生长期兔髁突纤维软骨细胞和骨骺透明软骨细胞生物学特性的比较研究

目的 建立软骨细胞体外培养模型,研究纤维软骨和透明软骨的生物学差异。 方法 分离4周龄雌性兔双侧髁突软骨和膝关节骨骺软骨,采用胰酶和胶原酶联合消化的方法收集软骨细胞,分别进行体外培养并连续传代至P10。使用倒置显微镜观察细胞形态;采用阿利新蓝和Ⅱ型胶原免疫组化染色的方法分别对髁突纤维软骨细胞和骨骺透明软骨细胞进行鉴定;用细胞计数的方法绘制生长曲线;运用荧光定量PCR和Western印迹技术对软骨特异性指标Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、SOX9和Aggrecan进行检测,并使用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析。 结果 倒置显微镜观察示,髁突纤维软骨细胞和骨骺透明软骨细胞形态均会随细胞传代而发生改变,且P2代以后改变明显;基因和蛋白水平的检测均证实P2代后软骨细胞去分化明显。阿利新蓝和Ⅱ型胶原免疫组化染色鉴定结果均为阳性,对照组为阴性。实时定量荧光PCR和Western印迹结果证明：在纤维软骨中,Ⅰ型胶原的表达量高于透明软骨;而Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、SOX9和Aggrecan的表达量却明显低于透明软骨。 结论 使用本方法培养软骨细胞简单有效;髁突纤维软骨细胞和骨骺透明软骨细胞体外培养均存在去分化现象,且两者Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、SOX9和Aggrecan的表达存在显著差异,生物学特性并不相同。     

下颌骨髁突软骨细胞传代过程中生物学特性变化

目的:观察体外培养及传代对人髁突软骨细胞生物学特性的影响。方法:采用体外细胞培养、免疫生化及分子生物学方法观察传代过程中人髁突软骨细胞形态、型胶原及蛋白多糖合成及、、型前胶原的mRNA水平变化。结果:传代过程中人髁突软骨细胞型胶原合成及其mRNA水平逐渐降低,至第7代已基本丧失。而、型胶原的mRNA水平随传代逐渐升高,同时伴有细胞蛋白多糖合成的减少,细胞壁形态由圆形或多角形转变为长梭形占优势。结论:体外培养及反复传代可影响软骨细胞的表型特征。髁突软骨细胞的反分化标准应从胶原、蛋白多糖合成及细胞形态等方面综合评价     

静压力下兔髁突软骨细胞COL2A1、SOX9、COL1A1和ALP的表达变化

目的 研究兔髁突软骨细胞对静压力的分子生物学响应。方法：体外分离培养4周龄健康雌性新西兰大白兔髁突软骨细胞,使用形态学观察,COL2A1和SOX9免疫细胞化学染色方法对P2代髁突软骨细胞进行鉴定;100kPa静压力条件下,分别对P2代髁突软骨细胞进行0、1、2、3和4 h的加压处理;采用CCK-8检测压力加载后各组细胞活性的变化;通过Western免疫印迹分析髁突软骨细胞COL2A1、SOX9、COL1A1和ALP的表达变化。采用SPSS19.0软件包对数据进行统计学分析。结果：兔髁突软骨细胞呈多角形,“铺路石”样排列,细胞爬片COL2A1和SOX9免疫细胞化学染色鉴定结果为阳性。100kPa静压力加载1 h时,细胞活性显著降低（P=0.04）,但在2~4 h后,细胞活性恢复并与对照组无显著差异。Western印迹结果显示,压力加载3 h和4 h时,COL2A1、SOX9、COL1A1和ALP的表达显著升高。其中,在压力加载4 h组ALP的表达量比3 h组低。结论：兔髁突软骨细胞对压力微环境的改变具有一定的适应能力,100kPa静压力加载4 h不会对髁突软骨细胞活性产生不可逆损伤。适宜的压力加载对髁突软骨细胞的成软骨和成骨能力有促进作用。髁突软骨细胞压力微环境的改变,可能影响颞下颌关节适应性改建和颞下颌关节紊乱病的病理过程。     

