日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因克隆及特性鉴定

[目的 ]探索研制血吸虫病疫苗的新路径 ,对日本血吸虫线粒体相关蛋白进行基因克隆及特性鉴定。[方法 ]分析本室筛选日本血吸虫成虫cDNA文库获得的 1个cDNA片段 (Sj338 2 4)的开读框序列 ,在其上下游分别设计引物A和B ,并以该cDNA片段为模板进行PCR扩增后 ,将该片段重组于pGEM T中并进行DNA测序鉴定及检索。再经酶切后将该基因片段亚克隆入表达载体pGEX 6P 1,并进行蛋白表达、纯化及抗原性鉴定。 [结果 ]该目的基因PCR产物全长共 487bp ,其开读框由 45 9bp组成 ,编码 15 3个氨基酸经残基组成的多肽。DNA序列同源性分析发现Sj338克隆基因与人及褐鼠的线粒体外膜蛋白的部分编码基因较高度同源。重组质粒pPEX 6P 1 Sj338能高效融合表达 ,理论蛋白的分子量为 17kDa。SDS PAGE和Westernblotting检测结果表明 ,重组蛋白rSj338具有良好的抗原性。 [结论 ]Sj338可能为日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因 ,重组蛋白有望成为新的疫苗候选分子。     

水牛感染血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的 筛选新的有潜质的日本血吸虫保护性抗原分子编码基因。方法 用水牛感染血清对日本血吸虫(Schistosoma Japonicum，Sj)成虫cDNA文库进行免疫筛选，将阳性克隆的插入片段进行PCR扩增和序列分析。结果 3轮筛选后，将7个阳性克隆经辅助噬菌体自动剪切并PCR扩增显示，插入的日本血吸虫cDNA片段大小在0．8～2．0kb之间，选取其中4个经DNA测序分析，发现2个未曾报道过的日本血吸虫新基因，分别命名为Sj-IB1和Sj-Rho GTPase-like gene，并在Gene Bank登记注册。结论 水牛感染血清可识别日本血吸虫的特异性抗原分子，这些抗原分子的免疫保护作用值得进一步研究。     

日本血吸虫中国大陆株基因重组抗原Sj22.6kDa基因克隆与表达的研究

目的 :分离 Sj22.6抗原基因 ,构建 Sj22.6表达克隆。方法 :抗体筛选 Sj成虫 cDNA库 ,PCR扩增目的基因片段 ,亚克隆入表达载体 pGEX- 1λt。对重组体进行诱导表达并对表达产物进行 SDS- PAGE和 Western blot分析。结果 :PCR扩增产物为约 930 bp的 DNA条带。亚克隆入pGEX- 1λt,获得两个表达克隆 pGSj6和 pGSj24 ,特异性表达产物为 22.6k Da抗原。重组体的表达方式为分离表达。结论 :从日本血吸虫成虫 cDNA库筛选到 Sj22 .6k Da克隆化基因 ,并构建了表达克隆 pGSj2 4和 pGSj6。     

日本血吸虫尾蚴抗原免疫血清筛选成虫cDNA文库与新基因分析

目的　筛选与日本血吸虫尾蚴抗原有共同免疫原性的日本血吸虫成虫抗原分子,为血吸虫病诊断和疫苗研究提供新的候选分子。　方法　利用日本血吸虫尾蚴可溶性抗原免疫兔血清筛选日本血吸虫(Schistosomajaponicum,Sj)成虫cDNA文库,对阳性克隆的插入片段进行PCR扩增和序列分析。　结果　共筛选出13个阳性克隆,PCR扩增出特异的插入片段。测序分析获4个新基因SjCAI、SjCA、SjCAI2和SjCAI3(登录号分别为AF495883、AF515834、AY118086和AY129303),分别编码353、161、137和72个氨基酸的蛋白。SjCAI蛋白含6个DNA结合锌指,与原肠胚锌指蛋白XLCGF48.2有一定同源性;SjCA蛋白、SjCAI2蛋白和SjCAI3蛋白含N糖基化和磷酸化位点。　结论　筛选Sj成虫cDNA文库获得了新的基因序列。     

