成鼠骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤

目的:探讨成鼠骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的可行性。方法:实验于2004-06/2005-06在中国医科大学实验动物中心完成,选取Wistar大鼠40只,4只用于骨髓间充质干细胞的培养;细胞移植组12只,磷酸盐缓冲液组12只,空白对照组12只。首先分离、培养及通过免疫细胞化学方法鉴定骨髓间充质干细胞,传代后经5溴脱氧尿嘧啶标记,采用局部注射的方法移植于Wistar大鼠脊髓全横断损伤区,移植后第7,14,28天通过免疫组化方法检测标记的移植细胞是否存活,并通过辣根过氧化物酶示踪技术检测损伤区域的轴突是否再生。结果:①原代骨髓间充质干细胞呈圆形,迅速贴壁,伸展,重新变为梭形或扁平型细胞。②免疫细胞化学染色显示骨髓间充质干细胞表面抗原CD45呈阴性表达,CD90呈阳性表达。③成鼠骨髓间充质干细胞可由5溴脱氧尿嘧啶成功进行核标记,在采取局部注射的办法移植到损坏脊髓区域后可以检测到移植的细胞存活,光镜下5溴脱氧尿嘧啶标记的细胞呈棕黄色,以损伤区域为中心逐渐向头尾端迁移。④辣根过氧化物酶阳性反应物定位于神经元的胞浆,呈棕黄色颗粒,提示脊髓损伤处存在着轴浆运输以及轴突的再生,与对照组比较差别具有统计学意义。结论:骨髓间充质干细胞在移植后可存活于脊髓损伤区,并且促进轴突的再生。     

成鼠骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤

目的：探讨成鼠骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的可行性。 方法：实验于2004-06／2005-06在中国医科大学实验动物中心完成，选取Wistar大鼠40只，4只用于骨髓间充质干细胞的培养；细胞移植组12只，磷酸盐缓冲液组12只，空白对照组12只。首先分离、培养及通过免疫细胞化学方法鉴定骨髓间充质干细胞，传代后经5溴脱氧尿嘧啶标记，采用局部注射的方法移植于Wistar大鼠脊髓全横断损伤区，移植后第7，14，28天通过免疫组化方法检测标记的移植细胞是否存活。并通过辣根过氧化物酶示踪技术检测损伤区域的轴突是否再生。 结果：①原代骨髓间充质干细胞呈圆形，迅速贴壁，伸展，重新变为梭形或扁平型细胞。②免疫细胞化学染色显示骨髓间充质干细胞表面抗原CD45呈阴性表达，CD90呈阳性表达。③成鼠骨髓间充质干细胞可由5溴脱氧尿嘧啶成功进行核标记，在采取局部注射的办法移植到损坏脊髓区域后可以检测到移植的细胞存活，光镜下5溴脱氧尿嘧啶标记的细胞呈棕黄色，以损伤区域为中心逐渐向头尾端迁移。④辣根过氧化物酶阳性反应物定位于神经元的胞浆，呈棕黄色颗粒，提示脊髓损伤处存在着轴浆运输以及轴突的再生，与对照组比较差别具有统计学意义。 结论：骨髓间充质干细胞在移植后可存活于脊髓损伤区，并且促进轴突的再生。     

骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后生长相关蛋白43基因表达的影响

目的:分析骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后生长相关蛋白43表达的影响。方法:实验于2002-06/2003-06在中国医科大学实验动物中心完成。选取3月龄Wistar大鼠64只,随机选取4只大鼠作骨髓间充质细胞的分离与培养。其余60只随机分成3组:细胞移植组(n=24),磷酸盐缓冲液组(n=24),空白对照组(n=12)。骨髓间充质干细胞提取自成鼠的股骨骨髓,经过培养、鉴定及传代,细胞传3代,待细胞大约长至50%汇合时,吸弃培养基,置于37℃,体积分数为0.05的CO2培养箱中培育30min,调整细胞密度以备移植。将大鼠麻醉后,无菌条件下用改良Allen打击装置,制作大鼠脊髓损伤动物模型,脊髓损伤后第7天,细胞移植组以微量注射器缓慢注入含间充质干细胞(106/mL)的培养液5μL,磷酸盐缓冲液组注入等量磷酸盐缓冲液5μL,空白对照组未制作脊髓损伤,分别于移植术后1、3、5d以及术后7、14、28d麻醉处死大鼠,细胞移植组与磷酸盐缓冲液组取出损伤节段的脊髓(4只/时点),空白对照组于同一节段取出相应脊髓(2只/时点)。应用反转录-聚合酶链反应和免疫组化法观察间充质干细胞移植后大鼠脊髓损伤区生长相关蛋白43基因表达的变化。结果:各组实验动物均全部进入结果分析,无脱落。①生长相关蛋白43mRNA的表达:生长相关蛋白43mRNA在正常大鼠脊髓组织中呈弱表达。间充质干细胞移植术后第1、3、7天时间点,细胞移植组生长相关蛋白43mRNA逐渐增高表达,与磷酸盐缓冲液组比较差别有统计学意义(P<0.05)。②生长相关蛋白43的表达:生长相关蛋白43在正常大鼠脊髓组织中有一定表达,间充质干细胞移植术后第7、14、28天,细胞移植组生长相关蛋白43持续高水平表达,与磷酸盐缓冲液组比较差别有统计学意义(P<0.05)。结论:间充质干细胞在移植后通过上调生长相关蛋白43基因的表达从而促进轴突的再生,可能是治疗脊髓损伤的重要机制。     

骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后生长相关蛋白43基因表达的影响

目的：分析骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后生长相关蛋白43表达的影响。 方法：实验于2002—06／2003—06在中国医科大学实验动物中心完成。选取3月龄Wistar大鼠64只，随机选取4只大鼠作骨髓间充质细胞的分离与培养。其余60只随机分成3组：细胞移植组（n=24），磷酸盐缓冲液组（n=24），空白对照组（n=12）。骨髓间充质干细胞提取自成鼠的股骨骨髓，经过培养、鉴定及传代，细胞传3代，待细胞大约长至50％汇合时，吸弃培养基，置于37℃，体积分数为0．05的CO2培养箱中培育30min，调整细胞密度以备移植。将大鼠麻醉后，无菌条件下用改良Allen打击装置，制作大鼠脊髓损伤动物模型，脊髓损伤后第7天，细胞移植组以微量注射器缓慢注入含间充质干细胞（106／mL）的培养液5μL，磷酸盐缓冲液组注入等量磷酸盐缓冲液5μL，空白对照组未制作脊髓损伤，分别于移植术后1、3、5d以及术后7、14、28d麻醉处死大鼠，细胞移植组与磷酸盐缓冲液组取出损伤节段的脊髓（4只／时点），空白对照组于同一节段取出相应脊髓（2只／时点）。应用反转录一聚合酶链反应和免疫组化法观察间充质干细胞移植后大鼠脊髓损伤区生长相关蛋白43基因表达的变化。 结果：各组实验动物均全部进入结果分析，无脱落。①生长相关蛋白43mRNA的表达：生长相关蛋白43mRNA在正常大鼠脊髓组织中呈弱表达。间充质干细胞移植术后第1、3、7天时间点，细胞移植组生长相关蛋白43mRNA逐渐增高表达，与磷酸盐缓冲液组比较差别有统计学意义俨〈0．05）。②生长相关蛋白43的表达：生长相关蛋白43在正常大鼠脊髓组织中有一定表达，间充质干细胞移植术后第7、14、28天，细胞移植组生长相关蛋白43持续高水平表达，与磷酸盐缓冲液组比较差别有统计学意义（P〈0．05）。 结论：间充质干细胞在移植后通过上调生长相关蛋白43基因的表达从而促进轴突的再生，可能是治疗脊髓损伤的重要机制。     

骨髓间充质干细胞移植促进脑缺血性损伤大鼠神经细胞黏附分子的表达

背景:骨髓间充质干细胞移植能促进神经功能修复,其作用机制可能与上调神经细胞黏附分子有关。目的:观察骨髓间充质干细胞移植对急性脑缺血损伤大鼠神经细胞黏附分子表达的影响。方法:将SD大鼠按随机数字表法分为假手术组和模型组。模型组大鼠采用线栓法制作大脑中动脉阻塞模型,再随机分为细胞移植组(左侧侧脑室移植同种异体骨髓间充质干细胞5×105)和对照组(移植磷酸盐缓冲液)。假手术组不闭塞大脑中动脉也不移植。结果与结论:移植后7,14d,细胞移植组与对照组梗死灶周围神经细胞黏附分子表达高于假手术组(P<0.01),且细胞移植组高于对照组(P<0.05)。移植后14d,细胞移植组神经功能缺损评分明显低于对照组(P<0.05)。说明骨髓间充质干细胞移植后通过上调局灶性脑缺血大鼠脑梗死灶周神经细胞黏附分子表达促进神经功能的恢复。     

