大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖与多向分化的能力

背景：生理条件下机体内多数骨髓间充质干细胞增殖并不明显,然而在一定刺激下可表现出旺盛的有丝分裂活动,具有很强的增殖倍增能力,且体外实验表明其具有多向分化潜能。 目的：进一步验证体外分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖与多向分化潜能。 方法：全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,MTT法绘制细胞生长曲线,免疫组化法对细胞表面干细胞标志CD44进行鉴定。取传至第4代细胞,分别用成骨、成软骨、成脂肪和成神经诱导剂予以培养,通过碱性磷酸酶染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色、油红O染色、NeuN抗体免疫组化染色进行分化能力鉴定。 结果与结论：分离培养的细胞呈长梭形或多边形,细胞生长曲线呈S形,群体倍增时间约为31 h,免疫细胞化学染色后CD44呈阳性表达,CD34呈阴性。第4代骨髓间充质干细胞成骨诱导2周后出现钙盐沉积,成软骨诱导培养2周后Ⅱ型胶原检测呈阳性,成脂肪诱导培养2周后在细胞的胞浆内充满大量红色脂肪滴,成神经诱导6 h后细胞出现突起,类似神经元的轴突和树突纤维,NeuN免疫组化染色呈阳性。表明体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖能力旺盛,可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元样细胞方向分化。     

杜仲叶提取物诱导羊骨髓间充质干细胞成骨及抑制其成脂肪分化

背景：传统诱导剂只具有单纯诱导成骨或成脂的分化作用，应用较为局限。杜仲叶提取物具有提高骨密度、抑制骨吸收、调节骨代谢功能的药效作用，可促进成骨细胞增殖和碱性磷酸酶分泌。 目的：探讨杜仲叶提取物诱导羊骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的同时，是否具有抑制成脂肪分化的作用。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2008-02/10在南昌大学第二附属医院分子中心实验室完成。 材料：健康12月龄羊6只，由南昌大学提供。杜仲叶提取物由江西师大生物技术公司制备。 方法：采用全骨髓法体外分离培养羊骨髓间充质干细胞，取第3代细胞，设立6组：空白对照组，加入DMEM+胎牛血清；传统成骨诱导剂组，加入含地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸的DMEM高糖培养基；传统成骨诱导剂+杜仲叶提取物组，在传统诱导剂组基础上加入10-5 g/mL杜仲叶提取物；10-4，10-5，10-6 g/mL杜仲叶提取物组分别加入对应质量浓度的杜仲叶提取物。同时另取第3代细胞行成脂肪诱导，分组同上，仅将传统成骨诱导剂更换为传统成脂诱导剂。 主要观察指标：成骨诱导后，钙钴法检测碱性磷酸酶活性，Von Kossa法观察矿化结节的形成，RT-PCR法检测成骨细胞中Cbfa1 mRNA基因的表达；成脂诱导后，油红O染色观察骨髓间充质干细胞成脂分化情况。 结果：与空白对照组比较，各成骨诱导组细胞内碱性磷酸酶合成增多，形成矿化结节，且传统成骨诱导剂+杜仲叶提取物组、10-4，10-5 g/mL杜仲叶提取物组诱导成骨情况优于传统成骨诱导剂组、10-6 g/mL杜仲叶提取物组；RT-PCR显示各成骨诱导组均能高效扩增出171 bp的Cbfa1基因转录片段，且成骨细胞中Cbfa1 mRNA表达水平差异无显著性意义（P > 0.05）。油红O染色结果显示，加入杜仲叶提取物的各成脂诱导组，其脂滴数量明显少于传统成脂诱导剂组。 结论：杜仲叶提取物能诱导体外分离纯化培养的羊骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化增殖，同时抑制其向脂肪细胞分化，实现双向调节作用。     

