干扰素诱导蛋白p204对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响及其机制

目的: 研究干扰素诱导蛋白p204对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响并探讨其可能的机制。方法: 应用干扰素α(IFN-α)和p204基因(Ifi204)的小干扰RNA(siRNA)瞬时干预体外培养的VSMCs,用MTT法测定细胞活力反映细胞增殖,流式细胞术分析细胞周期,用实时 qRT-PCR法和Western blotting 分别检测mRNA和蛋白表达。结果: IFN-α可诱导大鼠VSMCs p204 mRNA和蛋白表达上调,抑制VSMCs细胞活力和细胞周期G₁/S转换,伴Ras蛋白表达减少,Raf和ERK磷酸化水平下降。转染Ifi204 siRNA可抑制p204表达,提高VSMCs细胞活力和促进细胞周期G₁/S转换,伴Ras蛋白表达增多,Raf和ERK磷酸化水平升高。结论: p204表达可抑制鼠VSMCs的增殖,该效应可能与p204抑制Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的激活有关。     

干扰素诱导蛋白16对人脑血管外膜成纤维细胞增殖与迁移的影响及其机制

 目的：研究干扰素诱导蛋白16(IFI16)对人脑血管外膜成纤维细胞（HBVAFs）增殖与迁移的影响及其可能机制。方法：在HBVAFs中转染针对IFI16基因的小分子干扰 RNA (siRNA) 48 h后, 用2×106 U/L 干扰素-α（IFN-α）处理转染IFI16 siRNA细胞24 h。流式细胞术测定细胞周期,细胞划线法与Transwell法测定细胞迁移能力。应用 real-time PCR法和蛋白免疫印迹 (Western blotting) 法分别测定细胞中 IFI16、p53及p21 mRNA和蛋白表达水平的变化。结果：转染IFI16 siRNA后,HBVAFs中IFI16、p53及p21 mRNA和蛋白表达水平下调,增加了细胞G1/S期转换。IFN-α可诱导HBVAFs中IFI16、p53及p21mRNA和蛋白表达水平上调,同时抑制细胞G1/S期转换与细胞迁移,但在转染了IFI16 siRNA的HBVAFs中IFN-α的上述作用受到抑制。结论：IFI16表达可以抑制HBVAFs增殖和迁移,其机制可能与激活p53和p21的表达有关。     

转染携带Ifi204基因的慢病毒上调大鼠主动脉成纤维细胞的p204表达

目的观察转染携带Ifi204基因的慢病毒对大鼠血管外膜成纤维细胞p204表达的影响。方法培养大鼠主动脉外膜成纤维细胞(VAF),免疫细胞化学鉴定细胞类型及纯度。用携带Ifi204基因的慢病毒载体系统转染体外培养的大鼠成纤维细胞(Ifi204组),分别以空载慢病毒处理和未处理的大鼠成纤维细胞作为对照组(C组)和空白组(N组)。用q-PCR技术和Western blot检测细胞中p204 mRNA和蛋白表达。结果 p204在N组存在结构表达。与N组和C组比较,Ifi204组的p204 mRNA及蛋白表达均上调(P<0.01)。结论转染携带Ifi204基因的慢病毒可上调大鼠VAF的p204表达。     

IFNα通过p204抑制大鼠主动脉外膜成纤维细胞增殖

目的 研究干扰素诱导蛋白p204在大鼠主动脉血管外膜成纤维细胞(VAF)的基础表达,α干扰素(IFNα)对VAF细胞增殖及p204表达的影响.方法 用免疫组织化学及免疫细胞化学观察p204蛋白的表达及分布;用Westem blot及RT-PCR检测p204蛋白及Ifi204 mRNA表达;用MTT法检测VAF细胞增殖.结果 p204在大鼠主动脉血管外膜染色阳性,p204在鼠VAF细胞同时表达于胞质及胞核,以胞核表达更明显.应用1×106 IU/L的IFNα刺激VAF细胞6h以上即可诱导Ifi204 mRNA大量表达,IFNα作用24 h以上时p204蛋白大量表达.IFNα呈浓度依赖性抑制VAF细胞增殖,A value值由对照组的0.727±0.090逐渐降至4×106 IU/L IFNα时的0.652±0.066及8×106 IU/L IFNα时的0.587±0.043,伴随着p204表达相应增加(P＜0.05).结论 p204在大鼠主动脉VAF存在基础表达,其在VAF上表达并不局限于胞核,易被IFNα诱导其mRNA及蛋白表达上调;IFNα抑制VAF细胞增殖的作用可能部分与其诱导p204表达有关.     

