抗多种致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白的制备研究

目的:探讨一种新的获得IgY多克隆抗体的方法和效果。方法:用三种常见的细菌病原体金黄色葡萄球菌(SA)、大肠埃希氏菌(EC)、铜绿假单胞菌(PA)制备复合抗原,并经过灭活后免疫来亨蛋鸡产生IgY多克隆抗体。从免疫后的蛋中提取出IgY多克隆抗体,ELISA法测IgY抗体特异性及浓度滴度。SA、EC、PA三种标准菌株体外抑制实验检测IgY抗体抑菌效果。结果:用SA、EC、PA复合抗原成功地免疫来亨蛋鸡产生IgY多克隆抗体,ELISA法检测抗体浓度滴度为100,000;IgY抗体明显抑制SA、EC、PA三种标准菌株的生长。结论:SA、EC、PA三种细菌复合抗原可以刺激来亨蛋鸡产生高浓度滴度抗体IgY,该抗体能明显抑制SA、EC、PA三种标准菌株的生长。     

酶标记鸡卵黄抗E.coli O157∶H7抗体的制备与特性研究

目的研究制备特异性抗E.coliO157∶H7鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)及酶标记抗体(IgY-HRP)的工艺条件。方法分别用灭活菌体、脂多糖及O抗原多糖抗原免疫临产母鸡,水稀释法结合离子交换色谱分离提取IgY,再用过碘酸钠法和戊二醛法进行HRP标记,各种制品的分析用电泳及ELISA法。结果可获得纯度为79.6%~85.3%的IgY,提取率74%~77%;过碘酸钠氧化法标记效果较好,IgY-HRP(1mg/ml)最高效价640。结论免疫制备IgY方法可行,过碘酸钠法标记IgY-HRP取得良好效果。     

酶标记鸡卵黄抗E.coli O157:H7抗体的制备与特性研究

目的：研究制备特异性抗E.coli O157：H7鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）及酶标记抗体（IgY-HRP）的工艺条件。方法：分别用灭活菌体、脂多糖及O抗原多糖抗原免疫临产母鸡,水稀释法结合离子交换色谱分离提取IgY,再用过碘酸钠法和戊二醛法进行HRP标记,各种制品的分析用电泳及ELISA法。结果：可获得纯度为79．6％～85．3％的IgY,提取率74％～77％;过碘酸钠氧化法标记效果较好,IgY-HRP（1mg／ml）最高效价640。结论：免疫制备IgY方法可行,过碘酸钠法标记IgY-HRP取得良好效果。     

抗类鼻疽伯克霍尔德菌多抗血清的制备及评价

目的制备抗类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudoamllei,其抗原简写为BP)多抗血清,评价不同处理方式对抗原免疫原性的影响.方法 采用超声破碎、甲醛灭活、热灭活3种方式处理细菌抗原接种新西兰兔和BALB/C小鼠,检测不同抗原免疫动物抗血清的ELISA效价及凝集试验效价.结果 (1)ELISA方案最佳条件:二抗稀释度为1/8 000,抗原包被浓度为4 μg/mL或8 μg/mL;凝集反应最佳条件:细菌浓度为6×109 CFU/mL、凝集温度为37 ℃、观察时刻为4 h.(2)超声破碎抗原(U-BP)免疫新西兰兔和小鼠的抗血清ELISA效价高达1/64 000,最高血清凝集效价分别为1/32和1/64,甲醛灭活抗原(F-BP)抗血清ELISA效价高达1/16 000,凝集效价为1/128和1/64;热灭活抗原(H-BP)抗血清ELISA效价达1/8 000,凝集效价为1/16和1/64.(3)F-BP和H-BP具有较强的免疫原性,U-BP在小鼠中的免疫原性较弱(P<0.05).结论 建立了抗类鼻疽伯克霍尔德杆菌多克隆抗体的检测方法,制备了高效价的抗类鼻疽伯克霍尔德杆菌多抗血清;甲醛灭活和热灭活细菌具有较好的免疫原性,为下一步类鼻疽伯克霍尔德杆菌的致病机制研究和疫苗研发打下了基础.     