不同方法诱导成人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的比较

背景：骨髓间充质干细胞可以在体外通过多种诱导剂诱导分化为神经元样细胞，不同诱导剂的细胞分化率、细胞活力以及Nestin染色阳性细胞率不同。 目的：对比多种诱导剂诱导骨髓间充质干细胞分化神经元样细胞结果，探寻一种较好的诱导剂。 方法：取健康成人骨髓于无菌层流室中，加入淋巴细胞分离液离心取白膜，将细胞置于含碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、DMEM、体积分数为10%胎牛血清的培养瓶中，37 ℃ 体积分数为5%CO2培养箱中培养，传至第3代分为β-巯基乙醇+二甲基亚砜组，脑源性神经生长因子+维甲酸组，胶质细胞源性神经营养因子+维甲酸组和碱性成纤维细胞生长因子组分别加入诱导剂，观察细胞型态变化，细胞活力测定，免疫组织化学检测神经细胞标志物。 结果与结论：锥虫蓝染色比较各组细胞活力，胶质细胞源性神经营养因子+维甲酸组细胞活力最高(P < 0.05)，β-巯基乙醇+二甲基亚砜组活力最低(P < 0.05)，脑源性神经生长因子+维甲酸组与碱性成纤维细胞生长因子组细胞活力差别无显著性意义(P > 0.05)。神经细胞标志物表达，胶质细胞源性神经营养因子+维甲酸组阳性率高于其余3组(P < 0.05)。结果提示，成人骨髓间充质干细胞可以诱导分化为神经元样细胞，胶质细胞源性神经营养因子+维甲酸组细胞活力高，神经标志物表达阳性率高(P < 0.05)。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化

背景：常规诱导方法诱导的细胞生长缓慢，数量少，使用生长因子可加快诱导速度，但生长因子价格昂贵限制了它的使用。 目的：验证未加生长因子的诱导液体外诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的效率。 设计、时间及地点：对比细胞学观察，于2007-07/2008-02在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。 材料：骨髓来源自体干细胞移植治疗糖尿病患者，均征得患者同意。 方法：采用密度梯度法分离培养骨髓间充质干细胞，应用0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50 μmol/L维生素C对第3代骨髓间充质干细胞进行诱导，同时设立对照组，不加入诱导剂。 主要观察指标：相差显微镜观察骨髓间充质干细胞的形态变化，诱导后经碱性磷酸酶染色和钙结节染色观察细胞形态变化。 结果：第3代骨髓间充质干细胞在相差显微镜下呈均匀分布生长，形态为长梭形。经成骨诱导7 d后培养细胞逐渐汇合呈铺路石状，随着诱导时间的延长，局部细胞呈重叠生长，间充质逐渐堆积、间充质中矿盐沉积，形成多个结节，并逐渐融合。培养14 d可形成倒置显微镜下可见的褐色点状矿化结节中心；培养21 d形成小片状矿化结节，von Kossa法测定可见钙结节呈黑色，碱性磷酸酶活性测定为阳性。 结论：骨髓间充质干细胞易诱导分化为成骨细胞，且增殖快，成骨能力强。     

人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为神经元样细胞

背景：文献报道体外诱导骨髓间充质细胞定向分化为神经元样细胞多应用神经生长因子类多肽制剂,选择纯化学诱导剂尚不多见。 目的：建立人骨髓间充质干细胞分离培养体系,体外定向诱导人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。 方法：密度梯度离心、贴壁培养法和消化时间控制相结合分离纯化人骨髓间充质干细胞并鉴定,采用β-巯基乙醇和二甲基亚砜诱导分化为神经元样细胞,观察细胞形态,通过尼氏染色、NSE和NF-200免疫细胞化学染色对已分化的神经元样细胞进行鉴定和分化率分析。 结果与结论：分离得到的骨髓间充质干细胞为成纤维样细胞,可见多个核仁,β-巯基乙醇和二甲基亚砜诱导后,间充质干细胞分化为神经元样细胞,伸出较长轴突样和树突样突起且有分支,诱导后的神经元样细胞胞质中存在着深蓝色颗粒状的尼氏小体,NSE、NF-200免疫荧光细胞化学染色均呈阳性,阳性率分别为(85.6±6.7)%和(73.2±5.6)%。结果证实采用密度梯度离心、贴壁培养法和消化时间控制相结合能够成功分离和培养人骨髓间充质干细胞,人骨髓间充质干细胞能够在诱导剂β-巯基乙醇和二甲基亚砜的诱导下体外诱导分化为神经元样细胞。     