干扰素α通过P204和P21诱导大鼠原代血管平滑肌细胞凋亡

目的 探讨干扰素-α(IFN-α)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)凋亡的影响.方法 应用转染IFI204 siRNA和/或IFN-α瞬时干预体外培养的大鼠VSMCs,以非特异性siRNA转染组为对照组,RT-PCR法检测P204及P21mRNA表达,Western blot检测P204及P21蛋白表达,流式细胞仪Annexin-V FITC/PI法检测细胞凋亡.结果 与对照组比较,IFN-α组P204 mRNA和蛋白表达上调(P＜0.01),细胞凋亡增多(P＜0.01),伴P21 mRNA和蛋白表达增多(P＜0.01);IFI204 siRNA转染组P204 mRNA和蛋白表达下调(P＜0.01),细胞凋亡减少(P＜0.01),P21mRNA和蛋白表达减少(P＜0.01);转染IFI204 siRNA后再加IFN-α干预,P204 mRNA及蛋白表达下调(P＜0.01),但P21 mRNA及蛋白表达增多(P＜0.01),促进细胞凋亡(P＜0.01).结论 P204及P21参与IFN-α诱导大鼠VSMCs凋亡过程的调控.     

人Gax基因转染对血管平滑肌细胞增殖、迁移和细胞周期的影响

目的: 探讨腺病毒介导人生长终止特异性同源异型盒基因(hGax基因)转染对血清刺激后兔血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖、迁移和细胞周期的影响,为静脉桥再狭窄基因治疗新策略提供帮助。方法: 构建含 hGax 的重组腺病毒载体并感染兔VSMCs;应用RT-PCR、免疫荧光染色检测hGax mRNA和蛋白的表达; MTT法观察hGax基因过表达对血清刺激后VSMCs增殖的影响;划痕法测定细胞迁移;流式分析细胞周期。结果: 成功构建Ad5-hGax重组腺病毒载体。转染48 h后 RT-PCR和免疫荧光染色法示转染 hGax 基因的VSMCs中存在目的基因特异性片段(174 bp)和目的蛋白表达;MTT法示hGax蛋白显著抑制血清刺激后VSMCs增殖;划痕法示hGax基因过表达明显抑制血清刺激后VSMCs迁移;流式结果示血清刺激72 h后,Ad5-hGax转染组G₀/G₁期细胞比例明显增加,G₂/M+S期细胞减少。结论: 含hGax的重组腺病毒载体构建成功,并在细胞中过表达。hGax基因过表达能有效抑制血清刺激后兔VSMCs的增殖和迁移,并使细胞停滞于G₀/G₁期。     

IL-32γ对大鼠血管平滑肌细胞增殖与细胞周期的影响

目的: 观察白细胞介素-32γ(IL-32γ)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖与细胞周期的影响及机制。方法: 采用组织贴块法体外培养大鼠VSMCs并以IL-32γ处理。应用MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期;免疫印迹方法检测cyclin D1和核内NF-κB p65蛋白含量;免疫细胞化学染色法检测增殖细胞核抗原(PCNA)表达的变化。结果: 不同浓度(10~50 μg/L)的IL-32γ在24~48 h范围内,浓度和时间依赖性促进VSMCs增殖;50 μg/L的IL-32γ作用VSMCs 24 h后促进了细胞周期由G₁期向S期,进而G₂/M期转化,同时上调NF-κB p65、cyclin D1和PCNA蛋白的表达水平;应用NF-κB抑制剂PDTC能逆转上述效应。结论: IL-32γ能促进大鼠VSMCs增殖和加速细胞周期转化。上调NF-κB p65和cyclin D1的表达可能是其作用机制之一。     

辛伐他汀抑制胎牛血清及PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞增殖及对抑癌基因PTEN表达的影响

目的:观察辛伐他汀(simvastatin)对血清及血小板源生长因子(PDGF-BB)诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的抑制作用及simvastatin对细胞周期和G₁/S周期转换重要调节基因PTEN蛋白表达的影响。方法:[³H]-胸腺嘧啶核苷酸掺入测定VSMCsDNA合成,流式细胞仪检测细胞周期情况,Western印迹杂交法检测PTEN蛋白表达。结果:Simvastatin以剂量依赖关系抑制血清及PDGF-BB诱导的VSMCs[³H]-胸腺嘧啶核苷酸掺入,使G₀/G₁期细胞比例明显增多,S期细胞比例显著减少,并上调PTEN蛋白表达,而3羟3甲戊二酰辅酶A代谢产物甲羟戊酸能抑制simvastatin上调PTEN的表达。结论:Simvastatin抑制血清及PDGF-BB诱导的VSMCs增殖阻滞细胞周期可能与上调PTEN表达有关,且simvastatin调节PTEN的表达可能通过抑制甲羟戊酸的合成而实现。     

