结核分枝杆菌Rv3621c原核表达及免疫功能研究

目的 以结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)H37Rv基因组为模板,构建、纯化及鉴定原核表达质粒pPROEX-Rv3621c,通过人群、小鼠试验进行免疫原性评价。方法 构建重组质粒pPROEX-Rv3621c,并以全血干扰素释放分析技术(Whole-blood IFN-γ release assay,WBIA)检测其能否被安徽省淮南市M.tb感染者T细胞特异性识别。rRv3621c混合佐剂MTM[母牛分枝杆菌(M.vaccae),人工合成海藻糖-6'6,二分枝菌酸(TDB),单磷酰脂质A(MPLA)]免疫小鼠后,检测血清中特异性抗体分泌水平、脾细胞中抗原特异性Th1型细胞因子分泌水平及肺脏细胞因子mRNA表达水平。结果 成功构建重组质粒pPROEX-Rv3621c,并使之诱导表达、纯化和鉴定。在rRv3621c蛋白诱导下,活动性结核(Active tuberculosis, ATB)患者外周血淋巴细胞释放的IFN-γ水平明显较高(t=4.813, P<0.01),且ATB患者产生的IFN-γ水平高于潜伏性结核(Latent tuberculosis infection, LTBI)人群(t=4.442, P<0.01)。BCG+Rv3621c/MTM组小鼠产生的特异性抗体滴度水平明显高于Rv3621c/MTM组(P<0.01)和BCG组(P<0.01),Rv3621c/MTM组和BCG+Rv3621c/MTM组小鼠的IgG2a/IgG1比值大于1,明显高于MTM组和BCG组。BCG+Rv3621c/MTM组小鼠均分泌高水平IFN-γ、TNF-α和IL-2。Rv3621c/MTM组小鼠肺脏组织中IFN-γ、TNF-α及iNOS表达水平较高。结论 M.tb感染者外周血T细胞可特异性识别rRv3621c蛋白,rRv3621c混合佐剂MTM可以诱导较强烈的抗原特异性Th1型免疫应答。     

结核分枝杆菌EsxV亚单位疫苗黏膜免疫诱导的免疫应答

目的 研究结核分枝杆菌抗原Rv3619c(EsxV)黏膜免疫小鼠诱导的免疫应答水平。方法 PCR法扩增esxV基因克隆入原核表达载体pET28a(+),获得的重组E.coli诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定蛋白的表达,亲和层析法纯化EsxV蛋白。以EsxV和/或联合环二腺苷酸(c-di-AMP)经鼻黏膜免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠特异性抗体水平及亚类,MTS法检测脾细胞增殖,qRT-PCR检测脾和肺脏细胞因子表达水平,ELISA法检测脾细胞因子分泌水平。结果 成功构建EsxV的原核表达载体pET28a(+)-esxV并诱导表达目的蛋白,亲和层析法获得了纯化的重组EsxV蛋白。EsxV经黏膜免疫可诱导显著的体液免疫应答,但诱导的细胞免疫应答水平不高。EsxV与c-di-AMP经黏膜接种可诱导特异性IgG水平增加,EsxV蛋白特异的脾细胞增殖,脾和肺细胞的IFN-γ转录增加。c-di-AMP显著提高EsxV特异的IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-17细胞因子分泌,而不诱导炎症因子TNF-α和IL-6表达。结论 EsxV与c-di-AMP佐剂构建的亚单位疫苗可诱导特异性体液和细胞免疫应答,可进一步用于新型结核病亚单位疫苗的研制。     

