β-catenin协同BMP9诱导骨肉瘤TE85细胞成骨分化

目的:检测β-连环蛋白(β-catenin)联合骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)对骨肉瘤TE85细胞成骨分化的影响。方法 :采用构建有β-catenin和BMP9基因的重组腺病毒Adβ-catenin和Ad BMP9,单独或联合感染人骨肉瘤TE85细胞,并用半定量RT-PCR法检测β-catenin和BMP9 m RNA在TE85细胞中表达水平的改变;荧光素酶报告基因系统检测β-catenin/TCF4相对活性的变化,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色和读数法分析TE85细胞的早期成骨能力,茜素红染色法检测细胞的晚期成骨能力;半定量RT-PCR法检测骨保护蛋白(osteoprotegerin,OPG)以及晚期成骨分化指标骨钙蛋白(osteocalcin,OC)和骨桥蛋白(osteopontin,OPN)m RNA的表达水平,蛋白质印迹法检测OC和OPN蛋白的表达水平。结果:重组腺病毒Adβ-catenin与AdBMP9感染TE85细胞后能显著提高外源性β-catenin与BMP9 mRNA的表达水平(P值均<0.05),Adβ-catenin能明显增强β-catenin/TCF4的相对活性(P<0.05)。Adβ-catenin与AdBMP9能分别诱导骨肉瘤细胞TE85早期成骨分化指标ALP活性增加(P<0.05),但增加的程度有限;对晚期成骨指标OC和OPN mRNA和蛋白表达以及钙盐沉积无明显上调的作用。Adβ-catenin与AdBMP9联合作用之后,上述各项早晚期成骨指标的表达均显著增强,差异均有统计学意义(P值均<0.05)。结论:β-catenin和BMP9单独诱导骨肉瘤细胞TE85成骨分化的能力有限,而联合作用后诱导成骨分化的能力显著增强,β-catenin能协同BMP9诱导骨肉瘤细胞TE85成骨分化。     

骨形态发生蛋白2基因转染诱导异位成骨的机制研究

目的观察骨形态发生蛋白2基因直接及间接转染诱导异位成骨的效果和机制。方法1.将携带骨形态发生蛋白-2基因的腺病毒载体(Ad-BMP-2)直接注射到裸鼠肌内诱导成骨;2.Ad-BMP-2体外转染人骨髓间质干细胞(hBMSC)后种植异种骨支架(BCB)植入裸鼠皮下。实验分为5组:①BMP-2基因转染细胞 BCB;②对照基因转染细胞 BCB;③未转染细胞 重组BMP-2 BCB;④未转染细胞 BCB;⑤BCB。术后行X线、免疫组化及原位杂交染色观察BMP-2基因诱导下的成骨方式及成骨机制。结果1.裸鼠肌内注射后有异位成骨,其主要为软骨化骨。2.Y染色体探针荧光原位杂交法(FISH)示踪植入细胞命运,见部分转基因细胞直接参与成骨;骨钙素免疫组化检测见基因表达产生的BMP-2诱导宿主间质细胞向成骨细胞转化。结论BMP-2基因转染的hBMSC不仅作为运载生长因子的工具,而且直接参与成骨,但BMP-2的诱导趋化作用占主导地位。     

骨形成蛋白与肿瘤相关性研究进展

骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)最初是作为一种可在异位诱导骨和软骨形成的蛋白质被发现，但后来的研究发现，广泛分布于人体多种组织和细胞，行使多方面功能。它参与胚胎的形成、发育及组织细胞的分化和增殖。BMP基因突变和异常表达将导致胚胎死亡、组织器官发育异常及其它疾病的发生。BMP与某些肿瘤的发生、发展及转移密切相关。本文就近年来BMP与某些肿瘤的相关性研究作一综述。     