大鼠抗感染血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的　探讨大鼠抗日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)感染的分子机制 ,为血吸虫病疫苗的研制提供新的抗原分子。方法　用Sj感染大鼠血清筛选Sj成虫cDNA文库 ,对阳性克隆cDNA插入片段进行PCR扩增及测序分析。 结果　对cDNA文库中约 3× 10 5个噬菌斑进行筛选 ,获 7个阳性克隆 ,其插入基因片段大小为 0 9kb～ 2 0kb。初步测序获 5个部分序列 ,其中R3与Sj线粒体基因明显同源 ;R5为新基因序列 ,命名为Sj-Cs2 (GenBank的登录号为AY0 36 5 80 ) ,经计算机分析该基因片段编码 2 0 6个氨基酸组成的跨膜蛋白 ,Sj-Cs2蛋白含有 3个蛋白激酶C磷酸化位点和 6个N -肉豆蔻酸化位点 ;其余序列亦为新基因片段 ,但无完整编码框。结论　筛选获得了与大鼠抗Sj感染有关的基因克隆 ,相关克隆cDNA全长的获取、新基因的结构与功能以及免疫学特性值得深入研究     

日本血吸虫10.6 kDa膜蛋白基因的克隆及表达

目的　寻找新的预防日本血吸虫感染疫苗候选分子。　方法　用具保护性的抗血吸虫膜单抗及免疫血清筛选日本血吸虫 c DNA文库 ,PCR扩增 c DNA插入片段 ,A - T连接法将筛选获得的 3个基因片段克隆到p GEM- T载体上 ,自动测序仪测序 ,序列送 BL AST基因服务站进行同源性分析。重新设计引物扩增编号为 B8克隆的开放阅读框碱基序列 ,先将其克隆入 p GEM- T载体质粒 ,再定向亚克隆入 p BK- CMV表达质粒 ,IPTG诱导表达后用 SDS- PAGE和 Western blotting分析表达产物。　结果　经双酶切及 PCR法均证实基因重组成功。其特异性表达产物约为 10 .6 k Da蛋白抗原。表达产物可被免疫血清及单抗识别。　结论　构建了编码日本血吸虫 10 .6k Da蛋白基因表达克隆。     

日本血吸虫中国大陆株基因重组抗原Sj22.6kDa基因克隆与表达的研究

目的 :分离 Sj2 2 .6抗原基因 ,构建 Sj2 2 .6表达克隆。方法 :抗体筛选 Sj成虫 c DNA库 ,PCR扩增目的基因片段 ,亚克隆入表达载体 p GEX- 1λt。对重组体进行诱导表达并对表达产物进行 SDS- PAGE和 Western blot分析。结果 :PCR扩增产物为约 930 bp的 DNA条带。亚克隆入p GEX- 1λt,获得两个表达克隆 p GSj6和 p GSj2 4 ,特异性表达产物为 2 2 .6k Da抗原。重组体的表达方式为分离表达。结论 :从日本血吸虫成虫 c DNA库筛选到 Sj2 2 .6k Da克隆化基因 ,并构建了表达克隆 p GSj2 4和 p GSj6。     

日本血吸虫疫苗候选分子的基因克隆、表达及特性鉴定

本研究用日本血吸虫（Sj）成虫抗原免疫的免血清从日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA库筛选出Sj22．6基因克隆；用根据曼氏血吸虫23kDa膜抗原（Sm23）的编码基因设计的引物，以PCR法从日本血吸虫成虫CDNA库扩增出Sj23基因；用根据日本血吸虫菲律宾林的磷酸丙糖异构酶（SjTPI）基因设计的引物，以RT－PCR从日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA扩增出SjTPI基因；并测得了上述3个基因的核苷酸序列；通过与国外有关单位合作研究，获得日本血吸虫中国大陆株肌球蛋白的62kDa肽段（Sj62）的编码基因克隆．Sj22．6、SjTPI及Sj62的编码基因巴克隆入质粒pGEX并获得表达；Sj23基因克隆入杆状病毒，在家蚕幼虫体内获得表达．用Glutathione－Sepharose4B（GS4B）已纯化出重组的Sj22．6（rSj22．6）、Sj62（rSj62）及SjTPI。Sj22．6、Sj23、SjTPI和Sj62基因的表达产物均可被Sj重感染的兔血清识别；用rSj22．6免疫家兔和小鼠，均可诱生明显升高的IgG抗体，其可特异地识别rSj22．6，还可识别成虫抗原中天然的相应分子，但不识到虫卵抗原中任何成份．用rSj22．6对昆明鼠及BALB／C小鼠分别作免疫攻击实验，前者可产生38.93％的减虫率，后者可产生32．1％－35.27％的减虫率和28．4％的总体减卵率。Sj22．6／Sj26GST融合蛋白可诱导BALB     