兔骨髓间充质干细胞体外培养定向诱导分化为软骨细胞

背景：骨髓间充质干细胞具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能。 目的：体外培养兔骨髓间充质干细胞并定向诱导分化为软骨细胞,探讨体外诱导分化为软骨的方法和条件。 方法：取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子体外培养后,取第3代细胞在培养基中添加不同质量浓度转化生长因子β1的软骨分化诱导剂,2周后倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色,RT-PCR技术检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达。 结果与结论：可以从兔骨髓中培养出骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子能明显的促进骨髓间充质干细胞增殖。经软骨诱导分化后骨髓间充质干细胞呈软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达阳性。10 μg/L的转化生长因子β1诱导成软骨分化能力最强。     

骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的超微结构改变*

背景：目前尚缺乏骨髓间充质干细胞及其诱导分化后成骨细胞超微结构特点的观察。 目的：采用全骨髓培养-贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞,诱导其向成骨细胞方向分化,利用光镜和电镜观察诱导和未诱导分化细胞的细微和超微结构特点。 设计、时间及地点：观察实验,于2007-03/2008-04在河北医科大学人体解剖教研室和白求恩国际和平医院骨科完成。 材料：成年新西兰大白兔由白求恩国际和平医院实验动物中心提供。Hitachi S-3500N型扫描电镜和Hitachi-7500型透射电镜。 方法：从新西兰大白兔髂后上嵴处抽取骨髓。经原代及传代培养后,取部分第3代细胞加入诱导剂,诱导剂为10 mmol/L β-甘油磷酸钠,10-8 mmol/L地塞米松,50 mg/L维生素C。培养2周后,诱导和未加诱导的骨髓间充质干细胞进行碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白和钙化结节检测。 主要观察指标：光镜观察骨髓间充质干细胞及其诱导分化后成骨细胞的一般形态学特征;电镜观察骨髓间充质干细胞和成骨细胞的超微结构特点。 结果：培养的第3代骨髓间充质干细胞,其碱性磷酸酶染色呈强阳性反应;钙化结节染色和骨形态发生蛋白免疫组织化学检测,均呈现阴性结果。经向成骨细胞诱导分化后,其碱性磷酸酶染色,钙化结节染色和骨形态发生蛋白免疫组织化学检测,均呈现阳性反应。光镜和扫描电镜观察显示,骨髓间充质干细胞大部分呈长梭形,少量呈星形;经向成骨细胞诱导分化后,细胞体积增大,更加饱满,似鱼群样排列。透射电镜观察显示,骨髓间充质干细胞的细胞器较丰富,向成骨细胞诱导分化后,其线粒体明显增多,出现较多的基质小泡、髓样体和空泡状结构。 结论：骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后细胞的超微结构表现为胞浆中出现增多的基质小泡、髓样体和空泡状结构。     

成人骨髓间充质干细胞培养条件优化及多向分化的能力

背景：成人骨髓中间充质干细胞数量少,要使其能够更好地应用于组织工程和细胞治疗,就必须建立成熟、简便、有效的分离培养扩增体系。 目的：建立成人骨髓间充质干细胞最佳培养方法,并观察诱导其向成脂肪、成骨及软骨细胞分化结果。 方法：分别采用密度梯度离心法和全骨髓培养法,分离培养成人骨髓间充质干细胞,通过光镜观察细胞形态,绘制生长曲线比较不同培养方法对骨髓间充质干细胞的影响;免疫荧光法鉴定表面抗原CD34、CD44和CD105的表达。不同诱导培养基诱导成人骨髓间充质干细胞,采用油红O、茜素红染色以及阿利新蓝染色检测成脂、成骨和成软骨诱导情况。 结果与结论：全骨髓培获得的骨髓间充质干细胞,其增殖能力和生长特性明显优于密度梯度离心法;细胞表面抗原CD44、CD105强阳性,CD34阴性;经过诱导培养,油红O、茜素红染色以及阿利新蓝染色均为阳性,证明全骨髓培养法获得细胞具有更强的生长增殖能力,并具有向脂肪,骨和软骨等组织多向分化的潜能。     

抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化*

背景：成骨细胞来源于骨髓中的间质干细胞,但骨髓间充质干细胞经过高度扩增后,细胞群会出现生长速率减慢等变化,并出现没有分裂倾向的扁平状细胞。 目的：进一步验证在一定诱导条件下,体外分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞的定向分化情况。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2007-03/10在南方医科大学解剖实验室完成。 材料：4周龄SD大鼠3只,由南方医科大学实验动物中心提供。成骨诱导过程所使用的抗坏血酸、地塞米松、β-甘油磷酸钠为美国 Sigma公司产品。 方法：采用密度梯度离心+贴壁筛选法体外分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,融合后用EDTA及胰蛋白酶消化,按1∶3传代培养。取生长良好的第2代骨髓间充质干细胞,调整细胞数量为1×107 L-1,分为2组：对照组加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM-LG培养基,诱导组加入成骨诱导液进行培养,成骨诱导液为含50 mg/L抗坏血酸、0.1 μmmol/L地塞米松、0.5 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、体积分数为0.1胎牛血清的DMEM-LG培养基。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞的生物学特性,成骨诱导前后细胞碱性磷酸酶活性,诱导后矿化结节的形成。 结果：刚接种的骨髓间充质干细胞呈圆形;原代培养24 h后大部分细胞贴壁生长,呈短梭形、三角形、多边形;72 h时贴壁细胞分裂增殖,逐渐呈长梭形;至第5天可见明显细胞集落形成;第9~10天细胞达80%以上融合;传代后细胞贴壁和增殖速度加快,呈有规则的方向性排列。与诱导前比较,骨髓间充质干细胞成骨诱导7 d后碱性磷酸酶活性明显提高（P < 0.05）。连续成骨诱导20 d后,诱导组可见多个散在分布的圆形不透明钙化结节,对照组未见矿化结节沉积。 结论：在抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松联合诱导下,大鼠骨髓间充质干细胞可定向分化为成骨细胞。     

脐血间充质干细胞生物学特性及其成骨成脂分化潜能

背景：对于脐血来源间充质干细胞的研究是干细胞研究领域的重点和热点,但目前国内外研究对其报道尚较少,许多方面存在争议。 目的：观察人脐血间充质干细胞的生物学特性,并探讨其向成骨、成脂肪细胞诱导分化的能力。 方法：从不同胎龄脐血中分离培养间充质干细胞;通过倒置相差显微镜及透射电镜观察细胞的形态、生长增殖情况及其超微结构;并描绘细胞生长曲线;用流式细胞仪对细胞表面标志物进行检测。分别用成骨及成脂诱导液对脐血间充质干细胞进行诱导,通过茜素红染色检测脐血间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的能力;通过油红O染色检测其向脂肪细胞诱导分化的能力。 结果与结论：倒置相差显微镜下观察脐血间充质干细胞贴壁生长,呈成纤维细胞样外观,细胞呈螺旋状排列;透射电镜观察脐血间充质干细胞细胞核大,胞核比例大,细胞器少,为低分化细胞;原代及传代培养的脐血间充质干细胞生长曲线均呈S型,第3,5代细胞增殖能力最强。流式细胞仪检测结果显示,脐血间充质干细胞均稳定表达与间充质干细胞相关的表面抗原标志物CD29,CD44和CD90等,不表达造血标志CD34和CD45。脐血间充质干细胞成骨诱导后3周时茜素红染色可检测到大量钙化基质的形成;成脂诱导3周时油红O染色可检测到胞质中脂滴的形成。提示脐血间充质干细胞的形态特征、生长增殖特点及细胞表面标志物等生物学特性与骨髓间充质干细胞相似,具有强大的生长增殖与自我更新能力。脐血间充质干细胞在体外诱导条件下可以向成骨细胞及脂肪细胞等间质组织细胞定向分化。     

大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构变化

背景：目前对骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构观察的报道甚少。 目的：采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,成骨诱导并染色鉴定,利用电镜观察诱导前后细胞超微结构变化特点。 方法：全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,成骨染色鉴定向成骨方向诱导分化,扫描电镜及透射电镜观察成骨诱导前后细胞超微结构变化。 结果与结论：培养的第3代骨髓间充质干细胞纯度高、活力强,成骨诱导后的碱性磷酸酶活性染色、钙化结节染色均呈阳性。扫描电镜及透射电镜观察显示,经向成骨细胞诱导分化后,细胞形态铺展,不规则,其线粒体、粗面内质网、空泡明显增多,表明细胞功能活跃。     

