喉癌干细胞在低氧介导的喉癌放疗抵抗中的作用机制

目的 体外观察低氧和常氧培养条件下喉癌CD133+细胞放疗后生长抑制率、克隆形成率的变化和DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA dependent protein kinase catalytic subunit, DNA-PKcs)、共济失调毛细血管扩张症突变基因(ataxiatelangiectasia mutate,ATM)、Survivin、P53的表达,探讨肿瘤干细胞在低氧介导的喉癌放疗抵抗中的作用机制.方法 体外培养人喉癌Hep-2细胞,用流式细胞仪分选出CD133+细胞,并分别在低氧和常氧条件下行无血清培养,流式细胞仪检测缺氧诱导因子-1α的表达.低氧组和常氧组分别用直线加速器给予0、5、10、15、20Gy的照射,24h后行四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测;给予10 Gy照射后12、24、36、48 h行MTT检测.行软琼脂克隆形成实验,并给予10 Gy照射,14 d后观察低氧和常氧组克隆形成率.两组细胞分别给予10 Gy照射,24h后用流式细胞仪分别检测DNA-PKcs、ATM、Survivin、P53的表达.结果 流式细胞仪分选后获得CD133+细胞纯度是92.8％,CD133+细胞常氧组各个剂量和时间点的生长抑制率均高于低氧组;在低氧和常氧条件下,CD133+细胞放疗后生长抑制率随放疗剂量的增加而增加,而10 Gy放疗后各个时间点细胞生长抑制率变化不大,24h时差异最大,具有统计学意义(t=6.12,P均＜0.05).软琼脂克隆形成实验显示CD133+细胞克隆形成率明显高于CD133-的对照组(P＜0.01),CD133+细胞低氧组的克隆形成率明显高于常氧组(P＜0.05).放疗前后低氧组克隆形成率变化不明显,而常氧组放疗后克隆形成率较放疗前低(P＜0.05).CD133+细胞的DNA-PKcs、ATM、Survivin和P53的表达均高于CD133-细胞(P＜0.01).放疗后两组细胞各种蛋白表达均高于放疗前(P＜0.01),低氧组放疗后DNA-PKcs、Survivin表达均较常氧组高(P＜0.05),而ATM、P53表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论 喉癌干细胞在低氧介导的喉癌放疗抵抗中有重要作用,多种通路参与了喉癌干细胞放射损伤的修复.     

人喉癌Hep-2细胞株CD133+肿瘤干细胞生物学特性研究

目的 研究喉癌Hep-2细胞株中CD133+肿瘤细胞的干细胞特性及其生物学特性.方法 流式细胞仪分选Hep-2细胞株中CD133+肿瘤细胞,Transwell法检测CD133+肿瘤细胞侵袭能力及三代克隆形成能力;CD133+肿瘤细胞与紫杉醇共培养,10 Gy的直线加速器照射CD133+肿瘤细胞,四甲基偶氮唑蓝法计算其相对存活率和生长抑制率,观察其放化疗抵抗性.结果 CD133+细胞比例为3.1％±0.2％,流式细胞仪分选纯度可达90.2％±5.5％,分选后的CD133+细胞贴壁,呈团块状、克隆球状生长.增殖速度明显较CD133-细胞快;Transwell实验中,相同视野CD133+细胞穿膜细胞数(526±39)个/每视野,而CD133-细胞为(220±20)个/每视野,二者差异有统计学意义(t=22.08,P＜0.01);CD133+细胞三代克隆形成率分别为30.0％±4.7％、32.2％±3.6％、32.7％±3.4％,CD133-细胞三代克隆形成率分别为15.2％±2.2％、12.0％±2.5％、13.8％±3.3％,同代比较差异有统计学意义(t值分别为8.99、14.66、12.69,P值均＜0.01).在紫杉醇共培养体系中,CD133+细胞24 h、48 h、72 h的相对存活率分别为90.1％±5.9％、85.1％±7.1％、70.3％±6.4％,均高于同时期对照组CD133-细胞(t值分别为5.24、8.18、8.14,P值均＜0.01);放射线照射后,CD133+细胞生长抑制率30.0％±7.1％,显著低于CD133-细胞的55.0％±6.3％(t=8.30,P＜0.01).结论 CD133+ Hep-2细胞所占比例较小,具有强的增殖、侵袭能力及克隆形成能力,对放化疗有抵抗性,具有干细胞特性.靶向CD133+肿瘤细胞,有望有效杀伤喉癌干细胞.     

