喉癌干细胞在低氧介导的喉癌放疗抵抗中的作用机制

目的 体外观察低氧和常氧培养条件下喉癌CD133+细胞放疗后生长抑制率、克隆形成率的变化和DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA dependent protein kinase catalytic subunit, DNA-PKcs)、共济失调毛细血管扩张症突变基因(ataxiatelangiectasia mutate,ATM)、Survivin、P53的表达,探讨肿瘤干细胞在低氧介导的喉癌放疗抵抗中的作用机制.方法 体外培养人喉癌Hep-2细胞,用流式细胞仪分选出CD133+细胞,并分别在低氧和常氧条件下行无血清培养,流式细胞仪检测缺氧诱导因子-1α的表达.低氧组和常氧组分别用直线加速器给予0、5、10、15、20Gy的照射,24h后行四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测;给予10 Gy照射后12、24、36、48 h行MTT检测.行软琼脂克隆形成实验,并给予10 Gy照射,14 d后观察低氧和常氧组克隆形成率.两组细胞分别给予10 Gy照射,24h后用流式细胞仪分别检测DNA-PKcs、ATM、Survivin、P53的表达.结果 流式细胞仪分选后获得CD133+细胞纯度是92.8％,CD133+细胞常氧组各个剂量和时间点的生长抑制率均高于低氧组;在低氧和常氧条件下,CD133+细胞放疗后生长抑制率随放疗剂量的增加而增加,而10 Gy放疗后各个时间点细胞生长抑制率变化不大,24h时差异最大,具有统计学意义(t=6.12,P均＜0.05).软琼脂克隆形成实验显示CD133+细胞克隆形成率明显高于CD133-的对照组(P＜0.01),CD133+细胞低氧组的克隆形成率明显高于常氧组(P＜0.05).放疗前后低氧组克隆形成率变化不明显,而常氧组放疗后克隆形成率较放疗前低(P＜0.05).CD133+细胞的DNA-PKcs、ATM、Survivin和P53的表达均高于CD133-细胞(P＜0.01).放疗后两组细胞各种蛋白表达均高于放疗前(P＜0.01),低氧组放疗后DNA-PKcs、Survivin表达均较常氧组高(P＜0.05),而ATM、P53表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论 喉癌干细胞在低氧介导的喉癌放疗抵抗中有重要作用,多种通路参与了喉癌干细胞放射损伤的修复.     

西妥昔单抗联合放化疗对喉鳞状细胞癌的协同杀伤效应

目的：观察西妥昔单抗诱导人喉鳞状细胞癌细胞株Hep-2凋亡的敏感性,并探讨西妥昔单抗与顺铂、放射线联合应用对Hep-2细胞的杀伤效应及机制。方法：采用CCK-8试剂盒分别检测西妥昔单抗、顺铂、放射线对Hep-2生长抑制率,流式细胞仪检测不同干预方案对Hep-2凋亡率及细胞周期分布情况。结果：不同浓度西妥昔单抗对Hep-2细胞均有抑制作用,并在一定浓度范围内呈时间一剂量依赖性,24h半数抑制浓度为1036．84μg／ml;顺铂,放射线分别与西妥昔单抗联合应用时,Hep-2凋亡率显著高于顺铂、放射线单独或联合应用（P〈0．01）,并产生Go／G1期阻滞。结论：Hep-2细胞对西妥昔单抗诱导的细胞凋亡敏感,顺铂和（或）放射线与西妥昔单抗联用对Hep-2细胞的增殖具有协同抑制效应;显著的凋亡诱导作用和对Hep-2细胞周期的影响为其机制之一,为临床喉鳞状细胞癌靶向EGFR并联合放化疗方案提供了理论依据。     