诱导分化过程中不同融合状态大鼠骨髓间充质干细胞成骨的差异

背景：诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的方案已基本成熟，但是诱导过程中影响分化效果的因素仍处于探索阶段。 目的：观察诱导时机的选择对大鼠骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的影响。 设计、时间及地点：以细胞为对象的观察实验，于2006-08/2007-01在苏州大学江苏省干细胞重点实验室完成,省级重点实验室完成。 材料：骨髓间充质干细胞来源于SD大鼠，雌雄不限，体质量150~200 g。 方法：采用Percoll淋巴细胞分离液分离培养大鼠骨髓间充质干细胞。将第3代大鼠骨髓间充质干细胞以5×107 L-1密度分组培养，诱导组分别于接种当时、细胞达50%~60%融合时、细胞达85%~95%融合时加入含地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C的成骨诱导培养基诱导。非诱导组采用普通培养基培养。 主要观察指标：诱导后7，14 ，21，28 d行钙钴染色、Von-Kossa染色、碱性磷酸酶活性检测成骨细胞能力。定期在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化及生长状况。 结果：经钙钴染色后，诱导组大部分染色的细胞呈阳性反应，胞浆中可见浅棕色至棕黑色的细胞颗粒，大多数多角形细胞呈阳性，如铺路卵石样排列，随着时间的延长，可见片状强阳性细胞，以细胞达85%~95%融合时诱导培养组数量最多，结节体积最大。非诱导组未见片状强阳性细胞。Von-Kossa 染色后可见深棕色致密结节。以细胞达85%~95%融合时诱导培养组形成结节较早，同期相比数量较其他组多。细胞内碱性磷酸酶活性检测表明经成骨诱导剂诱导后与同期非诱导组相比细胞内碱性磷酸酶活性明显提高，表现细胞成骨分化特点。 结论：初始接种密度相同的情况下，细胞间相互接触程度越高，成骨能力越强。     

脐带沃顿胶间充质干细胞的分离培养及其诱导分化

背景：骨髓是目前间充质干细胞的主要来源,但由于取材不便、细胞数量受年龄限制等原因,其应用具有一定局限性。近年来,脐带作为间充质干细胞的新来源已经得到广泛关注。 目的：探讨从人脐带沃顿胶中分离、扩增间充质干细胞的方法,鉴定其免疫表型与分化潜能。 方法：种植法分离和扩增间充质干细胞;用FasGrow培养基培养,光镜观察获得的人脐带沃顿胶间充质干细胞的形态;免疫组织化学方法检测其免疫表型;Gomori钙钴碱性磷酸酶染色、von Kossa钙结节染色、四环素荧光标记鉴定其向成骨方向分化的能力及油红O染色鉴定其向成脂肪分化的能力。 结果与结论：种植法容易从人脐带沃顿胶中获得间充质干细胞;原代培养后12~16 d达70%~80%融合,传代后可维持未分化状态并稳定增殖;细胞倍增时间为2 d左右,体外增殖达20代以上;表面标记分析显示：CD44、CD105、CD133、MHC-Ⅰ呈阳性,CD34、CD45呈阴性;体外诱导实验表明：该细胞具有体外成脂肪、成骨和神经样细胞分化的能力。     

大鼠骨髓间充质干细胞分化成脂肪细胞的定向诱导**☆

背景：研究表明骨质疏松症可能是间充质干细胞分化失衡后过多地向脂肪细胞分化所致。因此,探讨骨髓间充质干细胞成脂分化的影响因素对骨质疏松症防治具有重要意义。 目的:分析骨髓间充质干细胞在体外定向分化为脂肪细胞的适宜诱导条件。 设计、时间及地点：以细胞为对象,重复观察测量实验,于2007-10/2008-07在广东医学院药理教研室完成。 材料：1月龄SD雄性大鼠由广东医学院实验动物中心提供。 方法:无菌条件下分离大鼠股骨,密度梯度离心法与贴壁培养法相结合分离、纯化骨髓间充质干细胞并在体外进行培养。第3代骨髓间充质干细胞完全汇合后,利用内含0.1 mmoL/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、0.1 mmoL/L吲哚美辛、1 μmoL/L地塞米松、不同浓度胰岛素及胎牛血清的DMEM定向诱导骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞。 主要观察指标：①倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态特征。②油红O染色检测骨髓间充质干细胞成脂肪分化情况。 结果: ①倒置显微镜下观察,传3代后可获得均一性较高的骨髓间充质干细胞。②体积分数为0.05和0.1胎牛血清均能获得较好的成脂分化效果,胎牛血清体积分数增至0.2反而抑制骨髓间充质干细胞成脂分化（P < 0.01）。③10 mg/L胰岛素可获得较好的成脂分化效果,胰岛素质量浓度提高到20,40 mg/L并不能增加骨髓间充质干细胞的成脂分化效果（P > 0.05）。④低糖（含葡萄糖1 g/L）和高糖（含葡萄糖4.5 g/L）DMEM对骨髓间充质干细胞的成脂分化无影响（P > 0.05）。 结论：骨髓间充质干细胞经内含0.1 mmoL/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10 mg/L胰岛素、0.1 mmoL/L吲哚美辛、1 μmoL/L地塞米松、体积分数为0.1胎牛血清的DMEM分化诱导液定向诱导可获得较好的成脂分化效果。     