人转铁蛋白纯化制备及其抗原活性验证

目的采用非亲和纯化方法从人血清中制备获得高纯度转铁蛋白(TRF),并用此为免疫抗原免疫新西兰大白兔,验证TRF蛋白的免疫原性。方法首先采用两步硫酸铵沉淀法从血清中粗纯TRF蛋白,再用两步阴离子交换层析柱进行纯化,最终得到TRF。结果 TRF蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)纯度与外购纯品相当,且高效液相色谱(HPLC)纯度达到96.8%,纯化回收率为78.6%。对于同一批TRF样品,TRF检测试剂盒(免疫法)测得的活性浓度与紫外分光光度计法测得的蛋白浓度比值(Rc)约为0.95,说明制备的TRF与免疫检测试剂盒中的TRF抗体具有良好的抗原反应性。最后用纯化样品免疫新西兰大白兔,经过4次免疫后的抗血清效价滴度达到1∶128 000,说明制备的TRF具有良好的免疫原性。结论制备的高纯度TRF具有良好的抗原反应性及免疫原性,可用于动物免疫以制备抗TRF抗体,为配制TRF检测试剂(免疫法)提供良好的原料基础。     

抗变形链球菌卵黄抗体的初步研制

目的通过用变形链球菌作为疫苗免疫蛋鸡,从鸡蛋中获得抗变形链球菌特异性抗体(抗S.mutans抗体).方法以变形链球菌Ingbritt珠(血清型c型)作为抗原免疫蛋鸡,取鸡蛋卵黄以水溶-硫酸铵沉淀-超滤提取纯化的卵黄抗体(IgY),以直接凝集法测定鸡血清及蛋黄中的抗体.结果血清中首先产生抗变形链球菌的抗体,在初免后2周逐步增高,在4～5周达到高峰,而后抗体转移到卵黄中,制备的卵黄抗体经电泳检测,相对分子质量约为210 000,纯度达到75%以上,每只鸡蛋中能提取约150 mg的IgY.结论变形链球菌菌苗免疫蛋鸡可使鸡蛋产生高效价IgY.     

抗变形链球菌卵黄抗体的初步研制

目的 通过用变形链球菌作为疫苗免疫蛋鸡，从鸡蛋中获得抗变形链球菌特异性抗体（抗S.mutans抗体）。方法 以变形链球菌Ingbritt珠（血清型c型）作为抗原免疫蛋鸡，取鸡蛋卵黄以水溶－硫酸铵沉淀－超滤提取纯化的卵黄抗体（IgY)，以直接凝集法测定鸡血清及蛋黄中的抗体。结果 血清中首先产生抗变形链球菌的抗体，在初免后2周逐步增高，在4－5周达到高峰，而后抗体转移到卵黄中，制备的卵黄抗体经电泳检测，相对分子质量约为210000，纯度达到75％以上，每只鸡蛋中能提取约150mg的IgY。结论 变形链球菌菌苗免疫蛋鸡可使鸡蛋产生高效价IgY。     

蛋黄免疫球蛋白制备和应用研究进展

用抗原免疫鸡从蛋黄中提取抗体,已用于各种免疫检测中,过去,用哺乳动物产生的抗体,往往能活化标本中的补体系统,并可能与类风湿因子结合,对免疫学试验产生干扰。而蛋黄抗体(Yolk IgG简称IgY)不激活补体,也不与类风湿因子结合,具有突出的优点。IgY比较稳定、耐酸、耐热,可以内服,可用于某些肠道疾病及其他疾病的防治。鸡经免疫10天左右,即在蛋黄中产生了抗体,约20天达到高峰,如再继续免疫加强,一般能获得高产的特异IgY,效价可维持9～28周。采用亲脂性溶剂(如氯仿)以及聚乙二醇(PEG6000)、硫酸铵等沉淀法粗提IgY,再用亲和层析法进一步纯化特异IgY。纯化的IgY在室温中保存6个月,其抗体活性不变,在4℃贮存可达6—7年,活性下降少于5％。基于上述特点,IgY在实验室试验和对某些疾病防治方面有着厂阔的应用前景。     

