实时荧光定量PCR法检测门冬氨酸鸟氨酸原料药中毕赤酵母菌DNA残留量

目的 建立可定量检测门冬氨酸鸟氨酸原料药中毕赤酵母菌DNA残留量的实时荧光定量PCR方法。方法 采用宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒（磁珠法）提取毕赤酵母菌DNA,利用毕赤酵母残留DNA检测试剂盒（PCR-荧光探针法）进行扩增反应,绘制标准曲线,建立毕赤酵母菌DNA残留量的Real-time PCR检测方法,并验证其准确性和精密性。结果 毕赤酵母菌DNA质量浓度在0.03~300 pg·μL^-1内线性良好（r>0.99）,定量限为0.03 pg·μL^-1;应用该法对3批门冬氨酸鸟氨酸原料药进行测定,毕赤酵母菌DNA残留量均远低于每剂10 ng。结论 该方法可用于门冬氨酸鸟氨酸原料药中毕赤酵母菌DNA残留量的定量测定。     

定量PCR法和DNA杂交法检测聚乙二醇修饰尿酸酶原液中DNA残留量的比较

目的 建立快速准确的聚乙二醇修饰重组尿酸酶(PEGylated uricase，PEG-UHC)原液DNA残留量测定法，为其他多位点PEG修饰蛋白药物的DNA残留量检测提供参考。方法 参照中国药典2020年版三部“外源性DNA残留量检测法”第一法DNA探针杂交法和第三法定量PCR法，检测PEG-UHC原液DNA残留量；对定量PCR法进行检测限度、线性范围、准确度和精密度等方法学验证；进行3批次PEG-UHC原液DNA残留量测定。结果 探针杂交法DNA残留量测定线性范围为1×10^-4~0.1 ng·μL^-1，3批次PEG-UHC原液未见明显显色，DNA残留量均低于每剂10 ng。PCR法检测限度为1×10^-5 ng·μL^-1，DNA浓度在1×10^-4~100 ng·μL^-1内线性关系良好(R²=0.999)。不同浓度的标准DNA在PEG-UHC原液中的回收率范围为92.57%~114.17%，表明PEG偶联物对定量PCR影响较小。3批次PEG-UHC原液中DNA残留量分别为每剂0.143，0.187，0.154 ng，符合国家药品监督管理局限量要求。结论 DNA探针杂交法为传统定性检测，耗时较长，准确度较低。定量PCR法操作简便快速、灵敏度高，且可定量分析，适于PEG-UHC等多位点PEG修饰蛋白药物DNA残留量测定。     

菟丝草质量标准研究

目的：建立菟丝草质量标准。方法：采用TLC法鉴别;采用HPLC法测定菟丝草中金丝桃苷的含量,色谱柱为Agilent Eclipse TC-C18 （250 mm×4.6 mm,5 μm）,流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（17∶83）,流速为1.0 mL·min^-1,柱温为30 ℃,检测波长360 nm。 结果：TLC色谱斑点清晰,金丝桃苷在2.568~206.4 μg·mL^-1范围内线性关系良好（r=0.9999）,平均回收率为100.18%,RSD为2.09% （n=9） 。结论：本方法准确、简便、灵敏度高,能有效控制菟丝草药材的质量。     

道地药材天麻DNA真伪鉴定试剂盒的研制与评价

目的 建立一种将DNA提取技术与PCR技术相结合的天麻DNA真伪鉴定试剂盒,并对试剂盒性能进行方法学评价。方法 通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)查找天麻及其常见伪品紫茉莉根、大丽菊块茎、马铃薯的ITS2序列,应用DNAMAN进行多序列比对,NCBI-Primer-Blast设计天麻特异性引物。改良植物常用DNA提取的CTAB法,确保提取出高效的正品天麻及其常见伪品的基因组DNA,应用紫外分光光度法测其浓度及纯度。优化PCR反应体系,确定试剂盒的组成与反应条件,随机抽样检测市售天麻样品。结果 应用所研制的试剂盒提取样品DNA,纯度OD260 /OD280值为(1.87±0.13),灵敏度为10 ng·μL^-1,3次重复性检测结果相同,反复冻融 5、10、15、20次对检测效果无影响,于-20 ℃可保存1年,检测10个市售天麻样品,其中7个是正品,3个是伪品。结论 道地药材天麻DNA真伪鉴定试剂盒特异性强,灵敏度高,重复性和稳定性均良好,检测结果准确,适用于天麻及其常见伪品的快速鉴别。     