喉癌CD133+侧群细胞的分离及体外生物学特性分析

目的 探索喉癌肿瘤干细胞的分选方法。方法 联合应用藻红蛋白标记的CD133单抗、侧群细胞（side population,SP）分选及流式细胞仪荧光活化细胞分选技术(fluorescence activated cell sorting,FACS)检测及分选喉癌Hep-2细胞系中的CD133+ SP及CD133 - SP细胞,在体外对2个亚群细胞进行肿瘤干细胞特性相关的增殖、分化、球体形成及药物敏感性试验并进行比较。结果 CD133+ SP细胞在喉癌Hep-2细胞系中占(0.30±0.12)％,远低于CD133+亚群(3.15±0.83)％及SP亚群(17.1±2.0)％。在体外增殖实验中CD133+SP较CD133- SP细胞表现出更强的增殖能力;纯化的CD133+ SP细胞体外培养后可以分化出CD133-SP细胞及非SP细胞,而CD133 - SP却不能分化成CD133+SP;CD133+SP在含生长因子的无血清培养基中可以形成悬浮生长的球体;CD133+ SP较CD133-SP有更强的化疗抵抗力。结论 CD133+SP较CD133-SP具备更明显的肿瘤干细胞特性,较CD133+亚群及SP亚群更有效地富集了喉癌肿瘤干细胞,可作为喉癌肿瘤干细胞研究的理想候选亚群。     

肿瘤干细胞在低氧介导的喉癌放疗抵抗中的作用的初步观察

目的:观察体外低氧和常氧培养条件下喉癌Hep-2细胞系在放疗前后CD133+细胞比例及生长抑制率的变化,探讨肿瘤干细胞在低氧介导的喉癌放疗抵抗中的作用。方法:体外常氧和低氧环境下培养人喉癌Hep-2细胞,用western blot检测HIF-1α的表达。细胞汇合约80%左右时后分别给予0、5、10、15、20Gy的60 Co照射,检测各组细胞放疗后不同时间细胞生长抑制率和CD133+细胞比例的变化。结果:低氧和常氧条件下,Hep-2细胞放疗后24h细胞增殖抑制率达到高峰,并随放疗剂量的增加而增加。常氧组各个剂量和时间点的生长抑制率均高于低氧组,24h、10Gy时差异最大,有统计学意义(P<0.05)。放疗后CD133+细胞低氧和常氧组均有不同程度的富集,低氧组在各个剂量和时间点的CD133+细胞比例均高于常氧组,24h、10Gy时差异最大,有统计学意义(P<0.05)。结论:喉癌干细胞在低氧介导的喉癌放疗抵抗中有重要作用,并提示阻断低氧因素可能会增强喉癌的放疗敏感性。     

低氧诱导因子-1α反义寡核酸联合化疗对Hep-2细胞的影响

目的 探讨应用反义寡核苷酸抑制低氧诱导因子-1α (hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞(简称Hep-2细胞)化疗敏感性的影响.方法 体外培养Hep-2细胞,脂质体介导反义寡核苷酸转染6h,给予化疗药物顺铂低氧培养24 h后,RT-PCR方法检测HIF-1...     

Bmi-1基因RNAi对喉癌细胞Hep-2生物学行为的影响

目的:构建Bmi-1基因的RNAi表达载体,观察其对喉癌细胞Hep-2增殖、侵袭能力的影响。方法:利用慢病毒表达体系pHelper1.0/pHelper2.0/pGCL2GFP,构建Bmi-1基因的RNAi重组质粒vshRNA-Bmi-1。实时定量PCR和蛋白质印迹法分别检测稳定转染vshRNA-Bmi-1后喉癌细胞中Bmi-1mRNA及蛋白的表达;克隆形成实验及小室侵袭实验检测喉癌细胞增殖和侵袭能力的变化。结果:稳定转染vshRNA-Bmi-1后Hep-2细胞Bmi-1mRNA表达均明显下降,Hep-2细胞中Bmi-1蛋白表达明显下降。抑制率分别为79%及88%。Bmi-1干扰后Hep-2细胞增殖减慢、侵袭能力减弱。结论:成功构建Bmi-1基因的RNAi表达载体,vshRNA-Bmi-1重组质粒明显下调Bmi-1mRNA和蛋白在喉癌细胞Hep-2中的表达。Bmi-1基因的RNAi能抑制喉癌细胞Hep-2的增殖和侵袭能力。     