骨形态发生蛋白与乳腺癌的研究进展

骨形态发生蛋白（BMP）是一类具有诱导骨活性的多功能糖蛋白,它不但能促进骨的生成,诱导成骨和间充质干细胞成骨分化,而且在多种肿瘤的恶性进展中发挥重要作用。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,在我国发病率逐年升高,约70%的乳腺癌患者发生肺、骨等部位的转移。目前,BMP在乳腺癌发生、发展过程中的作用机制及寻找乳腺癌新的治疗靶点已经成为医学界的研究热点。本文就近10年BMP对乳腺癌细胞生长、侵袭和转移的影响及机制的研究进展作一综述。     

骨形态发生蛋白7与肿瘤关系的研究进展

骨形态发生蛋白7（BMP7）属于转化生长因子－β（TGF-β）超家族的成员之一，最初在研究体内诱导骨与软骨形成的因子时发现，对骨骼的胚胎发育和再生修复起重要作用。研究发现它还参与调节多种细胞的增殖、分化及凋亡的生物学过程。现就BMP7的生物学结构、信号传导机制以及与肿瘤的发生和转移的关系等方面的研究进展介绍如下。     

细菌内同源重组法高效制备含CD、TK融合自杀基因重组体腺病毒

目的：采用细菌内同源重组法高效制备含ＣＤ、ＴＫ融合自然基因重组体腺病毒。方法：ＣＤ、ＴＫ融合基因ＣＤｇｌｙＴＫ自载体ｐＷＺＬｎｅｏＣＤｇｌｙＴＫ中切出,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成转移质粒ｐＡｄｔｒａｃｋＣＭＶ－ＣＤｇｌｙＴＫ,将之Ｐｍｅｌ酶切线性化后与腺病毒基因组质粒ｐＡｄｅａｓｙ０１共转化ＢＪ５１８３菌,抽提重组体腺病毒基因组质粒ＤＮＡ,Ｐａｃｌ酶切后转染２９３细胞包装成腺病毒颗粒,采用ＰＣ     

BMP在骨肿瘤中的存在和意义

1965年,Urist发现脱钙骨基质的提取物在肌肉内使间充质细胞转化为骨系细胞发生异位成骨,随后分离出了一种小分子量的糖蛋白,即骨形态发生蛋白.Wezney在1988年对这种骨提取物的肽链进行分析,并测出其氨基酸的序列,首次克隆出BMP2,BMP3,BMP4,至今,已有15种BMP及40种BMP相关蛋白被成功的分离.目前利用基因重组技术可以大量获得BMP,为临床应用提供了可能.BMP在骨肿瘤的作用也正日益引起人们的关注。     

骨形态发生蛋白2在腰椎融合术中应用的效果与并发症

正骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)是由骨基质分泌的一种疏水性非胶原蛋白,属于转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员~([1-3])。是美国Marshall R.Urist教授于1965年发现的,Urist将脱钙骨基质(decalcified bone matrix,DBM)置于动物肌肉袋中诱导异位骨形成。其属于BMP家族,其中BMP-2,4和7的生物活性最高,成骨活性最强~([4-6])。现已证实BMP是一种酸性多     

骨肉瘤细胞(MG-63)条件培养基中骨形态蛋白(BMP)的实验研究--BMP的分离、纯化、鉴定

目的 探索从骨肉瘤细胞条件培养基中提取骨形态蛋白(BMP)的方法，并测定其生物学活性。方法 收集骨肉瘤细胞(MG-63)条件培养基，通过浓缩、透析，SephcrylS—100凝胶层析纯化，BMP单克隆抗体鉴定所需洗脱峰，SDS—PAGE测定分子量，小鼠肌袋实验检测其骨诱导活性。结果 BMP单抗鉴定所提蛋白为BMP，SDS—PAGE显示分子量在21kD，能够在小鼠肌肉内产生异位骨化。结论 骨肉瘤细胞条件培养基中含有BMP，分离后具有良好的生物学活性，而骨肉瘤细胞可以在体外长期培养生长，为BMP的大量提取、临床应用提供一个有益的方法。     