HPLC法测定还原型谷胱甘肽原料药有关物质

目的  建立一种测定还原型谷胱甘肽中有关物质的反相高效液相色谱法。方法  色谱柱：Agilent Zorbax SB-Aq；以磷酸盐缓冲溶液-甲醇体系为流动相；流速为1.0 mL·min^-1；柱温为30 ℃；检测波长为210 nm。结果  该方法精密度试验RSD≤5.0%；谷胱甘肽及杂质A、B、C、D在线性范围内线性相关系数 r≥0.999 7，检出限分别为0.002 9、0.003 4、0.003 1、0.005 5、0.004 1 μg，定量限分别为0.005 8、0.006 7、0.006 1、0.011、0.0081 μg；加标回收率分别为100.9%、99.4%、98.2%、103.2%。结论  该方法准确、灵敏，适用于谷胱甘肽中有关物质的检测。     

市售天山堇菜药材质量评价研究

目的 补充提高维药天山堇菜药材质量标准。方法 采用生药鉴别方法对市售天山堇菜药材进行性状特征、显微特征及薄层色谱定性鉴别;采用Agilent TC-C₁₈色谱柱（4.6 mm×150 mm,5 μm）;流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液（15：85）;柱温35℃,检测波长349 nm,流速0.8 mL·min^-1,对天山堇菜药材中秦皮乙素含量进行测定。采用中国药典2015年版一部附录项下方法对天山堇菜中醇溶性浸出物、水分、总灰分和酸不溶性灰分进行测定。结果 对天山堇菜药材性状特征、显微特征进行了专属描述确定;10批市售天山堇菜药材进行了薄层定性鉴别;活性成分秦皮乙素在0.1~3.0 μg·mL^-1（r=0.999 3）内呈良好的线性关系,平均回收率为98.56%（RSD=1.90%）。确定了天山堇菜中秦皮乙素、醇溶性浸出物、水分、总灰分和酸不溶性灰分的检查限度。结论 补充提高建立的维药天山堇菜质量控制方法简便、准确、稳定,可以用于天山堇菜药材的质量控制。     

顶空气相色谱法测定左卡尼汀原料药中三甲胺的含量

目的 建立了气相色谱法准确测定左卡尼汀原料药中三甲胺的检测方法。方法 采用程序升温法,FID检测器,色谱柱为Pora PLOT Amines毛细管柱(25 m×0.32 mm×10 μm)进行测定。结果 在选定的测定条件下,三甲胺在0.081 6~4.079 7 μg﹒mL^-1范围内与峰面积呈良好的线性关系,相关系数为0.999 1,平均回收率为99.6%（RSD=1.9%）,检测限为0.025 0 μg﹒mL^-1。结论 该气相色谱方法准确,灵敏度高,可用于左卡尼汀原料药中三甲胺的质量控制。     

GC-MS/MS测定坎地沙坦酯片中基因毒性杂质1-氯乙基环己基碳酸酯

目的 建立GC-MS/MS分析方法测定坎地沙坦酯片中基因毒性杂质1-氯乙基环己基碳酸酯。方法 采用DB-5MS(30 m×0.25 mm,0.25 μm)毛细管柱,程序升温,初始温度80 ℃,以20 ℃·min^–1的速率升至300 ℃,维持5 min,以氦气为载气,流速1.0 mL·min^–1,多反应监测模式检测。结果 1-氯乙基环己基碳酸酯在4.4~437.8 ng·mL^–1内线性关系良好,定量限为4.4 ng·mL^–1,检测限为2.2 ng·mL^–1,平均回收率为95.6%(RSD=6.3%,n=9)。结论 本法操作简单、灵敏度高、准确性好,适用于坎地沙坦酯片中基因毒性杂质1-氯乙基环己基碳酸酯的检测。     