CD133作为喉癌肿瘤起始细胞标志的实验研究

目的研究CD133在人喉癌细胞系Hep-2中的表达，观察纯化的CD133^＋肿瘤细胞体外生长特性，确定喉癌肿瘤起始细胞的表面标志。方法免疫荧光细胞化学技术及流式细胞仪检测喉癌Hep-2细胞系中的CD133表达，免疫磁珠分选技术纯化CD133^＋肿瘤细胞，体外培养并观察其增殖及分化能力。结果喉癌Hep-2细胞系中有3．22％的微量细胞CD133呈阳性表达，免疫磁珠富集的CD133^＋肿瘤细胞在无血清培养基中3、5、7d的吸光度分别为0.320、0．370、0．558，均高于相同条件下未分选细胞和CD133^-细胞；CD133^＋在培养体系中的比例逐日下降，至培养的第12天，由第1天的90．88％下降至4．53％。结论喉癌Hep-2细胞系中，CD133^＋癌细胞有比其他细胞亚群强的体外分化和增殖能力，CD133是肿瘤起始细胞的标志之一。     

CD133与喉癌肿瘤干细胞的实验研究

目的探讨CD133在人喉癌细胞系Hep-2中的表达，观察纯化的CD133阳性肿瘤细胞、CD133阴性肿瘤细胞及未分选Hep-2细胞在重症联合免疫缺陷小鼠中的成瘤性，筛选Hep-2细胞系肿瘤干细胞的表型。方法流式细胞仪检测CD133在Hep-2细胞系中的表达，免疫磁珠分选技术纯化CD133阳性肿瘤细胞，分选所得各细胞亚群细胞以及未分选细胞以一定的数量级注人重症联合免疫缺陷小鼠腹部皮下，比较其成瘤差异性。分选后的细胞进行了细胞周期的分析和HE染色观察生长形态，以排除成瘤差异由细胞周期分布不同及异源细胞引起。结果流式细胞仪示CD133在Hep-2细胞系中呈微量恒定表达，表达概率（3．15±0．83）％。免疫磁珠富集的CD133阳性肿瘤细胞并不处于细胞周期生长旺盛时相或优势分裂时相，而是与分选前周期分布相似且均匀的一类细胞；HE染色示细胞形态亦符合恶性肿瘤细胞的病理生长特性。体外成瘤试验显示16／20个CD133阳性细胞注射部位、7／20个CD133阴性细胞注射部位、10／20个未分选细胞注射部位可见肿瘤生长，统计学分析表明CD133阳性肿瘤细胞较CD133阴性细胞（χ^2=8．286，P=0．004）、未分选细胞（X2=3．956，P=0．047）在重症联合免疫缺陷小鼠体内具有很强的成瘤性。结论喉癌Hep-2细胞系中，CD133阳性癌细胞具有强的体内增殖能力，CD133为喉癌肿瘤干细胞的标志之一。     

喉癌干细胞在放化疗抵抗中的作用机制

目的：探讨喉癌干细胞的分选方法,分析顺铂、放射线联合应用对喉癌肿瘤干细胞的杀伤效应及机制。方法：应用流式细胞仪荧光活化细胞分选技术检测并分选出喉癌Hep-2细胞系中的CD133＋细胞和CD133-细胞,并检测CD133＋细胞亚群的干细胞特性;采用CCK-8试剂盒分别检测顺铂、放射线对两组细胞的生长抑制率;流式细胞仪检测不同干预方案对2组细胞凋亡率及细胞周期分布情况的影响。结果：CD133＋细胞在喉癌Hep-2细胞系中占（2．43±0．77）％,在细胞增殖、分化及体内成瘤试验中CD133＋细胞均表现出肿瘤干细胞特性;不同浓度剂量的顺铂、放射线对Hep-2细胞均有抑制作用,并在一定浓度范围内呈剂量依赖性;顺铂、放射线单独或联合应用时,CD133-细胞凋亡率显著高于CD133＋细胞（P〈0．01）,并产生G0／G1期阻滞。结论：CD133＋细胞较CD133-细胞更具有明显的肿瘤干细胞特性,对放化疗具有明显的抵抗作用,对凋亡诱导作用不敏感和细胞周期改变为其机制之一。     

