NF-κB信号通路的激活与椎间盘退变的关系

[目的]探讨NF-κB信号通路在椎间盘退变中的激活机制及其作用。[方法]按照Pfirrmann椎间盘退变分级系统对患者进行分级,分别收集2012~2013年上海市第一人民医院手术患者的正常和退变椎间盘组织(退变102例,正常9例),生化检测试剂盒测定椎间盘组织中丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)含量;凝胶迁移试验(EMSA)检测细胞核内NF-κB蛋白结合活性;RT-PCR和Western blotting检测凋亡相关分子CHOP和Caspase-3表达。[结果]椎间盘退变组织中MDA、MPO水平较正常对照组明显增加;EMSA显示髓核细胞核中NF-κB活性增高;RT-PCR和Western blotting结果显示椎间盘退变组织中凋亡相关分子CHOP和Caspase-3水平明显增高。[结论]髓核细胞受氧化应激作用后可通过激活NF-κB通路导致细胞凋亡从而在椎间盘退变中发挥作用。     

吡咯烷二硫代氨基甲酯调节大鼠退变椎间盘IL-6和MMP-9表达及机制研究

[目的]观察吡咯烷二硫代氨基甲酯(PDTC)对大鼠颈椎动力失衡模型颈椎间盘组织形态及白介素-6(IL-6)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响,探讨炎性因子在颈椎间盘退变中的作用及其调控机制。[方法]54只SD大鼠随机分为三组,手术切断大鼠颈后部浅、深肌群构建颈椎间盘退变动物模型。PDTC组:大鼠造模术后腹腔每日注射PDTC直至处死,生理盐水组:大鼠造模术后腹腔每日注射生理盐水直至处死,空白对照组:手术切开大鼠颈后部皮肤后立即缝合并每日腹腔给予生理盐水直至处死。分别于术后10、12、16周处死动物,获取C_(5、6)椎间盘组织,光镜下观察椎间盘形态改变,q-PCR检测椎间盘组织中IL-6、MMP-9mRNA表达;Western blot检测椎间盘组织中IL-6、MMP-9蛋白表达。[结果]随时间推移,生理盐水组椎间盘组织结构破坏,纤维环排列紊乱,而PDTC组椎间盘组织结构破坏程度轻。椎间盘组织中都检测到IL-6、MMP-9基因及蛋白表达。空白组各时间点IL-6、MMP-9mRNA蛋白表达无明显变化(P0.05)。PDTC组及生理盐水组IL-6、MMP-9 mRNA表达量随实验时间的延长而增多,但增速逐渐缓慢。各时间点PDTC组IL-6、MMP-9 mRNA表达量较生理盐水组明显降低(P0.01)。12周、16周PDTC组IL-6蛋白表达量显著低于生理盐水组(P0.01),而第10周两组间差异无统计学意义(P0.05)。各时间点PDTC组MMP-9蛋白表达量较生理盐水组明显降低(P0.01),以12周时最明显。[结论]大鼠颈椎动力失平衡模型的退变椎间盘组织结构破坏明显,椎间盘中IL-6、MMP-9炎性因子大量表达,NF-κB信号通路参与了IL-6、MMP-9表达变化的调节,PDTC有望成为预防颈椎间盘退变的潜在药物。     

