PCR及GMS染色法对肺孢子虫肺炎的临床诊断价值

目的评价PCR及六胺银(GMS)染色法对肺孢子虫肺炎(PCP)的临床诊断价值。方法用PCR及GMS染色法检测临床拟诊PCP患者及非PCP患者的痰液标本,比较两种方法的敏感性和特异性。结果在40例临床拟诊PCP患者的痰标本中,用PCR方法检测肺孢子虫DNA,结果均为阳性,其中有12例患者用SMZ治疗后复检,PCR全部转阴;而用GMS染色镜检,阳性率仅为35.0%(14/40)。20例非PCP呼吸道感染者的痰液PCR和GMS染色镜检结果均为阴性。结论用GMS染色法诊断PCP,特异性高但敏感性差;PCR的敏感性高于GMS染色法,适于临床筛查和疗效考核。     

PCR及GMS染色法对肺孢子虫肺炎的临床诊断价值

目的 评价PCR及六胺银（GMS）染色法对肺孢子虫肺炎（PCP）的临床诊断价值。方法用PCR及GMS染色法检测临床拟诊PCP患者及非PCP患者的痰液标本，比较两种方法的敏感性和特异性。结果在40例临床拟诊PCP患者的痰标本中，用PCR方法检测肺孢子虫DNA，结果均为阳性，其中有12例患者用SMZ治疗后复检，PCR全部转阴；而用GMS染色镜检，阳性率仅为35．0％（14／40）。20例非PCP呼吸道感染者的痰液PCR和GMS染色镜检结果均为阴性。结论用GMS染色法诊断PCP，特异性高但敏感性差；PCR的敏感性高于GMS染色法，适于临床筛查和疗效考核。     

肺孢子虫感染大鼠模型的建立及ITS巢式PCR检测敏感性研究

目的 建立肺孢子虫感染大鼠模型并探讨ITS1-5.8S rDNA-ITS2巢式PCR检测卡氏肺孢子虫DNA的敏感性. 方法 大鼠分为实验组和对照组,实验组从第1周开始用每周2次每次每只皮下注射地塞米松1 mg的方法诱导,共8周,并分别在首次注射后第2、4、6、8周解剖大鼠制作肺印片、肺组织匀浆液及支气管肺泡灌洗液(BAL)涂片,并进行六亚甲基四胺银(Gomori's methenamine silver,GMS)染色镜检;对照组不作激素注射,并分别在0周和第10周剖杀染色检查.同时分别提取大鼠BAL和肺组织的肺孢子虫DNA进行巢式PCR扩增,比较GMS法和ITS巢式PCR检测的敏感性. 结果 实验组从第6周开始染色镜检,可见少量肺孢子虫包囊,第8周肺印片、肺组织匀浆液均检测到包囊,检出率为100%(10/10),BAL的检出率为80%(8/10),对照组则均未检出.用ITS1-5.8S rDNA-ITS2巢式PCR法均能检测出实验组第8周大鼠BAL和肺组织卡氏肺孢子虫DNA,阳性率为100%(10/10),对照组均为阴性.比较BAL标本、肺印片和肺组织匀浆液GMS染色法的检出率,BAL最低,肺组织匀浆液最高.其中20%(2/10)大鼠的BAL标本用GMS染色法未能检出,但用巢式PCR方法均能成功扩增.结论成功用地塞米松诱导法建立了肺孢子虫大鼠感染模型;ITS1-5.8S rDNA-ITS2巢式PCR检测卡氏肺孢子虫敏感性高、特异性强,可推广应用于临床诊断肺孢子虫肺炎.     

聚合酶链反应方法检测诱导排痰标本对卡氏肺孢子虫肺炎的诊断价值

目的 评价聚合酶链反应方法检测诱导排痰标本中卡氏肺孢子虫DNA对卡氏肺孢子虫肺炎（PCP）的诊断意义。方法 分别用姬姆萨和六胺银（GMS）两种染色方法和mt-rRNA-PCR方法检测痰液中的卡氏肺孢子虫。结果 化学染色法检测16例临床拟诊PCP的患者痰标本。结果 8例阳性,20例非PCP患者痰标本均为阴性,化学染色方法的敏感性和特异性分别为50％和100％。PCR方法检测16例临床拟诊PCP患者痰液中卡氏肺孢子虫,14例阳性,20例非PCP患者痰标本均为阴性,mt-rRNA-PCR方法的敏感性和特异性分别为88％和100％。结论 姬姆萨和GMS两种细胞化学染色方法联合检测痰标本卡氏肺孢子虫,特异性高,但敏感性偏低。mt-rRNA-PCR检测痰标本中卡氏肺孢子虫DNA方法敏感性高于化学染色法且特异性高,更适于临床应用。     