应用RNAi技术探讨CAP10基因在新型隐球菌感染小鼠中对Th1-Th2型免疫的影响

目的 设计siRNA表达质粒干扰CAP10基因的合成,将siRNA干扰前与干扰后的新型隐球菌菌液经呼吸道感染小鼠分别建立动物模型,行组织病理学检查与细胞因子检测,探讨CAP10基因对Th1/Th2 免疫应答的影响。方法 建立小鼠吸入感染隐球菌模型,在感染后第7 d(急性期),PAS染色观察小鼠肺组织病理变化,并采用酶联免疫吸附试验定量检测小鼠血液中的Th1(IFN-γ、TNF-α)、Th2细胞因子(IL-10)水平。结果 急性期小鼠血液内IFN-γ、TNF-α及IL-10浓度测定分别为:对照组(uninfected组)(19.24±1.31)pg/mL,(36.94±2.04)pg/mL及(18.32±3.00)pg/mL,新型隐球菌未干扰组(WT组)(14.34±1.26)pg/mL,(25.37±1.37)pg/mL及(72.96±8.83)pg/mL,新型隐球菌干扰组(siRNA-CAP10组)(14.63±0.95)pg/mL,(26.22±1.55)pg/mL及(38.73±4.61)pg/mL。与对照组相比,WT组和siRNA-CAP10组Th1因子IFN-γ及TNF-α水平明显降低(P<0.01),Th2细胞因子IL-10水平明显增高。WT组与siRNA-CAP10组相比,IFN-γ及TNF-α水平未见明显增高而IL-10水平明显增高(P<0.01)。IFN-γ/IL-10及TNF-α/IL-10的比率分别为:对照组1.08±0.21,2.07±0.34,WT组0.20±0.03,0.35±0.05,siRNA-CAP10组0.38±0.04,0.69±0.09。WT组和siRNA-CAP10组IFN-γ/IL-10及TNF-α/IL-10的比率较对照组明显减少(P<0.01);WT组IFN-γ/IL-10及TNF-α/IL-10的比率亦明显低于siRNA-CAP10组(P<0.01)。结论 在新型隐球菌感染小鼠中,CAP10基因的表达与抗真菌的免疫反应有关,其下调有利于控制新型隐球菌播散,有利于Th1/Th2比率趋于平衡,在调节炎症反应方面有重要作用,有望成为新的分子治疗靶点。     

Rv0220蛋白IFN-γ释放试验对结核潜伏感染的诊断价值研究

目的 探讨Rv0220蛋白γ-干扰素(IFN-γ)释放试验(IGRA)在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)潜伏性感染中的诊断价值。方法 使用目前IGRA广泛使用的ESAT-6、CFP-10、TB7.7三种刺激抗原作为参照,用Rv0220蛋白刺激112例新疆喀什结核病防治中心(肺核医院)健康体检外周血样本,分析Rv0220蛋白在IGRA时检测结核潜伏性感染的灵敏性与特异性。结果 Rv0220蛋白在刺激IFN-γ释放水平上与ESAT-6、CFP-10、TB7.7混合抗原刺激无显著性差异,以ESAT-6、CFP-10、TB7.7混合抗原检测结果为参照,Rv0220的蛋白检测临床样本的灵敏性与特异性分别为72.73%、100%,阳性预测值为72.73%,阴性预测值为40%。结论 Rv0220抗原蛋白在人结核病外周血IFN-γ体外释放实验中可作为刺激原,对于结核潜伏性感染具有较高的诊断价值。     

减毒沙门氏菌投递的TGEV S基因疫苗口服免疫猪的动态规律

目的 研究TGEV S基因疫苗SL7207(PVAXD-TS)口服免疫仔猪后的动态免疫诱导规律。方法 将口服疫苗SL7207(PVAXD-TS)、空载体菌株SL7207(PVAXD)以1.6×10¹¹CFU/头的剂量口服接种20日龄仔猪,以PBS为空白对照,2周后以2.0×10¹¹CFU的剂量加强免疫。分别测定0、2、4、6和8周的血清IgG、IgA、TGEV中和抗体、细胞免疫反应 IL-4、IFN-γ、外周血淋巴细胞增殖情况。结果 仔猪口服免疫后第4周即可检测抗TGEV的特异性IgG和粪黏液IgA抗体;在免疫后第6周IgA、IgG、IL-4、IFN-γ抗体和外周血T淋巴细胞增殖与SL7207(PVAXD)、PBS间均存在统计学差异(P<0.01),并在第6周达到最高值;中和实验显示该疫苗诱导的血清IgG具有中和活性。结论 证实以减毒沙门菌为载体的TGEV S基因疫苗口服免疫仔猪有较好的免疫原性。     