褪黑素受体在不同程度退变腰椎髓核组织中的表达

目的:研究褪黑素受体褪黑素1型受体(MT1)、褪黑素2型受体(MT2)以及核转录因子-κB(NF-κB)在不同程度退变腰椎髓核组织中的表达。方法:选取2014年3月～2016年1月于我院住院患者31例(19例男性和12例女性,年龄47～62岁,平均56.9±4.9岁)。采用MRI对髓核退变程度进行Pfirrmann分级并经手术收集髓核标本,其中Ⅳ级标本11例纳入退变Ⅰ组;V级标本12例纳入退变Ⅱ组;8例分级小于Ⅲ级标本纳入对照组。实时定量PCR检测髓核组织中MT1、MT2、NF-κB mRNA的表达,免疫印迹和免疫组织化学技术检测MT1、MT2、p65 NF-κB和磷酸化p65 (p-p65)NF-κB蛋白的表达,利用Spearman相关分析退变髓核组织中MT1、MT2、NF-κB蛋白表达的关系。结果 :实时定量PCR结果显示对照组MT1和MT2 mRNA分别为1.00±0.04和1.00±0.04,退变Ⅰ组MT1和MT2 mRNA分别为0.68±0.06和0.77±0.04,退变Ⅱ组MT1和MT2 mRNA分别为0.52±0.03和0.68±0.06,各组间均存在统计学差异(P0.05)。各组NF-κB mRNA分别为1.00±0.03、0.99±0.07、0.98±0.05,无统计学差异(P0.05)。免疫印迹结果显示对照组MT1和MT2蛋白表达分别为1.00±0.05和1.00±0.05,退变Ⅰ组为0.73±0.07和0.56±0.04,退变Ⅱ组别为0.62±0.05和0.55±0.04,各组间差异有统计学意义(P0.05)。三组p65 NF-κB表达水平分别为1.00±0.05、1.00±0.06、0.99±0.04,无统计学差异(P=0.920)。对照组p-p65 NF-κB蛋白为1.00±0.07,退变Ⅰ组和退变Ⅱ组p-p65 NF-κB蛋白水平分别为1.43±0.08和1.49±0.08,各组间差异有统计学意义(P0.05)。免疫组织化学技术检测结果显示退变髓核组织MT1和MT2蛋白与p-p65蛋白表达具有负相关关系(P0.05),相关系数r分别为-0.6492和-0.6190。结论 :髓核组织退变程度增加,褪黑素受体表达降低,而NF-κB活化增加,进而参与椎间盘组织退变过程。     

长链非编码RNA MEG3靶向下调miR-21对IL-1β诱导的软骨细胞凋亡及炎症反应的影响

目的探究长链非编码RNA母系表达基因3(MEG3)靶向miR-21的作用对白细胞介素1β(IL-1β)诱导的软骨细胞凋亡及炎症反应的影响及其作用机制。方法将细胞分为cTRL组、IL-1β组、LV-MEG3组、miR-21 mimic组和LV-MEG3+mimic组,用IL-1β处理软骨细胞后,加入对应的慢病毒或miRNA mimic处理细胞。RT-PCR检测MEG3、miR-21、基质金属蛋白酶13(MMP-13)、II型胶原蛋白(Collagen II)、聚蛋白聚糖(Aggrecan)基因表达水平,Hoechst检测细胞凋亡,Western blot检测活化半胱天冬酶3(cl-Caspase-3)、cl-Caspase-9、MMP-13、Collagen II、Aggrecan蛋白表达水平和p65、信号传导及转录激活因子3(STAT3)磷酸化比率,试剂盒检测丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6、IL-10水平,免疫荧光检测p65的核定位情况。结果与cTRL组比较,IL-1β组miR-21表达,细胞凋亡率,MMP-13基因表达,cl-Caspase-3、cl-Caspase-9、MMP-13蛋白表达,MDA、LDH、TNF-α、IL-6水平,p65和STAT3磷酸化比率,p65核内信号水平升高,MEG3表达,Collagen II、Aggrecan基因和蛋白表达,SOD、GSH、IL-10水平降低;与IL-1β组比较,LV-MEG3组miR-21表达,细胞凋亡率,MMP-13基因表达,cl-Caspase-3、cl-Caspase-9、MMP-13蛋白表达,MDA、LDH、TNF-α、IL-6水平,p65和STAT3磷酸化比率,p65核内信号水平降低,MEG3表达水平,Collagen II、Aggrecan基因和蛋白表达水平,SOD、GSH、IL-10水平升高;miR-21 mimic组各项检测指标的变化与LV-MEG3组相反;与miR-21 mimic组比较,LV-MEG3+mimic组miR-21表达,细胞凋亡率,MMP-13基因表达,MMP-13、cl-Caspase-3、cl-Caspase-9蛋白表达,MDA、LDH、TNF-α、IL-6水平,p65和STAT3磷酸化比率,p65核内信号水平降低,MEG3表达水平,Collagen II、Aggrecan基因和蛋白表达,SOD、GSH、IL-10水平升高。结论MEG3可下调miR-21表达,从而抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡,缓解炎症反应,其作用机制可能与抑制NF-κB信号通路激活有关。     