5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的特点及可行性

背景:骨髓干细胞移植成功的定性指标是标记移植的细胞至组织器官后存活并发挥了正常的功能。目前细胞学研究方面采用的标记方法有酶联标记、氚胸腺嘧啶核苷标记、荧光标记和5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记等。目的:观察5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的特点。设计:单一样本观察。单位:华北煤炭医学院附属医院心胸外科。材料:实验于2003-07/2004-12在华北煤炭医学院中心实验室完成。取月龄3个月的日本大耳白兔6只,雌雄不限,体质量(3.00±0.25)kg。方法:①利用密度为1073g/L的Percoll分离骨髓的单核细胞,以含体积分数为0.1的胎牛血清的低糖Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基培养与扩增间充质干细胞,纯度可达95%左右。②用5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞24,48,72,96h后的检测标记率(标记组);阴性对照为未经5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞;空白对照为以磷酸盐缓冲液或正常鼠血清替代一抗。主要观察指标:①3组各检测200个细胞,并在不同时间点观察。②5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记的骨髓间充质干细胞免疫组织化学染色结果及细胞计数结果。结果:①标记组均见5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞,5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性反应物位于细胞核,呈棕色、颗粒状或弥漫性分布;对照组未见阳性细胞。②标记组24,48,72,96h5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞的数目分别为48±2,100±4,173±2,178±3,随着标记时间的延长,标记率逐渐增高,标记72h后标记率在85%以上。③阴性对照和空白对照组各时间点均为0。结论:①用5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的最佳时间是72h。②标记后检测的敏感性好,在低倍镜中亦可见,适合于大块组织的定量研究。③结果表明5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞是可行的。     

骨髓间充质干细胞移植大鼠脊髓损伤区脑源性神经营养因子的表达

目的:观察脊髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后脑源性神经营养因子表达的影响。方法:实验于2002-06/2003-06在中国医科大学实验动物中心完成。选取3月龄Wistar大鼠64只,随机选4只大鼠取股骨骨髓作骨髓间充质细胞的分离与培养,经过培养、鉴定及传代。其余60只大鼠分成3组制作脊髓横断损伤模型。细胞移植24只,磷酸盐缓冲液组24只,空白对照12只。脊髓损伤后第7天,在无菌条件下,细胞移植组以微量注射器缓慢注入含骨髓间充质干细胞(106/mL)的培养液5μL,磷酸盐缓冲液组注射注入等量磷酸盐缓冲液5μL,对照组未制作脊髓损伤。分别于术后7d、14d、28d麻醉下行心脏灌流固定取T10节段脊髓,细胞移植组与磷酸盐缓冲液组取出损伤节段的脊髓(8只/时点),空白对照组于同一节段取出相应脊髓(4只/时点)。应用免疫组化法观察间充质干细胞移植后,大鼠脊髓损伤区脑源性神经营养因子的表达变化。结果:所有实验动物均全部进入结果分析,术后感染5只,均予补足。①原代间充质干细胞培养:细胞接种24h后贴壁生长,72h细胞增殖,有细胞团形成,在传代过程中,4代以前的细胞倍增时间为4～6d,至10代以后细胞增殖能力有所减弱,胞体变得扁平,若加入碱性成纤维细胞生长因子,则可维持其增殖能力和形态。②脑源性神经营养因子在正常大鼠脊髓组织中有一定表达,移植术后第7天,第14天及第28天,细胞移植组脑源性神经营养因子均高水平表达,与磷酸缓冲液组相比较差别明显。结论:骨髓间充质干细胞移植后可能通过上调脑源性神经营养因子的表达从而促进脊髓损伤区神经元轴突的再生。     

骨髓间充质干细胞移植大鼠脊髓损伤区脑源性神经营养因子的表达

目的：观察脊髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后脑源性神经营养因子表达的影响。 方法：实验于2002-06／2003-06在中国医科大学实验动物中心完成。选取3月龄Wistar大鼠64只，随机选4只大鼠取股骨骨髓作骨髓间充质细胞的分离与培养，经过培养、鉴定及传代。其余60只大鼠分成3组制作脊髓横断损伤模型。细胞移植24只，磷酸盐缓冲液组24只，空白对照12只。脊髓损伤后第7天，在无菌条件下，细胞移植组以微量注射器缓慢注入含骨髓间充质干细胞（106／mL）的培养液5μL，磷酸盐缓冲液组注射注入等量磷酸盐缓冲液5μL，对照组未制作脊髓损伤。分别于术后7d、14d、28d麻醉下行心脏灌流固定取T10节段脊髓，细胞移植组与磷酸盐缓冲液组取出损伤节段的脊髓（8只／时点），空白对照组于同一节段取出相应脊髓（4只／时点）。应用免疫组化法观察间充质干细胞移植后，大鼠脊髓损伤区脑源性神经营养因子的表达变化。 结果：所有实验动物均全部进入结果分析，术后感染5只，均予补足。①原代问充质干细胞培养：细胞接种24h后贴壁生长，72h细胞增殖，有细胞团形成，在传代过程中，4代以前的细胞倍增时间为4-6d，至10代以后细胞增殖能力有所减弱，胞体变得扁平，若加入碱性成纤维细胞生长因子．则可维持其增殖能力和形态。②脑源性神经营养因子在正常大鼠脊髓组织中有一定表达，移植术后第7天，第14天及第28天，细胞移植组脑源性神经营养因子均高水平表达，与磷酸缓冲液组相比较差别明显。 结论：骨髓间充质干细胞移植后可能通过上调脑源性神经营养因子的表达从而促进脊髓损伤区神经元轴突的再生。     