CD4+CD25+调节性T细胞对肺结核患者特异细胞免疫的调节作用

目的　探讨调节性T细胞对结核患者特异性细胞免疫的调节作用及其在结核病发生中的意义。方法 采用免疫磁珠从健康对照和结核患者外周血单个核细胞中分离CD4⁺CD25⁺调节性T细胞,观察其对结核患者外周血免疫反应,包括细胞增殖反应和细胞因子IFN-γ及IL-10分泌的影响。结果 体外消除CD4⁺CD25⁺调节性T细胞没有显著影响健康对照PBMC对BCG抗原的增殖反应,但可以显著增强结核患者PBMC对BCG抗原的细胞增殖反应、细胞因子IFN-γ及IL-10的分泌。分离的CD4⁺CD25⁺调节性T细胞能显著抑制结核患者CD4⁺CD25^-T细胞对BCG抗原及抗-CD3的细胞增殖和细胞因子IFN-γ分泌;CD4⁺CD25⁺调节性T细胞也抑制BCG刺激的CD4⁺CD25^-T细胞IL-10的分泌,但不影响抗-CD3刺激的IL-10分泌。结论 CD4⁺CD25⁺调节性T细胞可能通过抑制结核患者特异性细胞免疫应答促进肺结核病的发生发展。     

铜绿假单胞菌二价组合DNA疫苗pOPRL+pOPRF最佳免疫剂量研究

目的 探讨铜绿假单胞菌二价组合DNA疫苗pOPRL+pOPRF在小鼠体内的最佳免疫剂量。方法 分别以25 μg, 50 μg, 100 μg和200 μg的pOPRL+pOPRF免疫BALB/c小鼠。对各剂量免疫后诱导的血清抗体水平、脾淋巴细胞增殖水平以及IFN-γ和Il-2分泌水平进行检测,强毒攻击后测定各组小鼠的存活时间及保护率。结果 100 μg和200 μg组小鼠的血清特异性抗体水平、SI值及IFN-γ和Il-2的分泌水平明显高于25 μg和50 μg组(F=8.414,P<0.05)。且三免后100 μg组小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ和Il-2的量高于200 μg组(F=6.375,P<0.05)。攻毒后25 μg、50 μg、100 μg和200 μg组的保护率分别为35%、45%、85%和70%。结论 pOPRL+pOPRF二价组合DNA的免疫效果与免疫剂量有一定的相关性,在小鼠中的最佳免疫剂量为100 μg。     

阿苯达唑联合IFN-α抗小鼠细粒棘球蚴病的实验研究

目的 在BALB/c小鼠体内评价阿苯达唑(ABZ)联合干扰素(interferon, IFN)-α对于CE的治疗效果。方法 Balb/c小鼠原头蚴腹腔继发感染5个月后,小鼠被随机分配到4组:ABZ组、IFN-α组、ABZ+IFN-α组和未经处理对照组。不同处理组分别给药2个月。在治疗的第0、7、14、28、36、48、60 d从小鼠尾静脉采血检测血清中抗体水平变化。治疗结束后处死小鼠,检测相关指标评价治疗效果。结果 与对照组(P<0.01)或ABZ组(P<0.05)相比,ABZ+IFN-α组包囊的数量、大小及重量都显著减少。对不同处理组的包囊进行透射电镜观察(TEM)发现,ABZ+IFN-α组的包囊的超微结构发生了明显的改变。ELISA实验结果表明,ABZ+IFN-α组的血清与脾细胞分泌的白细胞介素(interleukin, IL)-10显著下降(P<0.01);血清中IgE、IgG抗体及其亚型浓度与对照组相比显著降低(P<0.01)。结论 本研究证实ABZ联合IFN-α可能成是一种有效的CE治疗方案。     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白免疫小鼠效果初步评价

