷酸酶活性实验及碱性磷酸酶染色检测成骨/成牙本质分化早期分化指标-碱性磷酸酶活性.茜素红染色及钙离子定量分析检测牙髓干细胞体外成骨/成牙本质分化能力.实时定量RT-PCR检测FBXL11及成骨/成牙本质分化相关基因-骨涎蛋白、骨桥蛋白和骨钙素的表达.结果 成骨诱导牙髓干细胞抑制FBXL11的表达.过表达FBXL11明显抑制牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性、牙髓干细胞体外矿化能力以及骨涎蛋白和骨桥蛋白的表达.结论 组蛋白去甲基化酶FBXL11具有抑制牙髓干细胞成骨和成牙本质分化的潜能.     

组蛋白去甲基化酶KDM6A促进骨髓间充质干细胞成骨分化研究

目的研究组蛋白去甲基化酶KDM6A对骨髓间充质干细胞成骨定向分化能力的影响。方法构建Flag-KDM6A慢病毒表达质粒。利用慢病毒转染构建稳定过表达KDM6A的骨髓间充质干细胞。碱性磷酸酶活性实验检测成骨分化早期指标-碱性磷酸酶活性。茜素红染色及钙离子定量分析检测干细胞体外矿化能力。实时：毫量RT-PCR检测成骨分化相关基因．骨桥蛋白和骨钙素的表达。结果过表达KDM6A促进骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性、骨髓间充质干细胞体外矿化能力以及骨桥蛋白和骨钙素的表达。结论组蛋白去甲基化酶KDM6A具有促进骨髓间充质干细胞成骨分化的潜能,可以作为一个候选的靶基因用于骨组织工程技术,促进骨组织再生。．     

BCOR基因敲除促进骨髓间充质干细胞成骨分化的研究

目的研究BCL6共抑制因子-BCOR对骨髓间充质干细胞成骨定向分化能力的影响。方法利用慢病毒载体的BCORshRNA基因敲除BCOR,进行丧失性功能研究。通过检测ALP活性、茜素红染色、钙离子定量分析、成骨分化相关基因的表达,观察骨髓间充质干细胞体外成骨分化能力。结果BCOR在牙源性间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的表达无明显差异。基因敲除BCOR促进了骨髓间充质干细胞ALP活性、体外矿化能力及成骨分化相关基因骨涎蛋白、骨钙素的表达。结论BCOR基因表达降低能促进骨髓间充质干细胞成骨分化,证实BCOR是骨髓间充质干细胞成骨分化的抑制基因。     

CD24基因调控根尖牙乳头干细胞的成骨分化功能

目的 研究干细胞表面标记CD24基因对根尖牙乳头干细胞成骨分化能力的影响。方法 利用CD24 shRNA基因敲除CD24进行丧失性功能研究;实时定量RT-PCR检测CD24的基因敲除效果;通过ALP活性检测、茜素红染色及钙离子定量分析明确根尖牙乳头干细胞体外成骨分化能力的变化;实时荧光定量RT-PCR检测成骨分化相关基因-I型胶原蛋白1A、I型胶原蛋白1B、骨涎蛋白、骨桥蛋白和成骨相关转录因子RUNX2的表达分析研究根尖牙乳头干细胞基因表达改变。结果 实时定量RT-PCR结果显示CD24可以在根尖牙乳头干细胞有效的被敲除;碱性磷酸酶活性结果显示敲除CD24抑制根尖牙乳头干细胞碱性磷酸酶活性;茜素红染色及钙离子定量分析结果显示敲除CD24明显抑制根尖牙乳头干细胞体外矿化能力;实时定量RT-PCR结果显示敲除CD24明显抑制I型胶原蛋白A、型胶原蛋白B、骨涎蛋白、骨桥蛋白和RUNX2的表达。结论 基因沉默CD24可以通过抑制转录因子RUNX2及成骨分化基因的表达,从而抑制根尖牙乳头干细胞体外成骨分化功能。     