喉癌干细胞研究进展

喉癌是仅次于肺癌的第二大呼吸道高发癌,临床上多种治疗方式的综合应用已使患者的5年生存率及生活质量大大提高,但治疗后的复发、转移、放疗抵抗及化疗耐受等问题仍是致死的主要原因,迫切需要从新的视角研发新的治疗手段。近年来,肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSCs）理论认为,肿瘤中存在极少数具有无限增殖、多向分化潜能的CSCs,它们是肿瘤的种子,是肿瘤无限增殖、复发和转移的根源;其余的大多数肿瘤细胞只维持肿瘤的体积,无增殖能力或只有有限的增殖潜能,它们经过短暂分化,最终凋亡或死亡。CSCs具有永生或无限自我更新能力,数目相对恒定,常以痕量存在;具有强的迁徙、浸润、转移、     

肿瘤干细胞在低氧介导的喉癌放疗抵抗中的作用的初步观察

目的:观察体外低氧和常氧培养条件下喉癌Hep-2细胞系在放疗前后CD133+细胞比例及生长抑制率的变化,探讨肿瘤干细胞在低氧介导的喉癌放疗抵抗中的作用。方法:体外常氧和低氧环境下培养人喉癌Hep-2细胞,用western blot检测HIF-1α的表达。细胞汇合约80%左右时后分别给予0、5、10、15、20Gy的60 Co照射,检测各组细胞放疗后不同时间细胞生长抑制率和CD133+细胞比例的变化。结果:低氧和常氧条件下,Hep-2细胞放疗后24h细胞增殖抑制率达到高峰,并随放疗剂量的增加而增加。常氧组各个剂量和时间点的生长抑制率均高于低氧组,24h、10Gy时差异最大,有统计学意义(P<0.05)。放疗后CD133+细胞低氧和常氧组均有不同程度的富集,低氧组在各个剂量和时间点的CD133+细胞比例均高于常氧组,24h、10Gy时差异最大,有统计学意义(P<0.05)。结论:喉癌干细胞在低氧介导的喉癌放疗抵抗中有重要作用,并提示阻断低氧因素可能会增强喉癌的放疗敏感性。     

肿瘤干细胞在喉癌研究中的应用

喉癌是耳鼻咽喉头颈外科的重点研究方向.近年来随着相关研究的深入,干细胞的研究逐渐受到重视,通过干细胞的研究进一步阐明肿瘤的发病机制,为喉癌的研究与治疗带来新的希望.本文就肿瘤干细胞在喉癌研究中的应用做一综述.     

CD133与喉癌肿瘤干细胞的实验研究

目的探讨CD133在人喉癌细胞系Hep-2中的表达，观察纯化的CD133阳性肿瘤细胞、CD133阴性肿瘤细胞及未分选Hep-2细胞在重症联合免疫缺陷小鼠中的成瘤性，筛选Hep-2细胞系肿瘤干细胞的表型。方法流式细胞仪检测CD133在Hep-2细胞系中的表达，免疫磁珠分选技术纯化CD133阳性肿瘤细胞，分选所得各细胞亚群细胞以及未分选细胞以一定的数量级注人重症联合免疫缺陷小鼠腹部皮下，比较其成瘤差异性。分选后的细胞进行了细胞周期的分析和HE染色观察生长形态，以排除成瘤差异由细胞周期分布不同及异源细胞引起。结果流式细胞仪示CD133在Hep-2细胞系中呈微量恒定表达，表达概率（3．15±0．83）％。免疫磁珠富集的CD133阳性肿瘤细胞并不处于细胞周期生长旺盛时相或优势分裂时相，而是与分选前周期分布相似且均匀的一类细胞；HE染色示细胞形态亦符合恶性肿瘤细胞的病理生长特性。体外成瘤试验显示16／20个CD133阳性细胞注射部位、7／20个CD133阴性细胞注射部位、10／20个未分选细胞注射部位可见肿瘤生长，统计学分析表明CD133阳性肿瘤细胞较CD133阴性细胞（χ^2=8．286，P=0．004）、未分选细胞（X2=3．956，P=0．047）在重症联合免疫缺陷小鼠体内具有很强的成瘤性。结论喉癌Hep-2细胞系中，CD133阳性癌细胞具有强的体内增殖能力，CD133为喉癌肿瘤干细胞的标志之一。     