日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因克隆及特性鉴定

目的为探索血吸虫病疫苗的新路径,对日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因克隆及特性鉴定.方法分析本室筛选日本血吸虫成虫cDNA文库获得的一cDNA片段(Sj338/24)的开读框序列,在其上下游分别设计引物A和B,并以该cDNA片段为模板进行PCR扩增后将该片段重组于pGEM-T中并进行DNA测序鉴定及检索.再经酶切后将该基因片段亚克隆入表达载体pGEX-6P-1,并进行蛋白表达、纯化及抗原性鉴定.结果该目的基因PCR产物全长共487bp,其开读框由459bp组成,编码153个氨基酸残基组成的多肽.DNA序列同源性分析发现,Sj338克隆基因与人及褐鼠的线粒体外膜蛋白的部分编码基因较高度同源.重组质料pPEX-6P-1/Sj338能高效融合表达,融合蛋白的分子量为43kDa.SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,重组蛋白rSj338具有良好的抗原性.结论·Sj338可能为日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因,重组蛋白有望成为新的疫苗侯选分子.     

日本血吸虫14—3—3抗原编码基因的克隆及序列测定

为了寻找日本吸虫病新的诊断和候选疫苗分子,设计合成引物,以日本血吸虫成虫cDNA第一链为模板,用PCR法扩增出日本血吸虫14－3－3抗原（Sj14-3-3）基因编码序列,其大小约784bp,将其克隆入pGEM-T载体,重组质粒pGEM-T-Sj14-3-3经双酶切和以质粒为模板进行PCR扩增,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段,序列测定结果表明具有一个长度为765bp的完整开放阅读框,与曼氏血吸虫14－3－3核苷酸序列有高度同源性。本实验克隆了日本血吸虫14－3－3抗原的编码基因,并进行了序列测定,为进一步研究提供了条件。     

日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因的原核表达

目的 进一步研究日本血吸虫（中国大陆株）Sj16的免疫调节功能,丰富有关血吸虫免疫逃避知识。方法 根据曼氏血吸虫Sm16基因已知序列设计合成一对引物,用PCR技术从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库中扩增Sj16基因,将Sj16基因定向克隆入pGEX-4T-1,转化感受态BL21/DE3菌;用酶切、PCR扩增鉴定筛选得到的重组阳性克隆,IPTG诱导pGEX-4T-1-Sj16转化的BL21/DE3菌,用SDS-PAGE和Wester-blot分析表达产物。结果 从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库中获取Sj16基因,重组质粒中含有Sj16基因,成功构建日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因原核表达重组质粒pGEX-4T-1-Sj16,pGEX-4T-1-Sj16转化的BL21/DE3菌经IPTG诱导可表达与GST融合的蛋白（约40kDa）,抗GST抗体能特异性识别该蛋白。结论 成功原核表达了Sj16蛋白,为深入研究Sj16的免疫调节功能,丰富有关血吸虫免疫逃避知识打下了基础。     

日本血吸虫22.6 kDa重组抗原的高效融合表达及特性鉴定

目的： 大量获得纯化的日本血吸虫２２６ ｋ Ｄａ 重组抗原。方法： 用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法将其编码基因序列经改造后亚克隆入载体质粒ｐ Ｇ Ｅ Ｘ １λ Ｔ 进行表达。结果： 得到了融合表达的蛋白抗原。此融合蛋白表达量大, 用凝血酶酶切后易大量制备纯化的重组２２６ ｋ Ｄａ 抗原。结论： 以此融合蛋白免疫的小鼠抗血清进行免疫印迹试验, 表明 Ｓｊ２２６／ Ｓｊ２６ Ｇ Ｓ Ｔ 融合重组蛋白具有与 Ｓｊ２２６ 蛋白一样的免疫学活性。     