a-N-乙酰半乳糖胺酶多克隆抗体的制备及特异性鉴定

目的制备a-N-乙酰半乳糖胺酶(NAGA)的高效价高特异性的兔多克隆抗体。方法利用pET22b-NA-GA/BL21(DE3)工程菌株表达NAGA,经Ni2+Sepharose 6 FF亲合层析,Phenyl Sepharose 6 FF疏水层析两步纯化,得到纯度95%的NAGA作为抗原免疫新西兰白兔,获得NAGA的兔抗血清,并经HiTrap rProtein A柱纯化获得高效价高特异性的抗体;用间接ELISA法检测抗体效价,用Western blotting评价抗体特异性。结果制备得到的NAGA兔多克隆抗体血清效价为1×106,经过rProtein A柱纯化后抗体蛋白纯度95%,效价为1×105;Western blotting显示:该NAGA兔多克隆抗体只与NAGA发生特异性反应。结论获得了NAGA的高效价高特异性的兔多克隆抗体。     

胱抑素C抗体的质量评价及应用分析

目的将日本进口的胱抑素C（Cys C）抗体与某公司制备的兔抗Cys C抗体、羊抗Cys C抗体进行质量检测,初步应用试验评估这3种抗体能否用于定量检测血清Cys C （胶体金免疫比浊法）试剂盒的研发。方法分别用紫外分光光度法、二喹啉甲酸（BCA ）法检测3种Cys C抗体浓度;以聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其纯度;采用酶联免疫吸附法（ELISA）测效价;然后将这3种Cys C抗体分别标记胶体金颗粒,以胶体金免疫比浊法测定血清Cys C ,比较其初步应用性。结果日本进口Cys C抗体浓度高达15．0～16．0 mg/mL ,某公司自制兔抗Cys C抗体、羊抗Cys C抗体浓度范围在3．0～4．0 mg/mL之间;聚丙烯酰胺凝胶电泳显示3种抗体纯度相近,结果为85％。其抗体效价大于或等于1∶104;胶体金免疫比浊法测定Cys C的临床比对结果证实公司自制抗体与日本进口Cys C抗体有较好的可比性。结论某公司的兔抗Cys C、羊抗Cys C抗体与日本进口Cys C抗体虽浓度不同,但均具有高纯度和高效价的特点,可用于定量检测血清Cys C（胶体金免疫比浊法）试剂盒的研发。     

感染性阴道疾病3种病原体单克隆抗体的制备

目的研发感染性阴道疾病(细菌性阴道炎、滴虫性阴道炎和霉菌性阴道炎)的特异性单克隆抗体。方法分析感染性阴道疾病病原体的基因谱,扩增特异蛋白的基因序列,基因工程重组抗原AP33,免疫Balb/c小鼠,运用杂交瘤技术得到特异性单克隆抗体;采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)进行抗血清效价测定及抗体的亚类及轻链型鉴定;采用BCA法、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法分析纯品抗体的蛋白浓度、纯度和相对分子质量。结果杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体纯度均达到了90%以上,抗体浓度2.41～5.68mg/mL,抗体效价在1∶105～1∶107之间;抗体类别均为IgG1,κ型。结论本研究获得了3种感染性阴道疾病纯度高、特异性强的单克隆抗体,将为药理学、诊断学及相关学科提供研究材料,具有广阔的市场前景和巨大的经济效益。     