长链非编码RNA NEAT1调控miR-486/FOXO1轴参与椎间盘髓核细胞退变的机制研究

【摘要】 目的：明确长链非编码RNA核富集转录本1（lncRNA NEAT1）、miR-486、FOXO1之间的相互关系,探讨三者在椎间盘退变（intervertebral disc degeneration,IDD）组织中的表达及相关性,阐明NEAT1通过调控miR-486/FOXO1轴参与IDD进展的具体机制。方法：利用双荧光素酶报告基因、RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation,RIP）试验等明确NEAT1、miR-486与叉头框蛋白O1（forkhead box protein O1,FOXO1）的生物学关系;采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）、免疫印迹（Western blot）检测15例对照和30例IDD髓核组织中NEAT1、miR-486与FOXO1的表达,统计其与Pfirrmann分级的关系;采用白细胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）诱导法构建髓核细胞退变模型,NEAT1小干扰RNA（NEAT1 small interfering RNA,si-NEAT1）和过表达质粒转染髓核细胞构建细胞沉默或过表达模型;细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）和流式细胞术检测髓核细胞增殖和凋亡;RT-qPCR检测细胞NEAT1与miR-486表达;Western blot检测FOXO1及细胞外基质（extracellular matrix,ECM）中聚集蛋白聚糖（aggrecan）、二型胶原（collagen Ⅱ）、基质金属蛋白酶-13（matrix metalloproteinase, MMP-13）和含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样基质金属蛋白酶4（a disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin type l motifs 4,ADAMTS4）的表达。结果：NEAT1可通过碱基互补配对方式海绵吸附miR-486;miR-486靶向FOXO1的3′-非编码区（3′-UTR）抑制FOXO1蛋白表达。在IDD髓核组织中,NEAT1与FOXO1表达上调,与Pfirrmann分级呈显著正相关（P<0.001）;而miR-486表达下调,与Pfirrmann分级呈显著负相关（P<0.001）。分子细胞学实验证实,IL-1β诱导髓核细胞退变后,NEAT1的过表达进一步促进了髓核细胞凋亡（P<0.01）,加重了Aggrecan和Collagen Ⅱ的表达抑制（P<0.01）,增强了MMP-13和ADAMTS4的表达（P<0.01）;相比之下,NEAT1的沉默则逆转了髓核细胞凋亡（P<0.01）,有效恢复了Aggrecan和Collagen Ⅱ表达（P<0.01）,同时显著降低了MMP-13和ADAMTS4的表达（P<0.01）。结论：NEAT1调控miR-486/FOXO1分子轴并促进髓核细胞凋亡和ECM降解进而参与IDD病理机制过程。     

过载静压下益肾活血通络含药血清对人椎间盘髓核细胞凋亡的影响

目的：探讨在过载静压应力下益肾活血通络方含药血清对人椎间盘髓核细胞凋亡的影响及其相关机制。方法：将人椎间盘髓核细胞分为3组,空白组无任何干预,模型组和中药血清干预组在体外3 MPa压应力干预下作用2、4、6 h后,观察椎间盘髓核细胞的形态、生长状况、超微结构的变化及差异;检测椎间盘髓核细胞的凋亡率及髓核细胞内核因子κB p65（nuclear factor kappa-B p65,NF-κB p65）,Y染色体中性别决定区相关的高迁移率组框9（SRY-related high mobility group-box 9,SOX9）,C/EBP同源蛋白（C/EBP-homologous protein,CHOP）,基质金属蛋白酶-13（matrix metalloprotein-13,MMP-13）蛋白和相对应基因表达情况。结果：同一作用时间下模型组髓核细胞与空白组比较：体积缩小、胞浆减少、生长状况更差;中药血清干预组髓核细胞较模型组体积稍大,形态保存更完整,胞浆更丰富,生长状况更好。同一作用时间下空白组髓核细胞超微结构完整,主级突起、次级突起结构未见断裂,模型组与中药血清干预组超微结构破坏,主级突起、次级突起可见不同程度断裂,两组超微结构未见明显差异。相同作用时间下模型组髓核细胞凋亡率高于空白组,而中药血清干预组髓核细胞凋亡率低于模型组（P<0.05）;随作用时间增加,空白组、中药血清干预组椎间盘髓核细胞凋亡率未见明显差异,模型组椎间盘髓核细胞凋亡率增加。相同作用时间下,中药血清干预组较模型组NF-κB p65、CHOP、MMP-13表达减少,SOX9表达增多（P<0.05）;随作用时间的增加,空白组、模型组髓核细胞的NF-κB p65、CHOP、MMP-13表达增多,SOX9表达减少,且模型组表达程度较空白组大（P<0.05）;通过基因表达总体来看,在相同作用时间下,中药血清干预组髓核细胞基因NF-κB p65、CHOP、MMP-13相对定量较模型组均减少,而SOX9相对定量增多（P<0.05）;空白组髓核细胞基因NF-κB p65、CHOP、MMP-13相对定量比模型组减少,而SOX9相对定量增多（P<0.05）;随作用时间的增加,空白组、模型组髓核细胞的NF-κB p65、CHOP、MMP-13相对定量增多,SOX9相对定量减少（P<0.05）。结论：益肾活血通络方能减少过载静压下髓核细胞的凋亡,具有延缓髓核细胞退变的作用,其机制可能通过抑制髓核细胞NF-κB p65信号通路,使CHOP、MMP-13表达减少,SOX9表达增加有关。     