建立大鼠骨髓间充质干细胞稳定分离培养体系与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞作为种子细胞在组织工程等领域应用广泛,建立稳定的分离培养体系和统一鉴定标准尤为重要。 目的：以不同方法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。 设计、时间及地点：细胞学体外对比观察,于2005-08/12在暨南大学完成。 材料：SPF级3月龄SD雌性大鼠5只,由中山大学实验动物中心提供。 方法：无菌条件下分离大鼠双下肢,低糖DMEM培养液冲出骨髓,分别运用全骨髓贴壁法和密度梯度离心法体外分离骨髓间充质干细胞,利用差速贴壁原理对细胞进行纯化扩增。取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞,分别加入成骨、成脂、成软骨诱导培养基,培养14 d。 主要观察指标：倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞的生长状态,流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达,采用碱性磷酸酶染色鉴定成骨能力,以油红O染色鉴定成脂能力,以甲苯胺蓝染色鉴定成软骨能力。 结果：与密度梯度离心法相比,全骨髓贴壁法分离获得的骨髓间充质干细胞贴壁时间短,增殖快,经传代后能够纯化。第3代骨髓间充质干细胞形态单一均匀,呈典型的极性漩涡状生长,不表达造血前体细胞标志抗原CD34和白细胞标志抗原CD45,表达整合素家族成员CD29和黏附分子CD44,经诱导后碱性磷酸酶染色、油红O染色和甲苯胺蓝染色均呈阳性。 结论：采用全骨髓贴壁法可稳定获得均质性良好的大鼠骨髓间充质干细胞,效果优于密度梯度离心法。经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学、细胞表面标志物表达和多向分化能力方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为大鼠骨髓间充质干细胞。     

全骨髓贴壁并差速传代分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞：与密度梯度离心法的比较*☆

背景：目前国内外分离纯化骨髓间充质干细胞有两种主要方法：密度梯度离心法及全骨髓贴壁法,前者步骤较复杂,后者简单易操作,但纯化效果不理想。 目的：在全骨髓贴壁分离骨髓间充质干细胞基础上,并用差速传代消化法,建立大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养纯化方法。 方法：全骨髓贴壁培养法分离并差速消化传代大鼠骨髓间充质干细胞,利用间充质干细胞在消化传代过程中较其他骨髓细胞消化悬浮速度快,以及贴壁快的特点,代替密度梯度离心操作来分离纯化间充质干细胞,对其形态学特征进行观察,并与密度梯度离心法比较两种分离培养法的细胞生长增殖情况;观察碱性磷酸酶及油红染色情况,验证骨髓间充质干细胞的分化能力;检测细胞表面标记物,验证免疫特性及检测其纯度。 结果与结论：全骨髓贴壁培养法分离并差速传代大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞鉴定、成骨成脂肪培养结果显示其细胞免疫特性、纯度、分化能力与密度梯度离心法无显著差异,但细胞活力,增殖能力有明显提高。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。 目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。 方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化。 结果与结论：大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上。生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃。第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达。成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性。全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义。     