激动样活性抗α1-肾上腺素受体胞外第二肽段抗体的制备

目的:制备提纯抗α1-肾上腺素受体抗体,并对其生物学活性进行鉴定。方法:实验于2003-02/12在华中科技大学同济医学院附属协和医院完成。①选取清洁级1月龄雄性Wistar大鼠6只,取4只用于抗α1-肾上腺素受体抗体的制备。将合成肽用戊二醛与牛血清白蛋白偶联,透析除去未结合的多肽,与等体积的弗氏佐剂混匀后于0,2,4,6,8周对大鼠进行免疫处理,4只/次。另2只作为未免疫对照。免疫前后鼠尾采血并用ELISA法检测抗体的滴度,α1-肾上腺素受体抗原的包被浓度50mg/L,血清稀释度从1∶40开始倍比稀释,辣根过氧化物酶酶标抗体稀释度为1∶2000。用阳性血清与阴性血清的吸光度之比来判定,比值≥2.1为阳性。免疫结束后采血,离心取上清,与等体积的生理盐水混合后逐滴加入饱和硫酸铵至浓度达50%,于磷酸盐缓冲液中透析。②以合成的α1-肾上腺素受体胞外第二肽段多肽为抗原,采用免疫亲和层析的方法,纯化用合成肽免疫大鼠产生的抗α1-肾上腺素受体多克隆抗体,用Bradford对抗体进行定量,十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶电泳检测抗体纯度,以ELISA法、免疫组化、免疫印迹方法进行抗体免疫活性分析,用激光共聚焦测量细胞内游离钙浓度变化以检测抗体的激动样活性。结果:实验选取清洁级1月龄雄性Wistar大鼠6只,全部进入结果分析。①抗α1-肾上腺素受体抗体的产生和纯度:抗α1-肾上腺素受体抗体在大鼠免疫后2周开始产生,8周后达到很高滴度。提纯的抗体聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定有较高的纯度。②纯化的抗α1-肾上腺素受体抗体的免疫学活性:抗体浓度为0.1g/L时滴度约1∶2560,并可结合培养平滑肌细胞及心肌组织上的α1-肾上腺素受体,具有较好的反应原性。③纯化的抗α1-肾上腺素受体抗体的生物学活性:抗α1-肾上腺素受体抗体可显著升高分离的成年大鼠心肌细胞游离钙离子浓度,高达(139.6±15.5)%。该抗体的作用可被Prazosin阻断,降至(28.9±12.64)%,具有特异性及激动样活性。结论:采用自制的免疫亲和层析柱可将合成肽免疫产生的具有激动样活性的抗α1-肾上腺素受体抗体纯化。     

激动样活性抗α1-肾上腺素受体胞外第二肽段抗体的制备

目的：制备提纯抗α1-肾上腺素受体抗体，并对其生物学活性进行鉴定。 方法：实验于2003-02／12在华中科技大学同济医学院附属协和医院完成。①选取清洁级1月龄雄性Wistar大鼠6只，取4只用于抗α1-肾上腺素受体抗体的制备。将合成肽用戊二醛与牛血清白蛋白偶联，透析除去未结合的多肽，与等体积的弗氏佐剂混匀后于0，2，4，6，8周对大鼠进行免疫处理，4只／次。另2只作为未免疫对照。免疫前后鼠尾采血并用ELISA法检测抗体的滴度，α1-肾上腺素受体抗原的包被浓度50mg／L，血清稀释度从1：40开始倍比稀释，辣根过氧化物酶酶标抗体稀释度为1：2000。用阳性血清与阴性血清的吸光度之比来判定，比值≥2．1为阳性。免疫结束后采血，离心取上清，与等体积的生理盐水混合后逐滴加入饱和硫酸铵至浓度达50％，于磷酸盐缓冲液中透析。②以合成的α1-肾上腺素受体胞外第二肽段多肽为抗原，采用免疫亲和层析的方法．纯化用合成肽免疫大鼠产生的抗α1-肾上腺素受体多克隆抗体，用Bradford对抗体进行定量，十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶电泳检测抗体纯度，以ELISA法、免疫组化、免疫印迹方法进行抗体免疫活性分析，用激光共聚焦测量细胞内游离钙浓度变化以检测抗体的激动样活性。 结果：实验选取清洁级1月龄雄性Wistar大鼠6只，全部进入结果分析。①抗α1-肾上腺素受体抗体的产生和纯度：抗α1-肾上腺素受体抗体在大鼠免疫后2周开始产生，8周后达到很高滴度。提纯的抗体聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定有较高的纯度。②纯化的抗α1-肾上腺素受体抗体的免疫学活性：抗体浓度为0．1g／L时滴度约1：2560，并可结合培养平滑肌细胞及心肌组织上的α1-肾上腺素受体，具有较好的反应原性。（3）纯化的抗α1-肾上腺素受体抗体的生物学活性：抗α1-肾上腺素受体抗体可显著升高分离的成年大鼠心肌细胞游离钙离子浓度，高达（139．6&;#177;15．5）％。该抗体的作用可被Prazosin阻断，降至（28．9&;#177;12．64）％，具有特异性及激动样活性。 结论：采用自制的免疫亲和层析柱可将合成肽免疫产生的具有激动样活性的抗α1-肾上腺素受体抗体纯化。     