淫羊藿苷对大鼠椎间盘退变的影响

[目的]研究淫羊藿苷(ICA)对大鼠尾椎椎间盘退变(IDD)的影响。[方法]体内实验部分,SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、空白对照组(IDD组)和3个淫羊藿苷处理组(ICAL、ICAM、ICAH)。制备椎间盘退变模型,给予相应处理,并行MIR和细胞因子检测。体内实验部分,自假手术与IDD动物椎间盘髓核分离细胞,体外培养,并给予淫羊藿苷处理(ICAL、ICAM、ICAH),检测细胞和上清的细胞因子等。[结果]体内实验表明,术后2周,与IDD组比较,ICAM组椎间盘T2加权信号强度高;术后6周,IDD组信号消失,ICAM组则无明显改变;ICAM组MRI的Pfirrmann评级均明显低于IDD组(P<0.05)。与Sham组比较,IDD组的IL-1β、IL-6蛋白表达显著增高(P<0.05);与IDD组比较,ICA组的IL-1β、IL-6蛋白表达显著降低(P<0.05)。体外实验显示:IDD组NP细胞增殖率明显降低(P<0.05);而ICA组的NP细胞增殖率明显升高(P<0.05)。与Sham组相比,IDD组NP细胞IL-1β、IL-6表达显著上调(P<0.05);与IDD组比较,ICA各组NP细胞IL-1β、IL-6表达显著下调(P<0.05)。与正常对照组相比,IDD组NP细胞Aggrecan和CollagenⅡmRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与IDD组相比,ICA各组Aggrecan和CollagenⅡmRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。[结论]淫羊藿苷可促进退变髓核细胞增殖、蛋白聚糖及II型胶原蛋白合成,减少IL-1β及IL-6表达,延缓椎间盘退变。     

lncRNA HOXA11-AS抑制骨关节炎大鼠软骨细胞凋亡与基质降解的作用研究

目的研究长链非编码RNA(long-nocoding RNA,lncRNA)HOXA11-AS在骨关节炎(osteoarthritis,OA)的大鼠软骨细胞中的表达情况,及其对软骨细胞凋亡、基质降解以及核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路的影响。方法采用弗氏完全佐剂注射大鼠构建OA大鼠模型,造模后分离培养软骨细胞;小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)技术抑制软骨细胞中HOXA11-AS表达;细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测转染siRNA不同时间后软骨细胞的活力;实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测软骨细胞中HOXA11-AS及基质金属蛋白酶13(matrix metallo protein-13,MMP-13)、血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶5(a disintesrin and metalloprotease with thrombospondin type 5 motifs,ADAMTS-5)、Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)、聚集蛋白聚糖(aggrecan)mRNA的表达情况;流式细胞术检测软骨细胞的凋亡情况;酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)检测软骨细胞上清液中Bcl-2相关X蛋白(Bcl 2-associated X protein,Bax)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)的表达情况;蛋白质印迹法(western blot)检测MMP-13、ADAMTS-5、CollagenⅡ、aggrecan和抗核因子κB抑制蛋白(anti-nuclear factor kappa B inhibitory protein,IκBα)、抗磷酸化核因子κB抑制蛋白(anti-phosphorylated nuclear factor kappa B inhibitory protein,p-IκBα)、抗核因子κB 65(nuclear factor kappa B,NF-κB 65)的表达,免疫荧光染色检测NF-κB在软骨细胞细胞核中的表达情况。结果与正常组大鼠软骨细胞相比,HOXA11-AS在OA大鼠软骨细胞中高表达;与NC siRNA组比较,HOXA11-AS siRNA组细胞活力显著下降,细胞凋亡率及促凋亡因子Bax、Caspase-3的表达水平显著升高,而抑凋亡因子Bcl-2的表达水平显著下降;同时,与NC siRNA组比较,HOXA11-AS siRNA组细胞collagenⅡ和aggrecan的基因和蛋白表达水平明显降低,MMP-13和ADAMTS-5基因及蛋白表达水平明显升高,IκBα蛋白表达水平显著下降而p-IκBα和NF-κB p65的表达水平显著增高,此外,NF-κB在HOXA11-AS siRNA组细胞核中明显表达。结论 lncRNA HOXA11-AS可以抑制骨关节炎大鼠软骨细胞的凋亡以及基质降解,并阻止NF-κB信号通路的激活。     