PCR-ELISA检测大鼠卡氏肺孢子虫DNA的研究

目的　建立卡氏肺孢子虫 (P.c )DNA的聚合酶链反应-酶联免疫吸附测定(PCR-ELISA)方法 ,并探讨其应用价值。　方法　实验组患卡氏肺孢子虫肺炎的SD大鼠和Wistar大鼠各 2 8只 ,采用PCR法扩增大鼠肺组织DNA和支气管肺泡灌洗液 (BALF)DNA ,用PCR ELISA检测其扩增产物。 2 8只患病大鼠分别制作肺组织印片及BALF涂片 ,姬姆萨 (Giemsa)染色镜检 10 0个视野中有无P .c包囊 (或滋养体 ) ,与PCR ELISA检测扩增产物结果比较。　结果　两种方法检测大鼠肺组织DNA阳性率及BALFDNA阳性率 ,结果相同 ,均分别为 96.4% (27/28)和100% (28/28)。Giemsa染色镜检P.c包囊 (或滋养体 ) ,结果为阳性的大鼠 ,PCR ELISA检测扩增产物结果也均为阳性。阴性对照组 ,两种大鼠的肺组织和BALF各10份标本 ,均有1只大鼠阳性。　结论　PCR ELISA检测大鼠卡氏肺孢子虫DNA ,敏感性较高 ,特异性较好 ,操作简便 ,具有实用价值。     

PCR检测大鼠卡氏肺孢子虫的研究

目的探讨PCR技术检测大鼠卡氏肺孢子虫的应用价值。方法SD大鼠和Wistar大鼠均随机分成实验组和对照组,实验组每周两次皮下注射醋酸可的松,诱导产生卡氏肺孢子虫;8week后,收集肺组织和支气管肺泡灌洗液(BALF),用PCR技术检测卡氏肺孢子虫DNA,并与Giemsa染色法比较。结果实验组两种大鼠肺组织卡氏肺孢子虫DNA阳性率分别为9643%和100%,BALF阳性率亦分别为9643%和100%,它们之间均无显著性差异(P>005);BALF的PCR阳性检出率显著高于Giemsa病原染色法,肺组织的两种方法检出率无显著性差异。结论PCR是一种检出率较高的方法,可作为早期诊断PCP的常规方法,特别适用于BALF检测卡氏肺孢子虫DNA。     

用半巢式PCR检测无创性标本诊断卡氏肺孢子虫肺炎的实验研究

目的无创性诊断卡氏肺施子虫肺炎。方法采用一对半引物进行半巢式DHFR－PCR检测实验大鼠无创性标本——支气管液、血清及活检标本——肺及肝脏组织中的卡氏肺孢子虫DNA。结果从59只经病理学检查证实的卡氏肺孢子虫肺炎大鼠中采集到的上述4种标本，卡氏肺孢子虫DNA的半巢式DHFR－PCR检出率分别为72.7％（32／44），37.3％（22／59），94．9％（56／59）和36．4％（8／22），而DHFR－PCR的检出率则仅为25％，13．6％，71．2％和9．1％。12只轻度感染的PCP大鼠的无创性标本中卡氏肺孢子虫DNA的检出率由刚提高至41．7％。正常鼠标本及各种病原体对照的半巢式DHFR－PCR均为阴性。结论用半巢式DHFR－PCR无创性地诊断大鼠卡氏肺孢子虫肺炎具有敏感、特异、省时、省力等优点；本文在血和肝中检出卡氏肺孢子虫DNA，提示在卡氏肺孢子虫肺炎大鼠模型中存在虫血症和肺外卡氏肺孢子虫感染。     