组织缺氧诱导因子-1α及相关靶基因在喉鳞状细胞癌组织中的表达

目的 检测喉鳞状细胞癌(简称鳞癌)组织缺氧诱导因子-10α( hypoxia inducible factor 1 alpha,HIF-1α)、葡萄糖转运蛋白-1(glucose transporter protein-1,GLUT-1)、血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor,VEGF)的蛋白表达情况,并通过体外实验进一步验证低氧对喉鳞癌细胞HIF-1α及其下游靶基因GLUT-1、VEGF的表达上调方面的重要促进作用.方法 采用SP免疫组织化学和免疫细胞化学方法检测喉鳞癌组织和Hep-2细胞中HIF-1α、GLUT-1、VEGF蛋白的表达,分析HIF-1α与GLUT-1、VEGF表达的相关性.结果 35例喉癌患者组织切片中16例HIF-1α表达阳性(45.7％),16例GLUT-1表达阳性(阳性率45.7％),19例VEGF表达阳性(阳性率54.3％).HIF-1α和VEGF的表达水平与喉癌病理分级和淋巴转移有关(P值均＜0.05);GLUT-1表达水平与淋巴转移有关(P＜0.05).体外实验结果显示,Hep-2细胞在低氧条件下HIF-1α、GLUT-1、VEGF的蛋白表达明显增加(P值均＜0.05).结论 HIF-1α可作为转录调控因子参与调控GLUT-1、VEGF的表达,进而在喉癌的发生、侵袭、转移过程中发挥重要作用.     

人脂肪源性间充质干细胞向内耳毛细胞定向诱导分化的实验研究

目的 验证在体外将人脂肪源性间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymalstem cells,hAD-MSC)定向分化为内耳毛细胞的可行性.方法 用特定的培养体系配合多种细胞因子定向诱导hAD-MSC向神经干/祖细胞样细胞分化,而后进一步将诱导后细胞与发育期鸡胚听泡细胞在体外进行共培养,以促使其向内耳毛细胞分化,通过免疫组化等方法对分化不同阶段的细胞特异性指标进行鉴定.结果 hAD-MSC诱导后呈现神经干/祖细胞样的形态并表达其特异性标志,与发育期鸡胚听泡细胞共培养后表达内耳毛细胞特异性标志.结论 hAD-MSC在体外可定向诱导分化为具有内耳毛细胞特异性标志的毛细胞样细胞.     

离体培养时Wnt3a对椭圆囊毛细胞再生的影响

目的 在小鼠椭圆囊体外培养模型上,通过Wnt3a激活经典WNT信号,与DMSO共同作用,研究其对椭圆囊毛细胞再生的影响。方法 40只小鼠随机分成8组。实验第一部分：小鼠椭圆囊经4mmol/L新霉素处理后,在不同浓度(0、25、100、200ng/mL)Wnt3a的培养液中继续培养1d,培养结束后对β-catenin,毛细胞纤毛及细胞核进行免疫荧光染色。实验第二部分：小鼠椭圆囊经4mmol/L新霉素处理后,在含25ng/mL Wnt3a的培养液中培养6d,分别在空白对照组,50μmol/L DAPT、0.1%DMSO、50μmol/L DAPT+25ng/mL Wnt3a培养液中继续培养7d,共培养14d。在所有培养过程中均加入10μmol/L Brdu。培养结束后Brdu,Myocin7a及细胞核进行免疫荧光染色。结果 实验第一部分：在25ng/mL Wnt3a组中可见β-catenin在支持细胞胞浆中有阳性表达,β-catenin阳性细胞数与其他各组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。实验第二部分：DMSO组中可见Myosin7a染色阳性细胞,对照组、Wnt3a+DAPT组及DATP组中可见大量Brdu阳性细胞而未见Myosin7a染色阳性细胞,DMSO组中Myosin7a阳性细胞数与其他3组相比较,组间差异具有显著性(P<0.01)。结论 顺序联合应用Wnt3a和DMSO可通过激活经典WNT信号途径,促使椭圆囊内细胞向毛细胞样细胞转分化。     