注射用美洛西林钠有关物质测定方法的改进

目的 改进注射用美洛西林钠有关物质测定方法,提高杂质的检出率。方法 采用C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）,采用梯度洗脱,流速1.2 mL· min^-1,检测波长为210 nm。结果 在上述色谱条件下,美洛西林与相邻的杂质的分离度良好,定量限为9 ng,在30.07~240.56 ng范围内线性关系良好(r=0.999 7)。杂质的个数及杂质总量较药典方法有明显提高。结论 改进后的方法简单、快速,能更好的检出注射用美洛西林钠中的杂质。     

GC-MS法定性定量分析贴敷类医疗器械中樟脑、薄荷脑、冰片

摘 要 目的:利用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）建立贴敷类医疗器械中樟脑、薄荷脑、冰片的定性和定量分析方法。方法: 采用Agilent HP-INNOWax (30 m×0.25 mm,0.25 μm)毛细管色谱柱;以氦气为载气,流量为1.0 ml·min^-1;柱温80℃维持2 min,以10℃·min^-1的升温速率升至120℃,维持12 min,再以30℃·min^-1的升温速率升至200℃,维持3 min;离子源为电子轰击电离（EI）源,采集模式为全扫描/选择离子检测。结果:能检测出样品中是否添加樟脑、薄荷脑、冰片,并对其进行定量。3种化合物的线性范围分别为1.742～2.177×10³(r=0.998 9),1.982～2.478×10³(r=0.998 9),1.999～2.499×10³ μg·ml^-1(r=0.999 8),线性关系均良好;平均回收率分别为93.3%,98.8%,94.9%(n=9)。结论:方法简便、灵敏、准确、快速,可用于贴敷类医疗器械中樟脑、薄荷脑、冰片的定性和定量检测。     

HPLC法测定金钱白花蛇药酒中士的宁与马钱子碱的含量

目的: 建立高效液相色谱同时测定金钱白花蛇药酒中士的宁与马钱子碱含量的方法。方法:色谱柱采用Shim-pack VP-ODS C₁₈(4.6 mm×150 mm,5 μm),流动相为乙腈-0.02 mol·L^-1磷酸二氢钾与0.01 mol·L^-1庚烷磺酸钠等量混合溶液(用10%磷酸调节pH值2.8)(19:81);流量1.0 mL·min^-1;检测波长260 nm;柱温35℃。结果:士的宁与马钱子碱的线性范围分别为65.2~1 304 ng,63.4~1 274 ng;加样回收率分别为98.58%(RSD=2.46%,n=6),101.14%(RSD=2.92%,n=6)。结论:所建方法准确可靠,可用于金钱白花蛇药酒中毒性药材马钱子的质量控制。     

HPLC法测定五味清浊散中羟基红花黄色素A的含量

摘 要 目的:建立五味清浊散中羟基红花黄色素A的高效液相色谱测定方法。方法: 色谱柱为Prevail Select C₁₈（150 mm ×4.6 mm,5 μm）,柱温35℃;流动相为乙腈-0.5% 磷酸溶液 (11∶89),流速 1 ml·min^-1;检测波长403 nm。结果:羟基红花黄色素A在16.65～166.50 μg·ml^-1范围内呈良好的线性关系,回归方程为Y=3.24×10^-2X+2.12,r=0.999 9。平均回收率为99.1%,RSD为1.9%。结论:本方法操作简便,测定结果准确可靠,可用于五味清浊散中羟基红花黄色素A的含量测定。     