卡氏肺孢子虫肺炎大鼠模型的比较研究

目的　比较用SpragueDawley(SD)大鼠和Wistar大鼠建立卡氏肺孢子虫肺炎 (PCP)模型的差异。 方法　选用SD大鼠和Wistar大鼠 ,随机分为实验组和对照组 ,免疫抑制诱导建立动物模型 ;收集肺组织和支气管肺泡灌洗液 (BALF) ,分别制成肺印片和BALF涂片 ,作Giemsa染色 ,镜检卡氏肺孢子虫滋养体和包囊。结果　共收集实验组SD大鼠和Wistar大鼠的肺组织及BALF标本各 2 8份 ,经Giemsa染色后 ,在肺印片中查见Pneumocystiscarinii(Pc)虫体的阳性率分别为 89.2 9%和10 0 % ,两者之间无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;BALF阳性率分别为 6 0 .71%和 78.5 7% ,两者之间亦无显著性差异 (P >0 .0 5 )。而同种大鼠的肺印片与BALF涂片 ,其阳性率之间有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ,且肺印片的检出率均显著高于BALF涂片。同种大鼠不同肺叶的肺印片 ,其阳性率之间无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论　SD大鼠与Wistar大鼠作为PCP模型动物无明显差别     

1341例疑似肺孢子菌肺炎非HIV阳性患者病原学诊断分析

目的探讨六亚甲基四胺银(gomori’s methenamine silver,GMS)染色镜检法和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法检测肺孢子菌肺炎(pneumocystis pneumonia,PCP)患者标本的阳性率,为临床提供更有利的实验室支持依据。方法采集1341例疑似PCP患者的深部诱导痰或支气管肺泡灌洗液(broncho-alveolar lavage fluid,BALF)标本,GMS镜检法和PCR法相结合检测肺孢子菌,任何一种方法检测阳性,即判断为PCP。结果共285例诊断为PCP,其中114例为GMS染色镜检法阳性,282例为PCR法检测阳性,111例为2种检测方法双阳性,3例为GMS染色镜检法单独阳性(均为肾移植术后BALF样品),171例为PCR方法单独阳性。深部诱导痰标本中,GMS染色镜检法和PCR法阳性检出率分别为5.1%和16.2%(P<0.05);而BALF标本二者的阳性检出率分别为23.3%和42.2%(P<0.05)。未知原因发热合并肺炎患者和器官移植后接受免疫抑制剂治疗者有更高的阳性检出率。结论 PCR法检测PCP阳性率高于GMS染色镜检法,PCR法检测与GMS染色镜检法结合诊断PCP对临床具有较高指导价值。     

大蒜素治疗大鼠肺孢子虫肺炎的实验研究

目的观察大蒜素对大鼠肺孢子虫肺炎(PCP)的治疗效果。方法采用皮下注射醋酸泼泥松龙的方法建立PCP大鼠模型。将受试大鼠随机分为正常对照组(A)、未治疗对照组(B)、TMP-SMZ治疗对照组(C)、大蒜素治疗组(D)和青蒿素治疗组(E)。各组从第7周开始灌服相应药物5d,停药后观察1周,用肺重/体重比和肺虫荷量考核疗效。结果PCP大鼠6周内的病死率为16.7%,满6周时抽样进行病原、病理检查,证实均已成功诱导PCP。5组受试大鼠的平均肺重/体重比分别为0.75±0.090、1.05±0.174、0.77±0.091、0.79±0.114和0.85±0.188。B~E组受试大鼠肺虫荷量分别为1490、74、296和219个包囊/mg肺。统计学分析显示,经大蒜素治疗的大鼠平均肺重/体重比、肺虫荷量均显著低于未治疗对照组(P<0.05),与TMP-SMZ治疗对照组和青蒿素治疗组比较差异无显著性(P>0.05)。结论大蒜素对大鼠PCP有显著疗效,效果与TMP-SMZ和青蒿素接近。     

用PCR扩增及Southern印迹杂交对新疆克拉玛依地区皮肤利什曼病病原体kDNA同源性研究

本研究自新疆克拉玛依地区皮肤利什曼病（ＣＬ）患者的皮肤病变组织内抽取微量的利什曼原虫ｋＤＮＡ，采用引物１３Ａ、１３Ｂ进行ＰＣＲ扩增，获１２０ｈＰ扩增产物（ＣＬ－ＰＣＲ－ＡＰ），并转移到尼龙膜上，分别与地高辛（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－１１－ｄＵＴＰ）标记的Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ、Ｌ．ｇｅｒｂｉｌｌｉ、Ｌ．ｍａｊｏｒｋＤＮＡ探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，结果可见病变组织内ｋＤＮＡＰＣＲ－ＡＰ仅与Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａｋＤＮＡ探针有明显的杂交信号带，提示该地区皮肤利什曼病病原体ｋＤＮＡ与Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ有较强的同源性。为进一步分析该病原体与Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ和Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ新疆各分离株的同源关系，我们采用杜氏利什曼原虫（Ｌ．ｄ）种特异引物Ⅰ和Ⅱ对患者病变组织进行ＰＣＲ扩增，未见扩增产物。用地高辛标记的ＣＬ－ＰＣＲ－ＡＰ探针对Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ新疆各分离株进行打点杂交，结果显示该地区ＣＬ病原体与Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ新疆分离株以及其它利什曼原虫呈阴性反应。以上结果证实Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａｋＤＮＡ与克拉玛依地区ＣＬ患者的ＣＬ－ＰＣＲ－ＡＰ之间的同源关系。     