Survivin基因在喉癌中的表达及意义

目的 研究凋亡抑制蛋白Survivin基因在喉癌组织及喉癌细胞株中的表达,探讨其在喉癌发生发展中的作用。方法 采用免疫组织化学技术,研究42例喉癌标本、20例癌旁组织、20例喉角化症、10例正常喉黏膜中Survivin 蛋白的表达情况;并用RT-PCR技术检测喉癌细胞株Hep-2中Survivin mRNA的表达。结果 正常喉黏膜中无Survivin表达, 喉癌组织中Survivin 蛋白的表达 (66.6 %) 明显高于癌旁组织 (40.0 %)和喉角化症(35.0 %)(P<0.001),喉癌组织中Survivin表达与临床分期、病理分级及有无颈淋巴结转移无明显相关性(P > 0.05)。喉癌细胞株Hep - 2中有较强Survivin mRNA的表达。结论 Survivin基因在喉癌组织及喉癌细胞株中的高表达可能与喉癌的发生关系密切,具体机制有待于进一步研究。     

低氧对Hep-2细胞肿瘤干细胞特性和化疗抵抗的影响及其作用机制

目的 探讨低氧对Hep-2细胞肿瘤干细胞特性和化疗抵抗的影响,并分析其相关机制.方法 构建针对低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor 1 alpha,HIF-1α)的短发夹RNA重组质粒,转染Hep-2细胞,经筛选建立HIF-1 α基因敲除的Hep-2细胞并检测HIF-1α表达的变化;观察低氧条件培养的Hep-2细胞增殖、克隆形成、细胞周期、凋亡及CD133表型等细胞生理学特性变化;流式细胞仪分选CD133+细胞,观察CD133+细胞克隆形成及顺铂杀伤情况,并检测相关基因Oct-4、p53及survivin表达变化.用方差分析及两样本均数比较的t检验进行统计分析.结果 成功建立HIF-1α基因敲除Hep-2细胞,HIF-1 α在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调;低氧培养Hep-2细胞具有较高的增殖活性及克隆形成能力,凋亡率降低,细胞周期GO/G1期阻滞、CD133表达升高,而HIF-1α基因敲除后上述变化减弱;成功分选出Hep-2细胞中的CD133+细胞,CD133+细胞克隆形成能力高、顺铂杀伤抗性强,而HIF-1α基因敲除后上述能力降低,并出现Oct-4表达下调,p53表达上调,survivin表达下调.结论 低氧能够诱导和强化Hep-2细胞的肿瘤干细胞特性,增强CD133+细胞的增殖分化和化疗抵抗能力,其作用机制可能与HIF-1α及其诱导的相关基因表达变化相关.     

紫杉醇对人喉癌细胞系Hep-2的抑制作用研究

目的：通过体外实验评价紫杉醇对人喉癌细胞系Hep-2的抑制作用。方法：应用人喉癌细胞系Hep-2，将细胞暴露于不同浓度紫杉醇下，分别于6、12、24、48、72h收集标本，进行细胞形态观察；流式细胞仪细胞周期分析；MTT法检测细胞生长情况，绘制细胞生长曲线；应用琼脂糖凝胶电泳进行检测和观察。结果：人喉癌细胞系Hep-2在紫杉醇的作用下，细胞分裂阻滞在分裂期的中期，并诱导细胞发生凋亡；凋亡细胞表现为细胞固缩，核染色质凝聚或者断裂；细胞DNA裂解片段呈现典型的“阶梯状”排列的条带；紫杉醇对Hep-2的细胞毒性与剂量和时间有依赖关系。结论：紫杉醇诱发人喉癌细胞凋亡与细胞分裂期阻滞密切相关，随浓度和时间延长，G2／M期细胞的比率也增高。     