目的 融合表达和纯化结核分枝杆菌(MTB)CFP10-ESAT6(CE),初步评价免疫效果。方法 构建pET32a(+)-CE重组质粒,E.coli BL21(DE3)中融合表达,Ni-NTA层析纯化。用CE加铝佐剂,50 μg CE/只/次,分3次免疫BALB/c小鼠。ELISA测定血清IgG抗体;ELISpot与Luminex检测细胞因子,进行MTB体外生长抑制试验。卡介苗(BCG)为阳性对照。结果 CE免疫小鼠,能诱导产生高效价的IgG、IgG1和IgG2a,且IgG1(t=19.1,P<0.000 1)和IgG2a(t=8.7,P<0.000 1)抗体水平均高于BCG组。CE组与BCG组诱导产生的分泌IFN-γ的斑点形成细胞(SFC)数量差异无统计学意义(t=0.4, P>0.05),但诱导分泌IL-4的SFC数量高于BCG组(t=8.0, P<0.000 1)。CE组诱导分泌GM-CSF(t=8.4,P<0.05)、IL-6(t=8.3,P<0.05)、IL-10(t=2.5,P<0.05)和IL-4(t=7.0,P<0.05)均高于BCG组,而CE组诱导分泌IFN-γ(t=1.4,P>0.05)、TNF-α(t=1.8,P>0.05)、IL-2(t=2.0,P>0.05)、IL-12(t=0.9,P>0.05)和IL-17(t=1.3,P>0.05)均与BCG组相似,差异无统计学意义。CE组小鼠脾细胞的MTB体外生长抑制结-果与BCG组相似(t=0.8,P>0.05)。结论 CE免疫小鼠可诱导较强的Th1与Th2混合型免疫反应,且有较强的体外抑制MTB生长的能力,表明CE具有良好的结核疫苗研制应用价值。     

我国斑点热立克次体感染与免疫的实验研究

研究证明黑龙江立克次体能够感染人血管内皮细胞和BALB/c小鼠,引起小鼠菌血症和器官损伤;全基因组序列分析发现黑龙江立克次体毒力相关基因。表面蛋白质组分析鉴定了黑龙江立克次体和立氏立克次体的表面蛋白,用表面蛋白免疫C3H/HeN小鼠,发现某些表面蛋白为保护性抗原,并揭示这些保护性抗原均能够诱导抗原特异CD₄⁺和CD₈⁺ T细胞增殖并产生和分泌IFN-γ和/或TNF-α,以及诱导高水平特异性IgG2a产生,在这些免疫因素的协同作用下使小鼠有效抵抗立克次体感染。用黑龙江立克次体感染Tim-3高表达或低表达人血管内皮细胞以及Tim-3高表达转基因小鼠,结果有力证明Tim-3高表达能够促进人血管内皮细胞和小鼠抵抗黑龙江立克次体感染。     

布鲁氏菌Omp2b优势T-B联合抗原表位的免疫应答特点研究

目的 通过生物信息技术预测分析Omp2b蛋白的优势B细胞表位和T细胞表位,筛选T-B联合抗原表位,探讨其免疫原性和激发免疫应答的特点,为开发有效的布鲁氏菌疫苗奠定基础。方法 1)利用生物信息学软件ProtParam,SOMPA,SWISS-MODEL,Rasmol,DNAStar,SYFPEITHI和IEDB来分析Omp2b蛋白的结构,预测T细胞和B细胞的优势表位以及T-B联合表位;2)ELISPOT法检测细胞中IFN-γ阳性细胞数;3)ELISA检测布鲁氏菌病患者血清中针对Omp2b蛋白的T-B联合肽的特异性IgG抗体水平。体外培养免疫细胞,检测上清液中的穿孔素和颗粒酶B。结果 生物信息软件综合分析Omp2b蛋白并筛选出了1个T-B细胞联合抗原表位的潜在区段196-216;患者组中分泌IFN-γ细胞数(SFU)较健康对照组增高(F=25.413,P<0.01),布鲁氏菌病患者血清中的IgG抗体、穿孔素和颗粒酶B的浓度也增加(F=13.653,P<0.01)。结论 Omp2b蛋白的T-B联合抗原表位可以产生特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答,为布鲁氏菌表位疫苗的筛选与构建提供参考。     