支持细胞在哺乳动物耳蜗发育及功能中的作用

耳蜗的感觉上皮细胞有毛细胞和支持细胞两种类型.许多研究旨在探讨听力损失的基本机制,重点针对毛细胞和螺旋神经元,较少关注支持细胞.目前对支持细胞作用的了解已从单纯的结构支持扩展到耳蜗毛细胞分化发育、耳蜗离子稳态、毛细胞感音功能的调节以及突触发生发育、毛细胞损伤修复的多个方面.本文对支持细胞在哺乳动物耳蜗发育及功能中的关键作用做一综述.     

CD44+喉癌细胞的干细胞生物学特性初步研究

目的 初步研究透明质酸盐受体(hyalurate receptor)CD+44喉癌细胞的干细胞生物学特性.方法 原代培养喉痛细胞,利用亲和板结合分离法,将CD+44和CD+44肿瘤细胞分选出来,继续常规培养,比较CD+44与CD+44肿瘤细胞在功能状态、细胞周期、分化状态、克隆形成能力及形态等方面的差异.结果 CD+44细胞在喉癌细胞中所占的百分率为49.8%～53.5%,中位数为51.3%,亲和板结合法分选出CD+44细胞,继续常规培养后恢复原始比例.CD+44细胞中RNA含量低,细胞处于GO和G1期的比例高于CD+44细胞.CD+44细胞中正常鳞状上皮干细胞角蛋白(cytokeratin 14,CK14)表达强阳性或阳性,而分化的上皮细胞标记物外皮蛋白(involucrin)表达弱阴性或阴性.倒置显微镜下观察,CD+44细胞为多角形,突起多;而CD+44细胞为梭形,突起较少.对CD+44细胞进行有限稀释单细胞克隆培养,产生的子代克隆集落出现了异质性细胞,而CD-44细胞未能产生异质性子代细胞.与CD-44细胞相比,CD+44细胞表现出较高的克隆形成能力说明其具有较强的增殖能力.结论 CD+44喉癌细胞具有干细胞的某些特性,肿瘤干细胞可能存在于CD+44细胞内.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向内耳毛细胞样细胞分化的研究

目的 探讨体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞向耳蜗毛细胞样细胞分化的可行性.方法 分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,并加以鉴定.分离出生1～3 d的乳鼠耳蜗Corti器,与骨髓间充质干细胞在体外共培养14 d.通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学染色对分化细胞的特异性分子指标(myosinⅦa、math1及calretinin)进行鉴定.结果 免疫细胞化学染色显示诱导分化后的细胞myosinⅦa、math1和calretinin表达阳性,RT-PCR提示分化后的细胞可表达毛细胞的标志物myosinⅦa和math1.结论 体外培养的骨髓间充质干细胞可诱导分化为具有毛细胞分子标志物的毛细胞样细胞.     

PiggyBac transposon-mediated gene delivery efficiently generates stable transfectants derived from cultured primary human deciduous tooth dental pulp cells (HDDPCs) and HDDPC-derived iPS cells