Foxc2稳定转染对C3H10T1/2细胞成骨性能的影响

目的:探讨Foxc2基因过表达对体外培养的小鼠胚胎成纤维细胞系C3H10T1/2细胞生物学行为及分化能力的影响.方法:通过慢病毒转染构建Foxc2过表达C3H1OT1/2细胞系,采用实时定量PCR和Western免疫印迹法检测转染后Foxc2蛋白的表达.应用CCK-8试剂盒检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡,实时定量PCR和Western免疫印迹法检测过表达Foxc2对成骨、成脂相关基因(Runx2、OPN、OCN、PPARγ)表达的影响,分别通过碱性磷酸酶(ALP)染色和油红染色检测细胞成骨和成脂分化能力.采用SPSS 17.0软件包对数据进行t检验.结果:成功构建Foxc2稳定过表达的C3H10T1/2细胞系,发现Foxc2过表达阻滞细胞于G1期,抑制细胞增殖.在成骨诱导过程中,过表达Foxc2可以显著上调Runx2、OPN、OCN等成骨相关基因的表达.ALP染色显示,Foxc2稳定过表达细胞较对照组细胞染色深.在成脂诱导过程中,过表达Foxc2显著下调PPARγ基因的表达;油红染色显示,成脂分化进程被部分抑制.结论:Foxc2过表达抑制细胞增殖,促进细胞分化.其机制是上调Runx2、OPN、OCN成骨相关基因的表达,下调PPARγ的表达,促进C3H10T1/2细胞的成骨分化,抑制其成脂分化.     

血管内皮细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞生物学效应的研究

目的:体外研究腺病毒AdCMV转染VEGF基因对大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及功能分化的影响.方法:体外培养扩增大鼠BMSCs,AdCMV-EGFP转染BMSCs,确定重组腺病毒的最适MOI,应用MTT法检测转染AdCMV-VEGF对大鼠BMSCs增殖的影响.采用RT-PCR方法检测转染后细胞VEGF的表达,通过检测成骨条件培养液诱导培养后细胞的碱性磷酸酶活性评价BMSCs向成骨细胞分化的能力.结果:AdCMV-EGFP在400particle/cell时转染效率最高,且对细胞无毒副作用,未转染细胞、AdCMV-EGFP转染细胞与AdCMV-VEGF转染细胞光吸收(A)值在转染后第3天存在明显差异(P<0.05).RT-PCR检测AdCMV-VEGF转染细胞有VEGF基因的表达,未转染AdCMV-VEGF细胞组未见VEGF基因mRNA的表达.通过成骨诱导后AdCMV-VEGF转染细胞碱性磷酸酶活性明显高于未转染AdCMV-VEGF细胞(P＜0.05).结论:在体外AdCMV-VEGF能够成功转染大鼠BMSCs,能够促进BMSCs的增殖和向成骨细胞的分化.     

组蛋白甲基化促进AP2a基因表达及骨髓间充质干细胞成骨分化

目的研究转录因子AP2a的组蛋白甲基化状态对骨髓间充质干细胞成骨分化功能的影响。方法利用染色质免疫沉淀技术检测AP2a启动子甲基化状态。利用慢病毒载体的AP2ashRNA基因敲除AP2a进行丧失性功能研究。通过ALP活性、茜素红染色及钙离子定量分析研究骨髓间充质干细胞体外成骨分化能力。结果与牙源性间充质干细胞相比,AP2a在骨髓间充质干细胞中表达明显升高,AP2a启动子区域H3K4me3和H3K36me2明显增强。基因敲除AP2a能抑制骨髓间充质干细胞ALP活性及体外矿化能力。结论AP2a启动子区域H3K4me3和H3K36me2升高可以促进AP2a的表达和骨髓间充质干细胞成骨分化能力。     