多色探针熔解曲线法在卡马西平不良反应相关基因检测中的临床评价

目的 对多色探针熔解曲线法（multicolor melting curve analysis,MMCA）用于卡马西平不良反应相关的HLA-B^*15：02基因检测进行临床评价。方法 收集厦门市中心血站1 147份厦门地区无偿献血者的外周静脉血样本,经基因DNA提取后,按双盲对照试验,分别应用MMCA法和HLA-SBT测序法对各样本进行HLA-B^*15：02基因检测,比较2种检测方法的符合率。对于检测结果不一致的标本,采用第三方Sanger测序和电泳验证,计算总符合率。结果 采用MMCA法共检出77份HLA-B^*15：02阳性标本,1 070份HLA-B^*15：02阴性标本。采用HLA-SBT测序法共检出74份HLA-B^*15：02阳性标本,1 070份HLA-B^*15：02阴性标本,以及3份无明确的分型信息的标本（仅显示为B^*15：VG-B^*15：CYS型）。该3份标本经Sanger测序以及电泳验证,确认为HLA-B^*15：02阳性标本。因此,MMCA法检测HLA-B^*15：02基因的阳性检出率为100%（77/77）,阴性检出率为100%（1 070/1 070）,总符合率为100%（1 147/1 147）。此外,在1 147份临床标本中共检出77份阳性结果,HLA-B^*15：02的携带率为6.7%（77/1147）,这与文献报道的数据基本一致。结论 MMCA法用于HLA-B^*15：02基因的检测,具有简便、快速、灵敏度高、特异性强等优点,可应用于卡马西平不良反应相关的HLA-B^*15：02基因的临床辅助检测。     

组分百日咳疫苗安全性检测体外替代方法的应用和初步评价

目的：用一种组分百日咳疫苗残留毒性的体外替代检测方法，更稳定和客观地评价疫苗成品的生产一致性。方法：验证直接定性法和间接定量法2种中华仓鼠卵巢细胞簇集试验方法，分别对6个国内外厂家的10种组分百日咳疫苗产品毒性进行定量和定性检测，并使用百日咳毒素参考品将体外法与小鼠组胺致敏试验进行桥接和初步评价。结果：体外定量试验的灵敏度为0.0026±0.0003 IU·mL^-1，几何变异系数为13%，体外定性试验的灵敏度为0.0067±0.0016 IU·mL^-1，几何变异系数为24%，组胺致敏试验的灵敏度为3.3 IU·mL^-1；所有样品的体外定性结果均为阴性，小鼠组胺致敏试验结果均合格，体外定量结果与小鼠组胺致敏结果具有良好的相关性（r=0.737，P＜0.05）。结论：本研究在国内首次使用 CHO细胞簇集试验方法检测百日咳疫苗成品，并进行了初步评价。该方法灵敏度高于小鼠组胺致敏试验，可应用于百日咳疫苗毒性及毒性逆转检测。该方法需要更广泛的推广应用和数据积累，以达到完全替代动物实验的目标。     

壮药金钮扣定性定量方法研究

目的： 建立金钮扣药材的定性定量质量控制方法,考察广西不同产地、不同采收时节金钮扣的药材质量。方法：以乙酸丁酯-乙酸乙酯-甲酸-水（11∶3∶1.5∶1.5）为展开剂,采用TLC法对金钮扣进行定性鉴别。用C18色谱柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）,柱温30℃,以乙腈-0.4%磷酸溶液（10∶90）为流动相,流速1.0 mL·min^-1,检测波长为327 nm,采用HPLC法对金钮扣中的绿原酸进行含量测定。结果：薄层板上斑点清晰,分离度好;绿原酸在2.032~25.40μg·mL^-1（r=0.9995）线性关系良好;加样回收率（n=6）为100.9%,RSD为1.2%,所测得的13批样品含量在0.042~0.741 mg·g^-1之间。结论：该方法简便、准确,重复性好,可用于壮药金钮扣药材的质量控制。     

基于离子交换色谱法检测结核治疗性DNA疫苗纯度的方法建立

目的 建立并验证结核治疗性DNA疫苗纯度的高效液相色谱测定方法。方法 采用TSK gel DNA-NPR（4.6 mm ×75 mm, 2.5 µm）色谱柱,流动相：以20 mmol·L^-1 三羟甲基氨基甲烷（pH=9）为流动相A,以20 mmol·L^-1三羟甲基氨基甲烷-1 mol·L^-1 氯化钠（pH=9）为流动相B,梯度洗脱,柱温：25 ℃;流速：0.5 mL·min^-1;检测波长：260 nm。结果 质粒DNA在0.5～2.5 µg的范围内与峰面积呈良好线性关系,R²=0.999 8,该法专属性、精密度和耐用性良好,检测限为0.001 mg·mL^-1,供试品在 24 h内稳定。结论 该方法符合检测结核治疗性DNA疫苗纯度的要求,适用于该产品的质量控制。     