HIF-1α基因沉默对大鼠肝癌CBRH-7919细胞p27和Ki67表达的影响

目的: 探讨沉默缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)基因对大鼠肝癌CBRH-7919细胞在缺氧状态下p27和Ki67表达的影响。方法: 选用大鼠肝癌细胞株CBRH-7919作为研究对象,利用氯化钻(CoCl₂)模拟缺氧状态。构建HIF-1α siRNA特异性载体,利用小分子RNA干扰技术沉默肝癌细胞HIF-1α基因。应用real-time RT-PCR和Western blotting方法分别检测肝癌细胞HIF-1α mRNA和蛋白的表达变化,用Western blotting方法检测肝癌细胞 p27和Ki67 蛋白的表达变化。应用流式细胞术检测细胞周期的变化。结果: 在缺氧条件下,肝癌细胞HIF-1α mRNA及蛋白表达显著增多(P<0.05)。HIF-1α基因被沉默后,HIF-1α mRNA和蛋白表达以及Ki67蛋白表达量明显减少(P<0.05),p27蛋白表达量显著增多(P<0.05)。转染组G₀/G₁期的肝癌细胞数量明显多于对照组,S期细胞显著减少(P<0.05)。 结论: 缺氧可以诱导肝癌细胞HIF-1α的表达;特异性siRNA沉默HIF-1α,可能通过促进p27的表达和抑制Ki67的表达,在一定程度上抑制了肝癌细胞的增殖。     

不同H5N1亚型高致病性禽流感病毒诱导IFN-α/β和MxA mRNA表达

目的: 用两株鹅源H5N1禽流感病毒(AIV)接种A549细胞,比较两毒株在细胞中的增殖情况,以及病毒诱导细胞干扰素(INF)-α/β和黏病毒抗性蛋白A(MxA) mRNA表达的情况。方法: 将两组病毒悬液接种A549细胞,按Reed-Muench法计算两毒株的组织培养半数感染量(TCID₅₀),PCR扩增检测细胞中病毒的HA和M1片段。Real-time PCR方法检测细胞中IFN-α/β和MxA mRNA表达。结果: 两株病毒均能感染A549细胞, AIV128诱导细胞的IFN-α/β和MxA mRNA表达均较AIV75高。结论: H5N1亚型AIV75和AIV128毒株能在人肺泡癌上皮细胞A549中复制,细胞IFN-α/β和MxA mRNA的表达诱导依赖于病毒的复制。     

咪达唑仑通过下调p300抑制人咽鳞癌FaDu细胞增殖

 目的：探讨咪达唑仑（midazolam）抑制人咽鳞癌FaDu细胞增殖的机制。方法：咪达唑仑处理FaDu细胞后， MTT及BrdU掺入比色法检测细胞增殖情况，RT-PCR及Western blotting检测p300 mRNA及蛋白水平；沉默p300后，MTT比色法及BrdU掺入法检测细胞增殖情况，Western blotting 检测细胞周期相关蛋白的表达水平。结果：咪达唑仑抑制FaDu细胞增殖；咪达唑仑抑制p300表达； 沉默p300后p21及p27表达上调，p-Rb表达下调FaDu细胞增殖被抑制。结论: 咪达唑仑通过下调p300抑制人咽鳞癌FaDu细胞增殖。     

siRNA沉默WT1对小鼠足细胞Wnt/β-catenin和nephrin表达的影响

 目的:研究小干扰RNA(siRNA) 干扰WT1基因表达的小鼠足细胞Wnt/β-catenin信号通路的变化及其对足细胞活力和nephrin表达的影响。方法:采用RPMI-1640培养基在33 ℃条件下传代培养足细胞,在37 ℃条件下诱导足细胞分化。应用WT1基因的siRNA转染分化成熟的小鼠足细胞,用MTT法测定细胞活力,用实时qRT-PCR和Western blotting技术分别检测mRNA和蛋白的表达。结果:RNA干扰WT1可诱导小鼠足细胞Wnt1 mRNA和蛋白表达上调,p-β-catenin水平降低及足细胞活力下降,伴有足细胞nephrin mRNA和蛋白的表达明显下调。结论: 沉默WT1基因的表达可诱导足细胞活力下降和nephrin表达下调,可能与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。     

Resveratrol inhibits angiotensin II-induced ERK1/2 activation by downregulating quinone reductase 2 in rat vascular smooth muscle cells