BMP9联合NGF对C3H10T1/2间充质干细胞骨向分化能力影响的实验研究

目的:探讨骨形态发生蛋白9(BMP9)与神经生长因子(NGF)联合处理对间充质干细胞(MSCs)骨向分化的影响.方法:以重组腺病毒法将BMP9导入C3H10T1/2细胞,构建MSCs骨向分化实验模型,设定分组为绿色荧光(GFP)对照组、NGF单独处理组、BMP9单独处理组以及BMP9+ NGF联合处理组,分别在处理3h、12 h、24 h、48 h、3d、7d后检测早期成骨分化标志物Ⅰ型胶原、Runt相关转录因子2(RUNX2)和碱性磷酸酶(ALP)在细胞中的表达.检测方法采用ALP染色、实时定量RT-PCR检测mRNA转录水平以及Western blot检测蛋白表达.结果:BMP9+ NGF组较各单独处理组ALP活性显著增加,Ⅰ型胶原、RUNX2的mRNA水平在BMP9+ NGF组的表达明显高于其他各单独处理组,且各组在3h即出现显著差异;RUNX2蛋白在各实验组均表达,BMP9+ NGF组表达最高.结论:BMP9联合NGF在成骨诱导间充质干细胞分化早期,协同促进其骨向分化.     

川续断皂苷Ⅵ对小鼠成肌细胞成骨分化的影响

目的 探讨川续断皂苷Ⅵ对小鼠成肌细胞成骨分化的作用及影响.方法 配制浓度为1×10-8～1×10-3 mol/L的川续断皂苷Ⅵ药物溶液,用细胞计数试剂盒8检测其对小鼠成肌细胞的细胞毒性和增殖能力.然后用碱性磷酸酶活性分析确定促进其成骨分化的最佳浓度.最后采用免疫印迹分析、实时定量PCR和茜素红染色观察成骨分化效果.结果...     

碳点示踪并促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的初步研究

目的:利用长波长碳点(CDs)标记大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),探讨其示踪可能性及对细胞成骨分化的影响.方法:用透射电镜(TEM)、傅立叶红外光谱仪(FT-IR)检测CDs表征;用CCK-8法和流式细胞术筛选出CDs最佳成像浓度,将最佳浓度的CDs与BMSCs共培养后,通过多种跨膜抑制剂及4℃低温条件,探讨细胞摄...     

Odontoblast marker gene expression is enhanced by a CC-chemokine family protein MIP-3alpha in human mesenchymal stem cells

OBJECTIVE: Macrophage inflammatory protein-3 alpha (MIP-3alpha) is a major CC-chemokine family protein, which serves as a differentiation factor for mesenchymal cells, including osteoblasts and dental pulp cells. The purpose of this study was to investigate the influence of MIP-3alpha on human mesenchymal stem cell differentiation in vitro. DESIGN: Human mesenchymal stem cells were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium in the presence or absence of MIP-3alpha and the presence or absence of osteogenic factors (dexamethasone, beta-glycerophoshate and ascorbic acid). Alkaline phosphatase (ALP) activity was measured, and expression of odontoblast and osteoblast markers were examined by RT-PCR and Western blotting. RESULTS: MIP-3alpha alone did not increase ALP activity, as compared to controls. The combination of MIP-3alpha and osteogenic factors increased ALP activity beyond increases observed with osteogenic factors alone. mRNA expression of the odontoblast marker dspp was only detectable when MIP-3alpha was added together with osteogenic factors at day 7 in three out of four samples. DSP protein level was increased only in the samples treated with both MIP-3alpha and osteogenic factors until day 5. In contrast, MIP-3alpha did not influence levels of the osteoblast markers CBFA1 or BSP. CONCLUSIONS: The present study demonstrated that MIP-3alpha enhanced gene expression and protein levels of odontoblast-related genes, without affecting levels of the osteogenic proteins CBFA1 or BSP.     

Differentiation of osteoprogenitor cells is induced by high-frequency pulsed electromagnetic fields