猪带绦虫重组Bb-TSO45W-4B-TSOL18疫苗诱导仔猪免疫应答的动态观察

目的 研究猪带绦虫重组Bb-TSO45W-4B-TSOL18疫苗免疫仔猪后诱导免疫应答的动态变化。方法 将16头40 d龄健康仔猪均分为4组:重组Bb-TSO45W-4B-TSOL18疫苗组、重组Bb-TSO45W-4B疫苗组、重组Bb-TSOL18疫苗组和双歧杆菌液体培养基(MRS)对照组。各疫苗组均以1011CFU灌胃免疫,间隔2周免疫1次,共免疫2次。在免疫后0、2、4、6、8周采集仔猪前腔静脉血,分离血清和外周血淋巴细胞(PBMC)。采用ELISA法检测仔猪血清IgG、IgG1及IgG2a水平和PBMC培养上清液IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-10水平;MTT比色法检测PBMC增殖水平;FCM检测CD₄⁺和CD₈⁺T细胞亚群。结果 　各疫苗组血清IgG、IgG1、IgG2a水平均在免疫后2~8周升高,均在免疫后4周、6周、4周达较高水平;PBMC增殖水平均在免疫后2~8周升高,均在免疫后6周达较高水平CD₄⁺和CD₈⁺T细胞水平均在免疫后2~8周升高,均在免疫后8周和6周达较高水平;PBMC培养上清液IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平分别在免疫后2~6周、2~8周、4~6周和2~8周升高,分别在免疫后4周、6周、4周和8周达较高水平。各疫苗组上述指标与MRS对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05);重组Bb-TSO45W-4B-TSOL18疫苗组与重组Bb-TSO45W-4B疫苗组和重组Bb-TSOL18疫苗组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 猪带绦虫重组Bb-TSO45W-4B-TSOL18疫苗免疫仔猪可诱导产生特异性的免疫应答,且TSO45W-4B-TSOL18融合抗原疫苗组优于TSO45W-4B或TSOL18单一抗原疫苗组。     

幽门螺杆菌通过其优势蛋白组分活化肥大细胞的致病机制研究

目的 探讨幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)对人肥大细胞的活化作用,筛选出作用最强组分并评价其潜在活化效力。方法 将3种Hp全菌制剂及其30种蛋白组分(Protein components, PCs)与LAD₂肥大细胞共培养,检测其对LAD₂肥大细胞的潜在活化作用,并筛出效力最强的PC;用液相色谱-质谱串联分析方法检测优势性PC成分,用ELISA法检测其激活LAD₂肥大细胞释放炎性介质的水平。结果 3种Hp全菌制剂均有效活化LAD₂肥大细胞(P<0.05),并呈浓度依赖性;PC17具有最强的活化能力,能有效激活LAD₂肥大细胞释放组胺、TNF-α、IL-3、IFN-γ、LTB4(P<0.05),并呈浓度和时间依赖性;液相色谱-质谱分析和数据库比对揭示,PC17主要由23种蛋白组成,分子量为21~35 kDa。结论 PC17是Hp中最强的肥大细胞活化成分,其可能通过促肥大细胞释放组胺、TNF-α、IL-3、IFN-γ、LTB4,参与Hp感染相关性疾病的发病。     

Preserved ex vivo inflammatory status and cytokine responses in naturally long-lived mice