The ability of human deciduous tooth dental pulp cells (HDDPCs) to differentiate into odontoblasts that generate mineralized tissue holds immense potential for therapeutic use in the field of tooth regenerative medicine. Realization of this potential depends on efficient and optimized protocols for the genetic manipulation of HDDPCs. In this study, we demonstrate the use of a PiggyBac (PB)-based gene transfer system as a method for introducing nonviral transposon DNA into HDDPCs and HDDPC-derived inducible pluripotent stem cells. The transfection efficiency of the PB-based system was significantly greater than previously reported for electroporation-based transfection of plasmid DNA. Using the neomycin resistance gene as a selection marker, HDDPCs were stably transfected at a rate nearly 40-fold higher than that achieved using conventional methods. Using this system, it was also possible to introduce two constructs simultaneously into a single cell. The resulting stable transfectants, expressing tdTomato and enhanced green fluorescent protein, exhibited both red and green fluorescence. The established cell line did not lose the acquired phenotype over three months of culture. Based on our results, we concluded that PB is superior to currently available methods for introducing plasmid DNA into HDDPCs. There may be significant challenges in the direct clinical application of this method for human dental tissue engineering due to safety risks and ethical concerns. However, the high level of transfection achieved with PB may have significant advantages in basic scientific research for dental tissue engineering applications, such as functional studies of genes and proteins. Furthermore, it is a useful tool for the isolation of genetically engineered HDDPC-derived stem cells for studies in tooth regenerative medicine.     

喉癌CD133+侧群细胞的分离及体内致瘤性分析

目的 探索能够有效富集喉癌肿瘤干细胞的分选方法.方法 流式细胞仪辅助下联合应用CD133标记及侧群(side population,SP)细胞分选技术检测及分选喉癌Hep-2细胞系中的CD133+ SP及CD133 - SP细胞,将分选所得两亚群细胞以相同的数量级注入非肥胖糖尿病型/重症联合免疫缺陷( NOD/SCID)小鼠右侧腋窝皮下,比较两亚群细胞致瘤性差异,并对两亚群细胞进行细胞周期检测分析.结果 CD133+ SP及CD133 - SP细胞在喉癌Hep-2细胞系中各占(0.30±0.12)％及(17.52±1.59)％.CD133+SP在16只NOD/SCID小鼠中的15只腋窝皮下成瘤,CD133- SP细胞仅在16只NOD/SCID小鼠中的7只腋窝皮下成瘤,差异有统计学意义(Fisher精切概率法,P＜0.05).CD133+ SP细胞所成瘤体的重量平均((-x)±s,下同)为(0.36±0.15)g,而CD133 - SP细胞所成瘤体重量平均为(0.08 ±0.04)g,差异有统计学意义(t=4.64,P＜0.01).细胞周期检测发现,CD133+ SP及CD133 - SP细胞具有相似的细胞周期分布.结论 CD133+ SP比CD133 - SP具备更强的免疫缺陷小鼠体内致瘤能力;SP细胞分选法与CD133标记相结合是一种更有效的富集喉癌肿瘤干细胞的分选方法.     

豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞乙酰胆碱敏感性大电导钙依赖性钾通道与L型钙通道共存

目的 研究豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)敏感性大电导钙依赖性钾通道(big conductance,calcium-dependent potassium channel,BK)激活过程中的钙离子内流机制.方法 健康杂色豚鼠52只,断头后取出前庭终器,经胶原酶IA消化后获取Ⅱ型前庭毛细胞.采用全细胞膜片钳技术检测新鲜单离的Ⅱ型前庭毛细胞ACh-敏感性BK电流对细胞外钙通道阻断剂和激动剂的敏感性.结果 ①细胞外ACh激活一缓慢持久的外向性电流,其反转电位为(-70.5±10.6)mV(-x±s,下同,n=10);-50 mV钳制电压下,100 μmol/L ACh激活电流的幅值为(267±106)pA(n=11).②ACh-敏感性钾电流对细胞外IBTX(iberiotoxin,200 nmol/L)敏感,而细胞外蜂毒明肽(apamin,1 μmol/L)对ACh-敏感性钾电流幅值无抑制作用.③ACh-敏感性BK对细胞外钙通道阻断剂NiCl2敏感,可被细胞外钙通道阻断剂CdCl2强力阻断.NiCl2和CdCl2对ACh-敏感性BK的半数抑制浓度分别为(135.5±18.5)μmol/L(n=7)和(23.4±2.6)μmol/L(n=7).④L型钙通道激动剂(-)-Bay-K 8644激活Ⅱ型前庭毛细胞产生一种与ACh-敏感性BK类似的外向性电流,并能被IBTX强力阻断.结论 Ⅱ型前庭毛细胞中ACh-敏感性BK与细胞膜L型钙通道共存,可能具有重要的生理学作用和意义.