大鼠骨髓间充质干细胞和许旺细胞联合移植治疗脊髓损伤

目的:骨髓间充质干细胞和许旺细胞作为脊髓组织工程学的两个重要的种子细胞,均可进行自体移植,具有其他种子细胞无以比拟的优势.应用联合细胞移植治疗大鼠脊髓半横切模型,观察其疗效.方法:实验于2007-03/12在辽宁医学院科学实验中心完成.①实验材料:清洁级健康成年SD雄性大鼠60只,体质量250～300 g ,由辽宁医学院实验动物中心提供.将大鼠按随机数字表法分为3组:联合细胞组、骨髓间充质干细胞组、磷酸盐缓冲液组,每组20只.实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:采用全骨髓培养法制备大鼠骨髓间充质干细胞,混合酶消化法制备大鼠许旺细胞.制作大鼠右侧T10脊髓半横切模型,联合细胞组注射骨髓间充质干细胞和许旺细胞,骨髓间充质干细胞组注射骨髓间充质干细胞,磷酸盐缓冲液组注射磷酸盐缓冲液.③实验评估:术后4周行网格及斜板实验,并检测大鼠损伤区脊髓诱发电位波幅及潜伏期,并行苏木精-伊红染色、免疫组织化学染色观察.结果:纳入大鼠60只,每组术后各2只因腹胀及感染死亡,进入结果分析54只. ①网格实验及斜板实验均显示,联合细胞组大鼠恢复情况明显优于其他两组(P < 0.01),骨髓间充质干细胞组优于磷酸盐缓冲液组(P < 0.01).②神经电生理检测显示,联合细胞组诱发电位波幅比其他两组高(P < 0.01),诱发电位潜伏期比其他两组短(P < 0.01),骨髓间充质干细胞组优于磷酸盐缓冲液组(P < 0.01).③联合细胞组囊性病变区面积最小,其次是骨髓间充质干细胞组,磷酸盐缓冲液组囊性变区面积最大(P < 0.01).④联合细胞组损伤侧灰质内神经元样细胞数多于其他两组(P < 0.01).结论:骨髓间充质干细胞和许旺细胞可以联合移植,在体内存活良好,并互相协同促进损伤脊髓恢复,比单一细胞移植疗效更佳.     

5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的特点及可行性

背景：骨髓干细胞移植成功的定性指标是标记移植的细胞至组织器官后存活并发挥了正常的功能。目前细胞学研究方面采用的标记方法有酶联标记、氚胸腺嘧啶核苷标记、荧光标记和5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记等。目的：观察5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的特点。设计：单一样本观察。单位：华北煤炭医学院附属医院心胸外科。材料：实验于2003-07／2004-12在华北煤炭医学院中心实验室完成。取月龄3个月的日本大耳白兔6只，雌雄不限，体质量（3．00&;#177;0．25）kg。方法：①利用密度为1073g／L的Percoll分离骨髓的单核细胞，以含体积分数为0．1的胎牛血清的低糖Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基培养与扩增间充质干细胞，纯度可达95％左右。②用5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞24，48，72，96h后的检测标记率（标记组）；阴性对照为未经5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞；空白对照为以磷酸盐缓冲液或正常鼠血清替代一抗。主要观察指标：①3组各检测200个细胞，并在不同时间点观察。②5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记的骨髓间充质干细胞免疫组织化学染色结果及细胞计数结果：结果：①标记组均见5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞，5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性反应物位于细胞核，呈棕色、颗粒状或弥漫性分布：对照组未见阳性细胞。②标记组24，48，72，96h5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞的数目分别为48&;#177;2，100&;#177;4，173&;#177;2，178&;#177;3．随着标记时间的延长，标记率逐渐增高，标记72h后标记率在85％以上。③阴性对照和空白对照组各时间点均为0。结论：①用5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的最佳时间是72h。②标记后检测的敏感性好．在低倍镜中亦可见．适合于大块组织的定量研究。③结果表明5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞是可行的。