Our previous studies showed that resveratrol could inhibit the proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) and repress mRNA and protein expression of quinone reductase 2 (NQO2).This study further explored the potential mechanisms whereby resveratrol inhibits the proliferation of rat VSMCs.Lentiviral vectors that incorporated NQO2 small interfering RNA (siRNA) were constructed and transduced into rat VSMCs.The cell proliferation was detected using the bromodeoxyuridine (BrdU) assay.Cultured rat VSMCs were stimulated with angiotensin II and the level of reactive oxygen species (ROS) was measured using a ROS assay kit.A realtime quantitative PCR was used to detect NQO2 mRNA levels.Extracellular signal-regulated kinase (ERK1/2) and NQO2 protein expression were determined by Western blotting analysis.The inhibitory effect of resveratrol (10 and 50 μmol/L) on the proliferation of rat VSMCs in the NQO2 siRNA group was significantly weaker than that in the normal and scrambled siRNA group (P < 0.01).The ROS level in the NQO2 siRNA and resveratrol (50 μmol/L) treatment groups were lower than that in the normal and scrambled siRNA groups (P < 0.01 in both).Compared with the normal and scrambled siRNA group,the phosphorylation of ERK1/2 was significantly decreased in the NQO2 siRNA and resveratrol (50 μmol/L) treatment group (P < 0.01 in both).In conclusion,high concentration of resveratrol inhibits angiotensin II-induced ERK1/2 phosphorylation and subsequent proliferation by down-regulation of NQO2 in cultured rat VSMCs.     

Cell type and gender-dependent differential regulation of the p202 and Aim2 proteins: implications for the regulation of innate immune responses in SLE

Upon sensing cytosolic double-stranded DNA (dsDNA), the murine Aim2 (encoded by the Aim2 gene) protein forms an inflammasome and promotes the secretion of proinflammatory cytokines, such as IL-1β and IL-18. In contrast, the p202 protein (encoded by the Ifi202 gene) does not form an inflammasome. Previously, we have reported that the interferon (IFN) and female sex hormone-induced increased nuclear levels of p202 protein in immune cells are associated with increased susceptibility to develop a lupus-like disease. However, signaling pathways that regulate the expression of Aim2 protein remain unknown. Here we report that the expression of Aim2 gene is induced in bone marrow-derived macrophages (BMDMs) by IFN-α treatment and the expression is, in part, STAT1-dependent. However, treatment of splenic T or B cells with IFN-α or their stimulation, which induced the expression of Ifi202 gene, did not induce the expression of Aim2 gene. Furthermore, treatment of cells with the male hormone androgen increased levels of Aim2 mRNA and protein. Moreover, treatment of murine macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with IFN-α differentially induced the expression of Aim2 and p202 proteins and regulated their sub-cellular localization. Additionally, activation of Toll-like receptors (TLR3, 4, and 9) in BMDMs and cell lines also differentially regulated the expression of Aim2 and Ifi202 genes. Our observations demonstrate that cell type and gender-dependent factors differentially regulate the expression of the Aim2 and p202 proteins, thus, suggesting opposing roles for these two proteins in innate immune responses in lupus disease.     

胰岛素通过活性氧的产生促进VEGF表达及血管平滑肌细胞迁移和增殖

 目的:探讨活性氧（reactive oxygen species, ROS）在胰岛素促进的血管平滑肌细胞迁移和增殖中的作用及分子机制。方法:采用原代培养的大鼠主动脉血管平滑肌细胞,应用DCF-DA荧光探针检测细胞内ROS的生成;应用实时定量PCR、Western blotting和ELISA法检测mRNA和蛋白的表达;应用转染报告基因的方法检测基因的转录活性;划痕法测定细胞迁移;CCK-8法测定细胞增殖。结果:胰岛素处理后血管平滑肌细胞内ROS产生明显增加。过氧化氢酶和NADPH氧化酶抑制剂二亚苯基碘鎓（DPI）明显抑制胰岛素促进的ROS生成及p-Akt、p-p70S6K1和p-ERK1/2蛋白的表达。过氧化氢酶和DPI明显降低胰岛素促进的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的mRNA和蛋白表达及转录激活。抑制ROS产生明显抑制胰岛素刺激的血管平滑肌细胞迁移和增殖。结论: 胰岛素通过NADPH氧化酶途径促进血管平滑肌细胞ROS产生。ROS介导了胰岛素促进的Akt/p70S6K1和ERK信号通路的激活、VEGF表达及血管平滑肌细胞的迁移和增殖。