心肌特异表达基因p93的原核表达及鸡卵黄抗体的制备

目的在大肠杆菌中高效表达心肌特异表达基因p93，以此作为抗原免疫产蛋母鸡，制备抗p93蛋白鸡卵黄抗体（IgY）。方法将p93基因分别插入原核表达载体pGEX-5X-1、pBV220、pET28a（＋）中，选取表达量最高的载体进行表达纯化，其产物免疫产蛋母鸡。结果插入pET28a（＋）中N端带有His标签的p93表达水平最高，且以包涵体形式存在，从含有pET28a-p93质粒的1L培养的菌液中可获得3mg纯化的p93蛋白。免疫产蛋母鸡，末次免疫后其卵黄抗体最高滴度达到1：64000，Western blot结果显示该抗体具有高度特异性。结论此抗体的制备为新基因p93的检测提供了良好的工具。     

1种改良的高效单特异性兔多克隆抗体的制备方法

目的建立1种改良的高效单特异性兔多克隆抗体的制备方法。方法用RT-PCR方法获得bax保守N端1～123位氨基酸基因片段,并将其插入pET42a原核表达载体,诱导表达的Bax融合蛋白组合应用GST、His亲和层析技术获得免疫原(pET42a/Bax融合蛋白),HPLC鉴定纯度达95%。利用改良快速免疫法获得人Bax兔多克隆抗体,并经蛋白A柱亲和层析技术,抗原亲和纯化技术获得高效价高特异性的抗体。间接ELISA检测抗体滴度、Western blot和免疫组化试验检测抗体特异性,并与商业化抗体进行对比。结果通过快速免疫法得到人Bax兔多克隆抗体,经过Protein A柱纯化,再经抗原亲和纯化后,间接ELISA证明,抗体效价均达1:51 200;Western blot显示,只有经过抗原亲和纯化后的抗体特异性高,无其他杂带;免疫组化证明,在原发性肝癌组织中,人Bax兔多克隆抗体能特异地和内源性Bax结合,其高效高特异性已达国外Santa Cruse公司Bax商业化抗体水平。结论快速免疫法与抗原亲和纯化相结合,获得人Bax高效单特异性兔多克隆抗体,建立了1种改良的高效单特异性兔多克隆抗体的制备方法。     

红细胞膜免疫磁珠检测成分血中抗A/抗B的研究

目的比较应用红细胞膜免疫磁珠法及传统方法进行成分血中抗A/抗B效价检测之间的相关性。建立应用红细胞膜免疫磁珠检测血浆标本中高效价抗体的方法。方法采用新鲜细胞试管法、微柱凝胶法及红细胞膜免疫磁珠法进行血浆样本抗体效价检测。将试管法检测效价≥128的样本10倍、15倍、20倍稀释后,用红细胞膜免疫磁珠检测,测定其凝集强度。结果微柱凝胶法最敏感,其次为试管法,红细胞膜免疫磁珠法低于试管法1个滴度。将试管法检测效价≥128的待检样本15倍稀释后,用红细胞膜免疫磁珠检测,其凝集强度≥2+。结论红细胞膜免疫磁珠可做为标准红细胞抗原应用于抗体效价检测,将样本进行15倍稀释,若凝集强度≥2+,则可视其带有高效价抗体。     