重组日本血吸虫特异性IgE相关蛋白的纯化及免疫学活性鉴定

目的　纯化重组日本血吸虫特异性IgE抗体相关蛋白和鉴定其免疫原性。　方法　大量表达Sj43B/pGEX 6p 1 /BL2 1重组克隆菌 ,超声粉碎后离心获得融合表达的重组蛋白包涵体。经TNMFX缓冲液分步洗涤后 ,将包涵体溶解液经FPLC分离 ,获得重组融合蛋白组分 ,再经巯基二硫键转换复性后 ,用于免疫小鼠获得抗血清 ,分别用dot ELISA法和Westernblotting法对融合蛋白引起的特异性血清抗体同型反应进行鉴定。　 结果　分步洗涤可有效去除重组蛋白包涵体沉淀中混杂的多数杂蛋白成分 ,FPLC分离可获得高纯度重组蛋白。用复性后的重组融合蛋白免疫小鼠 ,其中目的蛋白可引起特异性IgE抗体反应 ,而担体蛋白 2 6kDaGST不引起特异性IgE应答 ,可引起特异性IgG抗体反应 ,目的蛋白则否。　结论　重组质粒Sj43B/pGEX 6p 1表达的融合蛋白 ,其目的蛋白部分免疫小鼠可产生特异性IgE抗体。     

Sj43B基因编码蛋白的日本血吸虫虫体组织定位

目的确定Sj43B基因编码蛋白在日本血吸虫成虫体内组织及亚细胞水平定位。方法取新鲜日本血吸虫成虫标本,按电镜生物样品制备方法常规固定、包埋,制成超薄切片,与鼠源纯化的抗重组Sj43B基因编码蛋白的IgE抗体(对照组试验为正常鼠血清)反应,再与大鼠抗小鼠IgE的IgG抗体结合,最后与蛋白A-胶体金连接,透射电镜下观察胶体金颗粒的分布。结果用正常鼠血清处理虫体切片,从皮层、肌层到皮层细胞体,未见有明显的电子致密的胶体金颗粒分布。用特异性IgE抗体处理的样品上,胶体金颗粒分布较广泛,见于皮层、肌层、胞质、核膜和核质内。结论Sj43B基因编码蛋白在血吸虫成虫体内的分布无组织和亚细胞结构特异性。     

重组质粒pGEX-6P-1/Sj-FABPc的构建及在大肠杆菌中的表达

目的构建基因工程菌株,获得重组蛋白Sj-FABPc(日本血吸虫脂肪酸结合蛋白).方法用PCR法从日本血吸虫cDNA文库中扩增Sj-FABPc基因片段,再将该片段重组于pGEMT中并进行DNA测序鉴定,经酶切后将目的片段构建成重组质粒pGEX-6P-1/Sj-FABPc,转化于大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达.用Glutathione SepharoseTM 4B亲和层析柱对表达产物进行纯化,PreScissionTM Protease酶对融合蛋白进行分离,获得纯化的14kDa Sj-FABPc.SDSPAGE和Western blot方法对表达产物进行鉴定.结果获得pGEX-6P-1/Sj-FABPc菌株,分离纯化出14kDa Sj-FABPc,表达量为10.52mg/L.Western blot显示,表达蛋白能被日本血吸虫免疫兔血清识别.结论重组蛋白Sj-FABPc可高效表达并有良好的抗原性.     