颞下颌关节髁突软骨细胞体外培养中去分化现象研究

目的　研究去分化髁状突软骨细胞的细胞生物学特性。方法　连续在体外贴壁条件下培养传代正常乳兔髁突软骨细胞至第 2 0代 ,观察培养细胞的形态变化 ,免疫组化法和RT -PCR法对传代过程中的数代细胞对II型胶原与蛋白多糖聚糖体的表达情况进行连续检测 ,观察细胞软骨基质蛋白表达分泌的变化以及发生明显去分化软骨细胞的超微结构特点。结果　在贴壁培养条件下 ,髁状突软骨细胞去分化现象于细胞传代第 3代后逐渐显著 ,第 6代后培养的软骨细胞几乎完全去分化。去分化细胞胞体拉长 ,呈“成纤维细胞”样外观。去分化过程中 ,细胞对软骨基质蛋白的表达水平逐渐降低 ,细胞增殖速度增强。透射电镜观察显示 ,去分化软骨细胞细胞核明显呈分叶状 ,表现出异型核。结论　髁突软骨细胞在体外贴壁培养传代过程中会发生去分化现象 ,丧失软骨细胞特征性细胞表型。     

细胞冻存对髁突软骨细胞去分化特性的影响研究

目的 研究细胞冻存处理对髁突软骨细胞去分化特性的影响。方法 分离并体外培养2周龄新西兰大白兔双侧髁突软骨细胞, 将P1代冻存处理15 d后传代培养。采用倒置相差显微镜观察比较正常传代培养的P2代髁突软骨细胞（对照组）和经冻存处理后传代的P2代髁突软骨细胞（实验组）间的细胞形态;通过荧光定量PCR和Western免疫印迹技术检测和分析两组间软骨细胞标志物COL2、COL10、Sox9和Aggrecan基因和蛋白水平的表达差异,并使用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。 结果 倒置相差显微镜观察发现实验组P2代髁突软骨细胞会出现一定程度的形态学改变;但是并未发现实验组和对照组之间COL2、COL10、Sox9和Aggrecan的表达有统计学意义的差异;实验组和对照组软骨标志基因的表达均会较P1代出现降低。 结论 体外培养髁突软骨细胞存在去分化现象,但细胞冻存处理并不会加速其去分化进程,所以体外培养的髁突软骨细胞可以通过冻存技术来实现髁突软骨细胞的暂存。     

人胚髁状突软骨细胞的分离、培养和生物学性状

目的:研究体外培养的正常人胚髁状突软骨细胞的生物学特性.方法:体外培养人胚髁状突软骨细胞,观察其从原代至第6代的形态变化;测定细胞数量的变化及其生长曲线;测定冷冻复苏后的细胞存活;观察细胞的超微结构.结果:从原代至第3代,髁状突软骨细胞为圆形、多角形,从第4代开始逐渐转变为梭形的成纤维细胞.体外培养至第6天髁状突软骨细胞的数量是接种时的3倍.冷冻复苏后经苔盼蓝拒染试验检查,发现细胞存活率为92%.体外培养髁状突软骨细胞的超微结构正常.结论:单层培养髁状突软骨细胞的表型至少能够保持3代稳定,且形态结构正常,具有正常的生长增殖能力,并可经深低温冷冻长期保存.     

肝细胞生长因子基因转染兔髁状突软骨细胞及对其生物学特性的影响

目的观察携带有绿色荧光蛋白(gree fluorescent protein,GFP)标记的肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)cDNA转染兔髁状突软骨细胞后的主要生物学特性。方法取兔髁状突软骨细胞体外培养至第2代,HGFcDNA转染软骨细胞,空白质粒组为对照组;噻唑蓝(MTT)检测软骨细胞的增殖能力,SABC免疫组化及原位杂交法测其Ⅱ型胶原在转染前后的变化与mRNA的表达。结果髁状突软骨细胞在转染后可较长时间的保持其软骨细胞的生物学特性,并可促进软骨细胞的增殖,SABC免疫组化测第Ⅵ代软骨细胞的Ⅱ型胶原表达仍呈强阳性,而对照组软骨细胞则明显减弱,说明HGF基因转染软骨细胞后可表达其生物学功能。基因瞬间转染率大约为31.23%。结论GFP标记的HGF基因以脂质体为载体转染兔髁状突软骨细胞后可发挥其生物学功能,加速细胞的生长,在荧光显微镜下可直观地计算软骨细胞的瞬间转染率。     