Preserved immune cell function has been reported in mice that achieve extreme longevity. Since cytokines are major modulators of immune responses, we aimed to determine the levels of 21 cytokines secreted ex vivo by peritoneal leukocytes cultured under basal- and mitogen- (conconavalin A (ConA) and LPS) stimulated conditions in middle-aged (44 ± 4 weeks), old (69 ± 4 weeks), very old (92 ± 4 weeks), and extreme long-lived (125 ± 4 weeks) ICR (CD1) female mice. The secretion of cytokines was measured by multiplex luminometry. Increased basal levels of proinflammatory IL-1β, IL-6, IL-12 (p70), IFN-γ, and TNF-α were seen in the old and very old animals, accompanied by decreased IL-10. In contrast, the extreme long-lived mice maintained the overall cytokine profile of middle-aged mice, though the basal secretion of IL-2, IL-9, IL-10, IL-13, and IL-12 (p40) was raised. Under LPS- and/or ConA-stimulated conditions, leukocytes from old and very old animals showed a significantly impaired response with respect to secretion of Th1 cytokines IL-3, IL-12p70, IFN-γ, and TNF-α; Th2 cytokines IL-6, IL-4, IL-10, and IL-13; and the regulatory cytokines IL-2, IL-5, and IL-17. Extreme long-lived mice preserved the middle-aged-like cytokine profile, with the most striking effect seen for the IL-2 response to ConA, which was minimal in the old and very old mice but increased with respect to the middle-aged level in extreme long-lived mice. Chemokine responses in regard to KC, MCP-1, MIP1β, and RANTES were more variable, though similar secretion of LPS-induced KC and MCP-1 and ConA-induced MCP-1, MIP-1β, and RANTES was found in long-lived and middle-aged mice. Thus, extreme long-lived animals showed only a minimal inflammatory profile, much lower than the old and very old groups and also lower than the middle-aged, which is likely mediated by the increase of anti-inflammatory cytokines such as IL-10. This was coupled to a robust response to immune stimuli across an appropriated Th1/Th2 and regulatory cytokine secretion, which seems to be a factor contributing to the preserved immune response reported in very long-lived animals and thus to their extended longevity.     

γ-干扰素联合抗结核药物治疗肺结核临床疗效的Meta分析

目的:系统评价γ-干扰素(IFN-γ)联合抗结核药物治疗肺结核的临床疗效和安全性,为IFN-γ在肺结核临床治疗中的应用提供依据。方法:检索PubMed、Embase、中国生物医学文献数据库、中国知网、万方数据库,纳入自建库以来至2022年3月1日公开发表的IFN-γ联合抗结核药物治疗肺结核的临床随机对照试验(RCT)研究。根据Cochrane手册,应用Review Manager 5.4 软件对纳入文献进行质量评价。应用STATA 12.0 软件对IFN-γ联合抗结核药物治疗组(观察组)和单纯抗结核药物治疗组(对照组)肺结核患者治疗2~3个月及6~9个月后痰菌阴转率、病灶吸收率、空洞闭合率及两组不良反应发生率,以及治疗后外周血CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞百分比的差异进行评价。结果:共纳入18篇文献,共计1341例患者。Meta分析结果显示,与对照组比较,观察组患者治疗2~3个月和6~9个月后,痰菌阴转率RR(95%CI)值分别为1.40(1.26~1.56)和1.41(1.12~1.76);病灶吸收率RR(95%CI)值分别为1.43(1.09~1.88)和2.84(1.65~5.00);空洞闭合率RR(95%CI)值分别为2.07(1.47~2.92)和1.56(1.28~1.91),均显著高于对照组(P值均<0.05)。此外,与对照组比较,治疗后观察组外周血CD4⁺T细胞百分比升高更明显、CD8⁺T细胞百分比降低更明显(P值均<0.05), 加权均数差(WMD;95%CI)分别为5.18(2.53~7.84)和-3.16(-6.08~-0.23)。与对照组比较,观察组不良反应发生率RR(95%CI)值为1.06(0.70~1.60),其中,肝功能异常发生率、皮肤过敏反应发生率、胃肠道不良反应发生率RR(95%CI)值分别为1.02(0.95~1.11)、1.03(0.95~1.11)和1.01(0.93~1.11),差异均无统计学意义(P值均>0.05)。结论:IFN-γ联合抗结核药物治疗肺结核,可以促进患者病灶吸收、痰菌阴转率,且能改善肺结核患者的免疫指标。