核转录因子-κB组成性激活对胃癌细胞增殖的影响及其机制

目的 探讨胃癌细胞株是否存在核转录因子(NF)-κB组成性激活及其对胃癌细胞增殖的影响机制。方法 采用蛋白免疫印迹法(Western blot法)检测4株不同分化程度的胃癌细胞株NF-κB蛋白表达,比较4株胃癌细胞株中NF-κB蛋白质表达水平的差异。通过Trans AM~(TM)NFκBp65试剂盒来比较不同胃癌细胞株中p65亚基的蛋白活性差异。选取活性较高细胞株,观察吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)对NF-κB活性的影响;利用噻唑蓝(MTT)法,分别观察24、48、72h,PDTC对细胞增殖的影响。并采用流式细胞分析技术(FCM)检测细胞的凋亡情况。结果 4株胃癌细胞株胞核中均存在NF-κB蛋白的表达,即存在NF-κB的组成性激活,且存在表达差异。活化的p50亚基在AGS细胞株中表达较低,在MKN28、MKN45、SGC-7901细胞株中表达较高;活化的p65亚基在MKN28、MKN45细胞株中表达较低,在AGS、SGC-7901细胞株中表达较高。经PDTC处理的实验组胃癌细胞,NF-κB的活性均被抑制(P<0.01);同时细胞表现为不同程度的增长抑制(P<0.01),FCM结果显示PDTC可诱导细胞的凋亡。结论 胃癌细胞株中存在NF-κB的组成性激活,并在不同的细胞株中存在表达差异。抑制NF-κB的活性可明显抑制胃癌细胞的增殖,其机制与PDTC所诱导的细胞凋亡有关。     

1-磷酸鞘氨醇受体在不同退变程度髓核组织中的表达变化

目的 :比较不同退变程度人椎间盘髓核组织中3种1-磷酸鞘氨醇受体(S1PR1/2/3)表达水平的差异,探讨椎间盘中S1PR表达水平与椎间盘退变的关系。方法:收集腰椎间盘退行性病变患者手术切除的椎间盘组织,其中轻度退变(Pfirrmann分级Ⅳ级)22例,严重退变(Pfirrmann分级Ⅴ级)14例;同时取6例无椎间盘退变患者(单纯腰椎椎体骨折,Pfirrmann分级Ⅱ级)手术切除的椎间盘组织作为对照组;通过HE染色以及Saf-O染色观察不同退变程度椎间盘的组织学变化,免疫组化检测不同退变程度组织中的S1PR表达水平;Ⅱ型胶原酶消化分离提取原代髓核细胞,通过Real-time PCR、Western-bolt检测不同退变程度椎间盘髓核细胞中S1PR的表达水平,并通过细胞免疫化学方法对S1PR进行定位。结果:HE染色及Saf-O染色结果显示退变椎间盘的纤维环出现破损,髓核细胞形成明显的集落,细胞外基质减少。免疫组化结果显示正常和轻度退变的髓核组织中3种受体(S1PR1/2/3)都有表达,严重退变的组织中表达极弱;Real-time PCR结果显示对照组髓核细胞中S1PR1/2/3的m RNA表达水平分别是严重退变组的5.34±0.52倍、7.25±0.04倍、1.92±0.06倍,轻度退变组S1PR1/2/3的m RNA表达水平分别是严重退变组的4.35±2.45倍、4.96±3.44倍、2.19±0.82倍;Western-blot发现对照组和轻度退变组髓核细胞中S1PR1/2/3均有表达,严重退变组表达水平较低;免疫细胞化学显示S1PR主要集中在髓核细胞的细胞质和细胞膜上。结论:髓核组织中主要表达S1PR1/2/3,在严重退变的髓核组织和细胞中其表达水平明显下降,S1P及其受体可能参与椎间盘髓核组织的退变过程。