具有软骨细胞表型特征的永生化兔髁突软骨细胞系的建立

目的：建立具有稳定软骨细胞表型特征的永生化兔髁突细胞系。方法：采用逆转录病毒载体介导的方法将SV40大T抗原基因导入原代培养的兔髁突软骨细胞，利用G418筛选阳性克隆并对其进行扩大培养，通过RNA点杂交检测转基因细胞I、Ⅱ型胶原基因的转录。结果：有一株克隆在体外1年半稳定传代100次以上，命名为永生化髁突软骨细胞系（immortalized mandibular condylar chondrocyte,IMCC)，点杂交显示IMCC有I、Ⅱ型前胶原基因的转录。结论：获得具有稳定软骨细胞表型特征的永生化兔髁突细胞系。     

人胚髁状突软骨细胞的分离,培养和生物学性态

目的：研究体外培养的正常人胚髁状突软骨细胞的生物学特性。方法：体外培养人胚髁状突软骨细胞，观察其从原代至第６代的形态变化；测定细胞数量的变化及其生长曲线；测定冷冻复苏后的细胞存活；观察细胞的超微结构。结果：从原代至第３代，髁状突软骨细胞为圆形、多角形，从第４代开始逐渐转变梭形的成纤维细胞。体外培养至第６天髁状突软骨细胞的数量是接种时的３倍。冷冻复苏后经苔盼蓝拒染试验检查，发现细胞存活率为９２％。体     

大鼠髁突软骨细胞冻存复苏后的生物学特性观察

目的观察低温冻存1月后,不同年龄大鼠髁突软骨细胞的生物学特性。方法体外培养出生后1天、7天、14天、28天共4组SD大鼠髁突软骨细胞。对冻存复苏后的细胞进行形态学观察;甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色检测其对糖胺聚糖(GAG)、Ⅱ型胶原的合成能力;台盼蓝拒染试验测定细胞成活率;MTT法观察细胞增殖能力;实时定量-聚合酶链式反应(real time-PCR)检测冻存后细胞增殖核抗原(PCNA)基因表达情况。结果低温冻存后,各年龄组大鼠髁突软骨细胞仍能保持软骨细胞特有的形态及特性;细胞成活率均大于90%;生长曲线近似"S"型;冻存后各年龄组细胞pcna基因表达较冻存前无显著统计学差异(P>0.05)。结论低温冻存1月后的大鼠髁突软骨细胞成活率高,并保持了其生物学特性及增殖活性。     

Involvement of PI3K/Akt pathway in rat condylar chondrocytes regulated by PTHrP treatment

Objective

The aim of this study was to explore the mutual communication of the parathyroid hormone-related peptide (PTHrP) and phosphatidylinositol 3-kinase/threonine protein kinase (PI3K/Akt) pathway on the proliferation and differentiation of condylar chondrocytes from Sprague-Dawley (SD) rats.

Methods

Condylar chondrocytes from the condylar cartilage were cultured and an organ culture system of mandibular condyles was employed. The distribution of PI3K, phospho-Akt (p-Akt), and PTHrP in condylar cartilage was detected by either immunohistochemistry or immunofluorescence. The second passage chondrocytes and condyle specimens in the organ culture system were treated with PTHrP, LY294002, PTHrP and LY294002 in combination, or dimethyl sulfoxide (DMSO), separately. The mRNA and protein levels of type II (Col II) and type X collagen (Col X) were investigated by real-time polymerase chain reaction (PCR) and Western blot analysis. The condyle growth in organ culture system was analysed by haematoxylin–eosin staining.

Results

PTHrP, PI3K, and p-Akt were mainly located in the proliferative and hypertrophic zones. PTHrP promoted the proliferation of condylar chondrocytes, while LY294002 limited this effect. The mRNA and protein levels of Col II and Col X in these cells were reduced by PTHrP and enhanced by LY294002. Organ culture showed a significant enhancement of condyle elongation with PTHrP treatment or a combination of PTHrP and LY294002 treatment. After treatment with LY294002, the length of condyles was reduced compared with the samples treated with DMSO.

Conclusions

We conclude that the PI3K/Akt pathway plays an essential role in the proliferation and differentiation of condylar chondrocytes and is a potential target for PTHrP in regulating chondrocyte differentiation at condylar cartilage.     