鹿类中药材的位点特异性PCR鉴定研究

目的　建立一种简便、准确的鹿类中药材鹿茸、鹿鞭、鹿筋、鹿胎的DNA分子标记鉴定方法。方法　在对鹿类中药材的正品原动物梅花鹿、马鹿及其混伪品原动物的Cyt b 基因全序列分析的基础上,设计了一对专用于鉴定正品鹿类药材的位点特异性鉴别引物ILu01-L和ILu01-H。结果　在6 4℃的复性温度下,用鉴别引物对原动物样品进行鉴别PCR ,仅正品能得到约365bp阳性扩增带;对鹿茸、鹿鞭及鹿筋正、伪品药材进行PCR鉴定,结果表明:3批鹿茸仅一批为正品,2批鹿鞭皆为伪品,鹿筋正、伪品药材PCR鉴定与形态鉴定结果一致。随机选取2枚鹿茸及一个原动物做Cyt b 基因片段序列分析,其结果与PCR鉴定完全一致。结论　对市售鹿类商品药材需加强质量监督和管理。所设计的鉴别引物对梅花鹿、马鹿有高度特异性,可应用于以其为原动物的鹿类中药材的鉴定。     

HPLC测定当归中1-(3',4'-dihydroxycinnamoyl)-cyclopentane-2,3-diol的含量

目的 建立HPLC测定当归中1-（3'',4''-dihydroxycinnamoyl）-cyclopentane-2,3-diol含量的方法。方法 采用Inertsil ODS-3 C₁₈柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）,流动相为乙腈-0.05%三氟乙酸水溶液梯度洗脱,流速为1.0 mL·min^-1,检测波长为325 nm,柱温为30℃。结果 1-（3'',4''-dihydroxycinnamoyl）-cyclopentane-2,3-diol进样量在0.023 36~1.168 0 μg（r=1.000 0）内与峰面积呈良好的线性关系,平均回收率为95.33%,RSD为1.88%。结论 该方法简便、准确、重复性好,可为当归药材的质量控制提供参考。     

用紫外导数分光光度法测定复方替米沙坦氨氯地平片的含量

目的 测定复方片中替米沙坦和氨氯地平的含量。方法 采用紫外导数分光光度法,替米沙坦测定波长为236 nm,氨氯地平测定波长为390 nm。结果 替米沙坦浓度在（4~20）×10^-3mg/ml范围内与一阶导数值有良好的线性关系,其标准曲线方程为Y=0.0043X-0.0005,R²=0.9993;氨氯地平浓度在（10~90）×10^-3 mg/ml范围内与一阶导数值有良好的线性关系,其标准曲线方程为Y=0.0003X+0.0002,R²=0.9995。结论 该方法具有较好的灵敏度、准确度和精密度;样品检测结果与HPLC法基本一致;是测定复方替米沙坦氨氯地平片含量的一种较好的分析方法。     

复可托产品及原料中6种猪病毒基因膜芯片检测方法研究

目的 利用基因膜芯片技术建立复可托产品及原料中6种猪病毒快速检测方法。方法 设计6种猪病毒特异性引物及探针，对样本核酸进行多重PCR扩增，进一步利用基因膜芯片技术进行产物杂交并分析判定。结果 建立的检测方法特异性强，稳定性好，灵敏度高，综合检测限为1.0×10⁵ copies·mL^-1，满足日常检验要求。结论 建立了6种猪病毒PCR-基因膜芯片技术的快速筛查方法，可保障复可托产品及原料的质量安全，该技术可进一步应用于养殖场和市场的猪肉检测，为政府监管部门提供有力的技术支撑。