四种蝇的随机序列扩增多态性分析

ＲＡＰＤ技术是在１９９０年后发展起来的一项分子生物学手段，它被越来越广泛地应用在昆虫分类方面。它有许多优越性，如简便、快捷、灵敏度强、经济、对材料要求不高等。更重要的是，它可以从分子的角度出发揭示ＤＮＡ的多态性，从而把物种区分开来。本文以家蝇，丝光绿蝇，尾黑麻绳和夏厕蝇为对象，用３４种１０ｈｐ引物对上述四种蝇的ＤＮＡ进行了地毯式的扩增，以筛选能够用于种类区别的引物。我们的结果显示，引物ＯＰＨ－８可以作为科间的鉴别依据，另有１４种引物可用于蝇科内各属间或种间的分类依据。     

三种疟原虫检测方法的比较研究

应用聚合酶链反应（PCR）及微滴度板杂交试验（MPH）对来自高疟疾流行区、收集于滤纸片的112例干血滴样品进行检测，并对同一人群作镜检进行比较。结果表明显微镜检查恶性疟原虫检出率27.69%（31／112），而CR及MPH方法检出率分别为37.5%（42／112）、50％（56／112）。实验结果提示镜检虽然简便、易行、成本低，但由于一般观察极限的限制，影响了检出率。PCR方法敏感、特异，疟原虫检出率较高，但有假阳性及假阴性，且无法作种属鉴定。三种方法中MPH方法恶性疟原虫检出率最高，不仅可进行种属鉴定，也可进行混合感染的检测。此法疟原虫检出率71.43%（80／112），其中混合感染者为39.29%（44／112）。但该法的结果难以被其它方法证实。表明该法特异性尚待证实，加上MPH成本高，这也限制了该法在临床实践及大范围普查的应用。     

微小隐孢子虫的基因检测实验研究

目的　探讨聚合酶链反应 (PCR)检测微小隐孢子虫 (Cryptosporidium parvum)感染的特异性和敏感性。　方法用 Sheather's蔗糖梯度离心法从微小隐孢子虫感染者粪便标本中分离纯化卵囊。用酚 -氯仿法抽提卵囊总 DNA。针对本虫 18S r RNA基因片段设计 1对引物 ,对模板 DNA进行 PCR扩增 ,同时以蓝氏贾第鞭毛虫 (Giardia lamblia)、溶组织内阿米巴 (Entamoeba histolytica)、阴道毛滴虫 (Trichomonas vaginalis)、刚地弓形虫 (Toxoplasma gondii)、日本血吸虫(Schistosoma japonicum)和旋毛虫 (Trichinella spiralis) ,以及人体血细胞等 DNA样本为对照。用琼脂糖电泳和溴乙腚染色对 PCR产物进行检测。　结果　仅微小隐孢子虫 DNA被扩增出一 5 0 0 bp的 DNA片段。其它对照 DNA样本均未出现扩增反应。　结论　PCR对隐孢子虫检测的特异性可高达 10 0 % ,敏感性也很强 ,可检测到 2 0 pg微小隐孢子虫卵囊的DNA。表明本实验建立的检测微小隐孢子虫的 PCR方法有效     

应用CSP基因型简捷PCR鉴定法对间日疟原虫分型的初步评价

目的初步评价CSP基因型简捷PCR鉴定法在对间日疟原虫进行分型时的实用性.方法利用套式等位特异PCR,检测间日疟原虫环子孢子蛋白(CSP)基因结构多态,以产生的多样性DNA片段作为对间日疟原虫分型的依据.结果经检测42份被镜检确诊为间日疟滤纸血样,被分型33份,分型率为78.57%,温带型占30.30%(10/33),热带型占69.70%(23/33),未检到PV-Ⅱ型间日疟原虫.当第二次对33份血样检测时93.94%(31/33)被分型,其分型符合率为77.42%(24/31).结论该方法简便、快速,且分型不受采血时机限制,但作为云南间日疟的分型方法时,其稳定性仍需提高.     