吲哚美辛对人喉癌Hep-2细胞系的生长及侵袭作用的研究

目的：通过体外实验评价吲哚美辛对人喉癌Hep-2细胞系的抑制作用。方法：应用不同浓度的吲哚美辛作用于人喉癌Hep-2细胞系，进行细胞形态观察，锥虫蓝染色法检测细胞生长情况和流式细胞仪分析细胞DNA含量。Hep-2细胞经吲哚美辛作用后，撤药培养，绘制生长曲线，并用软琼脂集落形成实验检测肿瘤细胞非锚着生长能力，琼脂糖滴法检测肿瘤细胞移动能力，单层细胞侵袭实验计算肿瘤侵袭指数。结果：Hep-2细胞系在吲哚美辛作用下，细胞生长形态改变，细胞增殖缓慢，流式细胞仪分析形成明显的亚二倍体峰。细胞毒性与药物剂量及作用时间有依赖关系。吲哚美辛作用后的Hep-2细胞软琼脂集落形成数目减少，细胞移动能力下降，单层细胞侵袭指数降低，但生长曲线较对照组无明显差异。结论：吲哚美辛抑制人喉癌细胞系Hep-2生长，诱导凋亡，降低细胞的侵袭性。     

低氧对人喉癌Hep-2细胞增殖及凋亡的影响

目的：探讨低氧对喉癌Hep-2细胞增殖及凋亡的影响。方法：模拟人体实体肿瘤低氧环境,应用MTT法检测低氧组与常氧组6、12、24、36h细胞增殖率,流式细胞学方法检测低氧组与常氧组6、12、24、36h细胞凋亡率。结果：常氧与低氧细胞增殖率随时间延长均呈逐渐升高趋势;常氧组与低氧组6、12、24、36h各时间点下比较于24h差异有统计学意义（P〈0.01）。低氧组细胞凋亡率于6、12、24h较常氧组低（P〈0.01）,于36h较常氧组高（P〈0.05）。结论：低氧可促进细胞增殖,且细胞增殖率可随时间延长逐渐增高。低氧能够抑制细胞凋亡,但持续缺氧还可以促进细胞凋亡。     

肿瘤抑素抗肿瘤相关肽治疗人喉鳞状细胞癌裸鼠模型的实验研究

目的:研究肿瘤抑素抗肿瘤相关肽对裸鼠喉癌皮下移植模型的抑瘤作用,探讨其抑瘤机制及人喉癌生物治疗新方法。方法:建立人喉癌Hep-Ⅱ细胞株裸鼠皮下接种模型,应用肿瘤抑素抗肿瘤相关肽治疗,观察肿瘤生长情况。对治疗后的肿瘤组织进行病理学检查、免疫组织化学检查及电镜观察,记数微血管密度。结果:在治疗组与对照组之间,平均鼠净重、瘤重、瘤体积及瘤重/鼠净重比,差异均有统计学意义(均P<0.01),治疗组抑瘤率为51.58%。病理学检查及电镜观察表明,治疗组肿瘤生长受到抑制,细胞分裂少见,可见肿瘤细胞的坏死凋亡,新生血管明显减少,其微血管密度明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:肿瘤抑素抗肿瘤相关肽可显著抑制人喉癌裸鼠模型肿瘤的生长和发展。     

XIAP反义寡核苷酸对喉癌Hep-2细胞化疗增敏作用的研究

目的 通过X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP)反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASODN)转染喉癌Hep-2细胞,探讨其对喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响.方法 体外培养人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞,应用脂质体法进行XIAP ASODN基因转染,荧光显微镜下观察计算转...     

59例晚期声门上型喉鳞状细胞癌治疗和临床疗效分析

目的：比较手术加辅助放疗与单纯手术治疗晚期声门上型喉鳞状细胞癌的疗效。方法：将59例晚期声门上型喉鳞状细胞癌按治疗方法分为手术＋放疗组（33例）和手术组（26例）。手术＋放疗组全喉切除27例,部分切除6例,其中27例行侧颈淋巴结清扫术;手术组全喉切除23例,部分切除3例,其中24例行侧颈淋巴结清扫术。结果：手术＋放疗组和手术组的3年总生存率分别为62．6％和62．6％,5年总生存率分别为43．8％和40．5％,经Log—rank检验两组之间的生存率差异无统计学意义（P〉0．05）。手术＋放疗组5例复发,复发率15．2％;手术组10例复发,复发率38．5％,两组的复发率差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：手术加辅助放疗未能提高晚期声门上型喉鳞状细胞癌3、5年总生存率,但明显降低肿瘤复发率。     