体外培养髁突软骨细胞表型特征的研究

目的：研究体外培养的髁突软骨细胞（mandibular condylar chondrocyte,MCC)表型变化的特征。方法：消化法培养2周新西兰白兔的MCC，采用相差显微镜观察、图象分析、MTT、免疫组化等方法对不同代数的MCC进行细胞形态和大小、生长曲线以及Ⅰ、Ⅱ型胶原的表达等方面的比较。结果：培养早期（1－3代）MCC以多角形为主，5－6代后梭形细胞增多；培养早期MCC的面积较小，大小较为均一；细胞的增殖速度随着传代次数的增加而逐渐减慢；1－3代Ⅱ型胶原的表达率较高，第7代后Ⅰ型胶原的表达率增加。结论：MCC在体外培养时的细胞形态大小的变化、Ⅰ、Ⅱ型胶原表达的更迭等特征与体内MCC从增殖层向钙化软骨层的变化特征近似。MCC在体外培养末期可发生分化。     

Ihh-PTHrP信号轴介导髁突软骨细胞对压力微环境改变的调控研究

目的 探究Ihh-PTHrP负反馈信号通路与静压力下髁突软骨细胞生物学响应的关系。方法 体外分离培养4周龄健康雌性新西兰大白兔髁突软骨细胞,100 kPa静压力条件下,分别对P2代髁突软骨细胞进行0、1、2、3、4 h的加压处理;采用Western印迹的方法比较分析髁突软骨细胞COL2A1、Ihh和PTHrP的蛋白表达变化;通过RT-qPCR检测分析静压力对Ihh和PTHrP基因水平表达的影响;选取0 h和3 h组,使用扫描电子显微镜扫描分析静压力对髁突软骨细胞形态的影响;采用SPSS 19.0软件包对数据进行统计学分析。结果 Western印迹实验发现：压力加载3 h后,COL2A1出现明显高表达;Ihh蛋白表达在0～2 h内逐渐升高,在2～4 h内却逐渐降低;PTHrP在0～2 h内蛋白表达逐渐升高,并在2～4 h内维持着一个较高水平的表达。RT-qPCR检测发现Ihh在压力加载1 h时出现明显高表达,而PTHrP则在2 h时出现明显高表达。100 kPa静压力加载3 h后,髁突软骨细胞突起增多、变长。结论 兔髁突软骨细胞对压力微环境的改变具有一定的适应能力;适宜的静压力可以提高髁突软骨细胞的成软骨能力;Ihh-PTHrP负反馈信号通路参与髁突软骨细胞对压力微环境改变的适应性改建过程。     

不同静压力下髁突软骨细胞MMP-13的表达变化研究

目的:探讨在不同强度及不同时间的静压力作用下,髁突软骨细胞中MMP-13表达的变化及意义。方法 :体外分离培养SD大鼠髁突软骨细胞,用甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色进行鉴定;分别用0、50、100、150、200 k Pa静压力进行2 h的加压处理。另外在200 k Pa静压力下,分别对髁突软骨细胞进行0、1、2、4、8和12 h的加压,采用Western blot免疫印迹及实时荧光定量PCR,分析髁突软骨细胞在不同强度及不同时间的静压力加载后,MMP-13的m RNA和蛋白表达变化。结果 :在50~200 k Pa的静压力范围内,随着压力的增大,MMP-13蛋白及m RNA表达水平均呈下降趋势,实验组表达水平均降至对照组(0 k Pa组)以下,且差异有统计学意义(P<0.05)。在200 k Pa的静压力下,随着加压时间的延长,MMP-13表达呈先上升后下降的趋势,且4 h实验组达最高水平(P<0.05)。结论:髁突软骨细胞对压力微环境的改变具有较好的适应能力,压力的改变可能影响颞下颌关节的适应性改建。     

兔关节软骨细胞的体外分离,纯化及鉴定

体外培养软骨细胞是研究大骨节病、骨关节炎等软骨疾病的一个重要手段,也为软骨细胞移植修复软骨缺损、畸形提供了可能。本文通过一种简单易行的方法,获得大量软骨细胞,绘制了其生长曲线,体外培养的软骨细胞倍增时间为56.9小时,研究了软骨细胞的传代、纯化特点,通过GAG染色、Ⅱ型胶原染色对软骨细胞进行鉴定,用透射电镜对其超微结构进行了观察。