聚合酶链反应快速诊断流行性脑脊髓膜炎

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增脑膜炎奈瑟氏菌（Ｎｍ）ＩＳ１１０６插入序列的方法诊断流行性脑脊髓膜炎（流脑）。所试２１株Ｎｍ均扩增产生预期长度５９６ｂｐ的特异性片段，１４株非Ｎｍ菌株未见此片段。扩增灵敏度为１２ｆｇ。Ｎｍ菌ＩＳ１１０６重复序列扩增产物构成特征性ＰＣＲ指纹图，Ａ群菌株图谱一致；Ｂ群菌株呈明显多态性变化。临床标本的ＰＣＲ检测结果为：２１份流脑患者脑脊液中２０份为阳性（９５．２％）；１４份流脑患者急性期血清中１２份阳性（８５．７％）；在所检标本中Ｎｍ培养阳性的８份脑脊液和４份急性期血清ＰＣＲ检查也同样阳性。作为对照的１２份恢复期血清、３份密切接触者血清和２０份正常人血清均为阴性。作者认为，ＩＳ１１０６－ＰＣＲ是诊断流脑的一种简便快速、灵敏特异的方法。     

类鼻疽伯克霍氏德氏菌UDPE检测方法的建立和应用

目的：建立防止产物污染的UDPE（UDG－Duplex PCR－EIA）技术，用于检测类鼻疽伯克霍尔德氏菌。方法：选择类鼻疽伯克霍尔德氏菌FUR（Ferric Uptake Reg ulator）基因为靶序列，设计两对引物进行PCR扩增，用UDG（尿嘧啶糖基化酶）防止PCR产物污染，并用微孔板杂交－酶联显色检测扩增的PCR产物片段；用不同的模板考察方法的特异性和灵敏度。结果：该检测系统可以特异性地检测类鼻疽伯克霍尔德氏菌；对于纯DNA模板，检测灵敏度可以达到10fg/μl；对于系列稀释菌液提取的模板，灵敏度可达0.1个菌／μl；对于模拟污水标本、模拟组织标本和模拟土壤标本的检测灵敏度分别为10个菌／μl，100个菌／μl和100个菌／μl；检测系统可以防止10^9个PCR产物分子的污染；检测系统可以在37℃下稳定保存7d。结论：本研究建立了稳定的，防止产物污染，灵敏度特异性均较理想的类鼻疽伯克霍尔德氏菌UDPE检测系统。     

1998～2003年海南省不同疟区居民疟疾血清学纵向调查

目的　调查海南省不同疟区疟疾流行情况 ,了解其流行趋势 ,为制定防治措施提供依据。方法　应用间接荧光抗体试验 (IFAT)对南桥、毛阳高低疟区进行纵向调查 ,并与镜检法及 PCR技术进行比较研究。结果　南桥、毛阳居民 IFAT抗体阳性率分别为 2 8.85 % (2 96 / 10 2 6 )和 6 .4 7% (6 4 /989) ,低年龄组阳性率为 9.92 % (39/ 393)和 3.98% (14 / 35 2 ) ;原虫阳性率依次为 6 .6 2 % (6 8/ 10 2 6 )和 1.4 2 % (14 / 989) ,PCR与镜检比较 ,阳性符合率为 86 .90 %。结论　南桥居民抗体阳性率和原虫阳性率均明显高于毛阳 ,显示疟疾传播仍较严重 ,毛阳疟疾虽有效控制 ,但仍有低年龄组阳性 ,说明疟疾传播尚未阻断。 PCR可用作流行病学调查和监测。     

日本血吸虫(中国大陆株)表达基因的分离和EST序列测定

目的 运用表达标签技术（ＥＳＴ方法）,从ＳｊｃＤＮＡ文库中分离、鉴定血吸虫表达基因序列。方法 应用ＥＳＴ方法,人ＳｊｃＤＮＡ文库中随机挑出单个重组克陲 ＰＣＲ直接序列分析,通过互联网将获得的ＥＳＴ序列送入ＮＣＢＩＧｅｎＢａｎｋ进行同源性检素,并将发现的未知基因ＥＳＴ序列送入ＮＣＢＩｄｂＥＳＴ以获得ＧｅｎＢａｎｋ进入号。结果 分离了１００个ＳｊＧｅｎＢａｎｋ中已知的血吸虫基因序列,１９个为未知基因序