Craniofacial defect repair is often limited by a finite supply of available autologous tissue (ie, bone) and less than ideal alternatives. Therefore, other methods to produce bony healing must be explored. Several studies have demonstrated that low-frequency pulsed electromagnetic field (PEMF) stimulation (ie, 5-30 Hz) of osteoblasts enhances bone formation. The current study was designed to investigate whether a Food and Drug Administration-approved, high-frequency PEMF-emitting device is capable of inducing osteogenic differentiation of osteoprogenitor cells. Osteoprogenitor cells (commercially available C3H10T1/2 and mouse calvarial) in complete Dulbecco modified Eagle medium were continuously exposed to PEMF stimulation delivered by the ActiPatch at a frequency of 27.1 MHz. Markers of cellular proliferation and early, intermediate, and terminal osteogenic differentiation were measured and compared with unstimulated controls. All experiments were performed in triplicate. High-frequency PEMF stimulation increases alkaline phosphatase activity in both cell lines. In addition, high-frequency PEMF stimulation augments osteopontin and osteocalcin expression as well as mineral nodule formation in C3H10T1/2 cells, indicating late and terminal osteogenic differentiation, respectively. Cellular proliferation, however, was unaffected by high-frequency PEMF stimulation. Mechanistically, high-frequency PEMF-stimulated osteogenic differentiation is associated with elevated mRNA expression levels of osteogenic bone morphogenetic proteins in C3H10T1/2 cells. Our findings suggest that high-frequency PEMF stimulation of osteoprogenitor cells may be explored as an effective tissue engineering strategy to treat critical-size osseous defects of the craniofacial and axial skeleton. ABBREVIATIONS: ALP, alkaline phosphatase; BMP, bone morphogenetic protein; ERK-1, extracellular signal-regulated kinase 1; iCALs, immortalized calvarial cells; IHC, immunohistochemical; MAP, mitogen-activated protein; MSC, mesenchymal stem cell; OCN, osteocalcin; OPN, osteopontin; p38α, p38-reactivating kinase; PBS, phosphate-buffered saline; PEMF, pulsed electromagnetic field.     

高糖对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的：探讨不同葡萄糖浓度培养环境对人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSC）增殖和成骨分化的影响。方法用含不同葡萄糖浓度的基础培养基培养,在1、4、7、10 d进行CCK?8细胞增殖检测;用含不同葡萄糖浓度的成骨诱导分化培养基培养细胞7 d,观察hBMSC分化情况;实时荧光定量PCR法检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、骨钙素（osteocalcin,OC）、I型胶原蛋白（collagen type I, Col?1）基因表达水平;在7 d进行钙茜素红染色显示矿化结节形成。结果10 mM葡萄糖有助于hBMSC细胞增殖,高浓度葡萄糖（＞30 mM）能够抑制hBMSC增殖（P＜0.05）;成骨诱导液能诱导hBMSC成骨分化,但葡萄糖浓度升高会减少hBMSC的矿化结节形成、抑制成骨标志基因ALP、OC和Col?1表达（P＜0.05）。结论在高糖环境培养下,抑制hBMSC增殖、下调成骨标志性基因Col?1、ALP、OC的表达,同时高糖可以减弱干细胞的成骨矿化能力,间接影响骨形成和代谢。     

大鼠颌骨与胫骨骨髓基质细胞生物学特性和基因表达差异的比较

目的 :比较大鼠颌骨来源骨髓基质细胞(M-BMSCs)与胫骨来源骨髓基质细胞(T-BMSCs)生物学特性的差异。方法:体外通过全骨髓贴壁法,分离和培养SD大鼠M-BMSCs和T-BMSCs,取第3代细胞用于:1流式细胞检测鉴定表面标志;2MTT、细胞周期、克隆形成率检测细胞增殖能力差异;3成骨、成脂诱导及染色检测细胞多项分化潜能;4碱性磷酸酶(ALP)活性、染色、免疫荧光染色检测细胞成骨活性的差异;5荧光定量PCR检测Wnt1、Wnt5a、Hoxa11、Runx2、Ocn、Col I的表达差异和成骨诱导后各基因的表达变化。结果:1 M-BMSCs和T-BMSCs阳性表达CD29、CD44,阴性表达CD45;2MTT、细胞周期检测、克隆形成率显示T-BMSCs细胞增殖能力较高;3M-BMSCs在成骨诱导后矿化能力更强;而T-BMSCs成脂诱导形成脂滴的能力更强;4M-BMSCs表达ALP的水平更高;5荧光定量PCR示2种细胞的Wnt1、Wnt5a、Hoxa11、Runx2、Ocn、ColⅠ表达存在差异。结论:体外培养的M-BMSCs和TBMSCs有着不同的生物学特点,其相关基因Wnt1、Wnt5a、Hoxa11、Runx2、Ocn、ColⅠ的表达上存在差异。