脉冲电磁场对小鼠骨髓间充质干细胞体外成骨分化的影响★

背景：间充质干细胞的增殖分化缺乏可调控性，结合适当载体后不能高效增殖分化是阻碍其进入临床的瓶颈。脉冲电磁场若能有效调控干细胞向骨源细胞分化将具有重要的临床价值。 目的：观察脉冲电磁场刺激后，小鼠骨髓间充质干细胞体外成骨分化情况。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察，于2004-05/2007-10在华中科技大学同济医学院附属普爱医院骨科实验室完成。 材料：BALB/C小鼠20只，由同济医学院实验动物中心提供。脉冲电磁场发生器由海军工程大学电机系设计与制造。 方法：无菌分离小鼠双侧股骨，Percoll密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞，再用贴壁筛选法纯化扩增。取生长良好的第3代细胞，调整细胞密度为2×107 L-1接种于6孔板，分成4组：空白对照组加入完全培养基组；脉冲电磁场组给予50 Hz、正弦波形、强度1 mT的脉冲电磁场辐射，2次/d，30 min/次，间隔12 h，共10 d；成骨诱导组加入含地塞米松、甘油磷酸钠、VitC的完全诱导培养基；脉冲电磁场+成骨诱导组给予相同的脉冲电磁场辐射后加入完全诱导培养基。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞的分化情况。 结果：碱性磷酸酶染色结果显示，干预10 d后，空白对照组为阴性；脉冲电磁场组呈弱阳性；成骨诱导组呈阳性；脉冲电磁场+成骨诱导组呈强阳性。与空白对照组比较，成骨诱导组、脉冲电磁场+成骨诱导组Ⅰ型胶原免疫组化染色吸光度值均明显升高(P < 0.05，P < 0.01)。 结论：50 Hz、正弦波形、强度1 mT脉冲电磁场干预一定时间后，能够增强小鼠骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原的表达，促进其分化成骨。     

不同年龄儿童骨髓间充质干细胞自体血清体外培养及成骨分化

背景：目前成人骨髓间充质干细胞体外培养成骨定向分化的研究较多,甚少见有不同年龄儿童骨髓间充质干细胞自体血清体外培养及成骨定向分化生物学特性差异的报道。 目的：研究不同年龄儿童骨髓间充质干细胞的自体血清体外培养条件与方法,并探讨其成骨诱导分化后的基本生物学特性。 方法：无菌条件下收集3个不同年龄组儿童骨髓悬液,分离人骨髓间充质干细胞,采用含自体血清的培养基培养;测定细胞生长曲线,采用流式细胞仪检测细胞表面抗原;取传代培养细胞,经β-甘油磷酸钠、抗坏血酸及地塞米松进行成骨诱导分化后,采用免疫组织化学法检测碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原以及钙结节形成,以评价其分化效率;倒置相差显微镜逐日观察原代、传代及诱导分化细胞的生长情况及形态学改变。 结果与结论：3组儿童培养的人骨髓间充质干细胞,经刺激培养后细胞表面抗原CD29、CD44为阳性,CD34、CD45、CD105、CD106及HLA-DR均为阴性,各组表达强度差异无显著性意义。不同年龄组儿童人骨髓间充质干细胞生长速度以及分化效率随年龄增大而减小。结果提示通过对不同年龄组儿童人骨髓间充质干细胞生长特性、表面抗原表达以及分化潜能等方面的对比研究,自体血清可作为安全有效的培养方法,且年龄越小,分化效率相对越高。     

Ⅰ型胶原修饰聚乳酸聚乙醇酸微球支架上骨髓间充质干细胞的黏附和成骨分化

背景：组织工程骨成骨功能终末细胞需要骨髓间充质干细胞在体外加以诱导或在体内以基因转染等技术加以诱导。 目的：研究Ⅰ型胶原修饰的聚乳酸聚乙醇酸微球支架上骨髓间充质干细胞黏附和成骨分化的能力。 方法：制备聚乳酸聚乙醇酸微球支架,分离纯化雌性SD大鼠骨髓间充质干细胞。将培养至第3代骨髓间充质干细胞与未经处理的聚乳酸聚乙醇酸微球及Ⅰ型胶原修饰的聚乳酸聚乙醇酸微球共同培养14 d,观察细胞在不同支架表面的黏附生长。 结果：扫描电镜及FDA-PI染色发现,骨髓间充质干细胞可在聚乳酸聚乙醇酸微球支架上生长,而与未修饰的聚乳酸聚乙醇酸微球相比骨髓间充质干细胞更容易在Ⅰ型胶原修饰的聚乳酸聚乙醇酸微球上黏附增殖。Ⅰ型胶原修饰的聚乳酸聚乙醇酸微球有利于骨髓间充质干细胞的黏附、增殖,并且有一定诱导干细胞成骨分化的能力。