CD44+喉癌细胞的干细胞生物学特性初步研究

目的 初步研究透明质酸盐受体(hyalurate receptor)CD+44喉癌细胞的干细胞生物学特性.方法 原代培养喉痛细胞,利用亲和板结合分离法,将CD+44和CD+44肿瘤细胞分选出来,继续常规培养,比较CD+44与CD+44肿瘤细胞在功能状态、细胞周期、分化状态、克隆形成能力及形态等方面的差异.结果 CD+44细胞在喉癌细胞中所占的百分率为49.8%～53.5%,中位数为51.3%,亲和板结合法分选出CD+44细胞,继续常规培养后恢复原始比例.CD+44细胞中RNA含量低,细胞处于GO和G1期的比例高于CD+44细胞.CD+44细胞中正常鳞状上皮干细胞角蛋白(cytokeratin 14,CK14)表达强阳性或阳性,而分化的上皮细胞标记物外皮蛋白(involucrin)表达弱阴性或阴性.倒置显微镜下观察,CD+44细胞为多角形,突起多;而CD+44细胞为梭形,突起较少.对CD+44细胞进行有限稀释单细胞克隆培养,产生的子代克隆集落出现了异质性细胞,而CD-44细胞未能产生异质性子代细胞.与CD-44细胞相比,CD+44细胞表现出较高的克隆形成能力说明其具有较强的增殖能力.结论 CD+44喉癌细胞具有干细胞的某些特性,肿瘤干细胞可能存在于CD+44细胞内.     

人喉癌Hep-2细胞株CD133+肿瘤干细胞生物学特性研究

目的 研究喉癌Hep-2细胞株中CD133+肿瘤细胞的干细胞特性及其生物学特性.方法 流式细胞仪分选Hep-2细胞株中CD133+肿瘤细胞,Transwell法检测CD133+肿瘤细胞侵袭能力及三代克隆形成能力;CD133+肿瘤细胞与紫杉醇共培养,10 Gy的直线加速器照射CD133+肿瘤细胞,四甲基偶氮唑蓝法计算其相对存活率和生长抑制率,观察其放化疗抵抗性.结果 CD133+细胞比例为3.1％±0.2％,流式细胞仪分选纯度可达90.2％±5.5％,分选后的CD133+细胞贴壁,呈团块状、克隆球状生长.增殖速度明显较CD133-细胞快;Transwell实验中,相同视野CD133+细胞穿膜细胞数(526±39)个/每视野,而CD133-细胞为(220±20)个/每视野,二者差异有统计学意义(t=22.08,P＜0.01);CD133+细胞三代克隆形成率分别为30.0％±4.7％、32.2％±3.6％、32.7％±3.4％,CD133-细胞三代克隆形成率分别为15.2％±2.2％、12.0％±2.5％、13.8％±3.3％,同代比较差异有统计学意义(t值分别为8.99、14.66、12.69,P值均＜0.01).在紫杉醇共培养体系中,CD133+细胞24 h、48 h、72 h的相对存活率分别为90.1％±5.9％、85.1％±7.1％、70.3％±6.4％,均高于同时期对照组CD133-细胞(t值分别为5.24、8.18、8.14,P值均＜0.01);放射线照射后,CD133+细胞生长抑制率30.0％±7.1％,显著低于CD133-细胞的55.0％±6.3％(t=8.30,P＜0.01).结论 CD133+ Hep-2细胞所占比例较小,具有强的增殖、侵袭能力及克隆形成能力,对放化疗有抵抗性,具有干细胞特性.靶向CD133+肿瘤细胞,有望有效杀伤喉癌干细胞.