Sj28GST基因克隆和高效表达产物的纯化

目的　从日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库中克隆 2 8kDa谷胱甘肽 -S -转移酶 (Sj2 8GST)基因 ,获得用于疫苗和T细胞表位研究的高纯度重组融合蛋白 2 8GST -TRX。方法　应用引物特异性PCR技术 ,从日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库中扩增Sj2 8GST基因 ,经琼脂糖凝胶电泳结合碱基序列分析鉴定后 ,采用定向克隆技术构建Sj2 8GST -TRX融合蛋白重组表达载体并诱导其在大肠杆菌BL2 1(DE3)的表达 ,用Western -blotting测定以融合蛋白方式表达的Sj2 8GST的免疫原性 ,通过包涵体纯化结合Ni+柱亲和层析获得高纯度重组融合蛋白。结果　Sj2 8GSTPCR产物为约 6 4 0bp ,其碱基序列 (6 33bp)和推导的氨基酸序列 (2 11aa)与GenBank报道一致 ;获得了Sj2 8GST -TRX重组质粒 ;2 8GST -TRX融合蛋白在大肠杆菌以包涵体形式高效表达 ;在分子量为约 4 3kDa处有一能与羊抗Sj2 8GST抗体产生特异性反应的含 2 8GST融合蛋白条带 ;包涵体纯化法结合Ni+ 亲和层析可获得高纯度的重组融合蛋白。结论　获得到了日本血吸虫中国大陆株 2 8GST分子的全长基因和高纯度重组 2 8GST -TRX融合蛋白 ,该融合蛋白具有天然Sj2 8GST免疫原性。     

日本血吸虫超氧化物歧化酶的表达与免疫活性鉴定

目的表达日本血吸虫胞浆内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD),并研究其免疫原性。方法采用反转录PCR方法从血吸虫成虫mRNA中扩增出SOD基因序列,再亚克隆到表达载体pGEX-4T-3中构建重组表达质粒并转化到E.coli BL21(DE3)中。用IPTG对含有重组质粒的转化子细菌进行诱导表达重组的GST-SOD蛋白。用重组GST-SOD蛋白免疫小鼠制备免疫血清,并用免疫印迹试验观察重组GST-SOD融合蛋白的免疫原性。结果 日本血吸虫胞浆内SOD基因被成功地扩增,并构建成功含此基因的重组表达质粒Sj SOD-pGEX-4T-3。含重组质粒的E. coli在IPTG的诱导下能表达一大小约43 kDa的GST-SOD重组蛋白。用此蛋白免疫小鼠产生的特异性抗体水平最高能达1: 12 800,该萤组蛋白可以被血吸虫重感染兔血清所识别。结论 日本血吸虫中国大陆株胞浆内SOD表达成功,并具有良好的免疫原性。     

日本血吸虫再感染相关蛋白基因的克隆和原核表达

目的　从日本血吸虫 (S .japonicum )尾蚴文库扩增S .japonicum再感染相关蛋白 (RIRP)基因 ,进行克隆并原核表达出RIRP ,为进一步的功能研究奠定基础。　方法　根据已登陆的S .japonicum成虫期RIRP基因的序列设计两条特异引物 ,以S .japonicum尾蚴cDNA文库为模板扩增RIRP基因cDNA ,将该基因的cDNA克隆入原核表达载体 pGEX 4T 1和真核载体 pcD NA3 .1。转化的克隆通过氨苄青霉素的筛选、PCR扩增、双酶切和最后的测序鉴定。重组的 pGEX 4T 1/RIRP在大肠埃希菌BL2 1(DE3 )中进行表达。SDS PAGE鉴定其在大肠埃希菌中的表达情况和分子质量。用抗 2 6kuGST单抗作western杂交进一步鉴定融合蛋白的表达。　结果　从S .japonicum尾蚴文库中扩增出一条长为 462bp的cDNA片段 ,经测序证实其为RIRP基因的全长cDNA。它编码含 15 3个氨基酸的蛋白质—RIRP ,预测其分子质量单位为 17.5 45ku。RIRPcDNA已被成功克隆入 pGEX 4T 1和pcDNA3 .1载体 ,大肠埃希菌BL2 1(DE3 )编码一个约 17ku的蛋白质。　结论　RIRP基因首次从S .japonicum尾蚴文库中扩增出来 ,并成功构建了原核和真核表达载体 ,而且 ,它首次由大肠埃希菌表达 ,表达蛋白的分子质量单位约 17ku。