促红细胞生成素多克隆抗体及酶标抗体的制备及纯化研究

目的以免疫亲和层析方法纯化重组人促红细胞生成素（rhEPO）并免疫新西兰家兔制备多克隆抗体,用辣根过氧化物酶标记抗体,为进一步建立ELISA检测体系做准备。方法购买rhEPO,用淋巴结内注射法制备多克隆抗体,EPO抗体与葡聚糖凝胶偶联,制成抗体亲和层析柱,以rhEPO作为抗原上样纯化。抗体先盐析粗提纯再过SPA亲和层析柱纯化。用高碘酸钠法制备酶标抗体。结果亲和层析纯化的抗原、抗体纯度较高,蛋白质含量测定分别为0.560、.41 mg/ml;酶结合率为0.578。结论免疫亲和层析法纯化rhEPO,制备的多克隆抗体及酶标记抗体的纯度好,可以满足下一步组建试剂盒的需求。     

抗载脂蛋白apoB鸡卵黄抗体(IgY)的制备

目的 制备抗载脂蛋白apoB鸡卵黄抗体（IgY）,并观察鸡蛋黄中抗体的产量、纯度及稳定性。方法 用载脂蛋白apoB免疫本地良种产蛋鸡,通过水溶法提取蛋黄中抗体IgY,Bradford法测定抗体含量,SDS-PAGE电泳检测抗体纯度,Western blot免疫印迹法测定抗体的特异性,ELISA检测热处理后的抗体活性。结果 经提纯的抗体含量为7.5 mg/ml,抗体纯度达到90%,Western blot免疫印迹法证明该抗体具有高度的特异性,70℃以下稳定性良好。结论 抗载脂蛋白apoBIgY抗体的制备为下一步免疫学检测奠定了基础。     

抗幽门螺杆菌HP1188蛋黄抗体的研究

目的 制备抗幽门螺杆菌(H.pylori) HP1188 蛋黄抗体(immunoglobulin yolk,IgY),即 HP1188-IgY,了解其理化特性和生物学活性,为研制H.pylori HP1188-IgY型抗体口服制剂提供实验依据.方法 用纯化的重组HP1188蛋白免疫产蛋鸡,以水稀释法结合氯仿有机沉淀法提取蛋黄抗体(HP1188-IgY),采用SDS-PAGE电泳检测其纯度,Bradford法测定蛋白含量,Western blot分析抗原特异性.间接ELISA评价 HP1188-IgY 对热、酸及胃蛋白酶消化作用的耐受情况.分别检测不同浓度 HP1188-IgY及不同 pH 相同浓度HP1188-IgY对H.pylori的生长抑制试验.用MTT法检测不同浓度HP1188-IgY对H.pylori细胞毒活性的中和作用.结果 HP1188-IgY 纯度约为68%,蛋白浓度为7.79 mg/mL,Western blot结果 显示在相对分子质量30 000附近出现反应条带.HP1188-IgY具有一定的耐热性、耐酸性和耐胃蛋白酶消化的能力.HP1188-IgY在体外可抑制H.pylori生长,并具有浓度依赖性和pH依赖性.HP1188-IgY 能阻断H.pylori菌体蛋白对Hela细胞的毒性作用,且该作用具有浓度依赖性.结论 成功制备了HP1188-IgY,其具有良好的理化性质和生物学特性,为进一步制备预防幽门螺杆菌感染的口服制剂奠定了基础.     

单纯疱疹病毒Ⅰ，Ⅱ型抗原gG1，gG2表达产物复性与纯化。

目的 探讨原核表达系统表达单纯疱疹(HSV)Ⅰ,Ⅱ型分型抗原gG1,gG2包涵体的复性与纯化方法 .方法 采用含氧化/还原谷胱甘肽(1:6)透析液透析法复性,并配合Ni2 固相化的HiTrap Chelating HP亲和层析法纯化表达抗原.应用免疫印迹法、动物免疫实验、SDS-PAGE凝胶电泳对复性纯化后的抗原免疫活性、纯度给以鉴定.结果 复性后的表达抗原具有相当于细胞培养法获得的天然抗原的免疫活性和抗原活性,且纯度迭90%以上.结论 建立的gG1,gG2包涵体的复性与纯化方法 可以用于该类原核表达抗原的大量制备工作,获得的高纯度,高活性抗原可以应用于相关病原体感染临床诊断试剂盒的开发.