骨形成蛋白与前列腺癌

前列腺癌是西方国家男性最常见的恶性肿瘤之一,目前我国前列腺癌的发病率亦明显增加。前列腺和前列腺癌组织中有骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)及其受体的表达。BMPs能够诱导异位成骨、细胞趋化、分化和胚胎发育。某些BMPs及其受体在前列腺癌细胞表达,可以作为前列腺癌发生、发展和预后的标志物。BMPs对前列腺癌细胞生物学行为的调控作用是多样的,与肿瘤细胞类型、分化状态和局部微环境有关。BMPs在前列腺癌进展过程中,特别是在促进前列腺癌骨转移并在成骨反应中发挥重要作用。研究BMPs与前列腺癌的关系,有助于阐明前列腺癌的发病及转移机制,为前列腺癌的治疗提供实验依据。     

腺病毒介导的HBsAg基因修饰树突状细胞瘤苗的制备

目的:构建含人HBsAg基因的腺病毒载体,体外转染树突状细胞,制备树突状细胞肝癌瘤苗。方法:将HBsAg基因亚克隆到pIND载体和Shuttle2载体中,构建穿梭载体Shuttle2-S。用PI-SceⅠ和I-CeuⅠ双酶切后将所获HBsAg基因片段再与线性化的腺病毒载体pAdeno-X连接,构成pAdeno-S重组腺病毒载体。其后,用重组腺病毒载体转染HEK293细胞,包装腺病毒表达载体。通过酶切、PCR对腺病毒载体进行鉴定。包装好的重组病毒载体pAdeno-S体外感染树突状细胞制备树突状细胞肝癌瘤苗后Westernblot法检测其表达,流式细胞仪检测其能否诱导树突状细胞凋亡。结果:酶切、PCR鉴定证实,穿梭质粒插入片段为HBsAg基因。包装的腺病毒载体具有良好的感染性,可以在293细胞中形成病毒颗粒,腺病毒载体内携带HBsAg基因感染树突状细胞,经Westernblot法鉴定证实能够表达转染基因,并且不会诱导树突状细胞凋亡。结论:构建成功的含HBsAg腺病毒载体可以在树突状细胞中表达HBsAg,为DC瘤苗的进一步研究奠定了基础。     

含人AFP基因重组腺病毒载体的构建及其转染树突状细胞瘤苗的制备

目的:构建含人AFP基因的腺病毒载体,体外转染树突状细胞,制备树突状细胞肝癌瘤苗.方法: 将AFP基因亚克隆到pIND 载体和Shuttle2载体中,构建穿梭载体Shuttle2-AFP.用PI-Sce Ⅰ和I-CeuⅠ双酶切后将所获AFP基因片段再与线性化的腺病毒载体pAdeno-X连接,构成pAdeno-AFP重组腺病毒载体.其后,用重组腺病毒载体转染HEK293细胞,包装腺病毒表达载体.通过酶切、PCR对腺病毒载体进行鉴定.包装好的重组病毒载体pAdeno-AFP体外感染树突状细胞制备树突状细胞肝癌瘤苗后,FACS分析pAdeno-AFP/DC表面分子的表达,酶联免疫吸附试验法( ELISA) 检测AFP水平.结果: 酶切、PCR鉴定证实,穿梭质粒插入片段为AFP基因.包装的腺病毒载体具有良好的感染性,可以在293细胞中形成病毒颗粒,腺病毒载体内携带AFP基因感染树突状细胞,pAdeno-AFP/DC能高水平的表达CD1a,CD11c,CD80,CD86以及HLA-DR,并分泌较高水平的AFP.结论: 构建成功的含AFP腺病毒载体可以在树突状细胞中表达AFP,为DC瘤苗的进一步研究奠定了基础.     

一种新的重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-mAFP的构建

 目的 构建表达小鼠甲胎蛋白（murine alpha fetoprotein，mAFP）基因的重组腺病毒载体pAd—BM5-GFP-mAFP，并测定其滴度。方法 从Hepal-6小鼠肝癌细胞中提取总RNA，设计特异性引物，通过RT-PCR法扩增mAFP基因，测序确认后，插入到pAdBM5-GFP穿梭载体中，双酶切鉴定重组腺病毒载体。线性化重组腺病毒载体与病毒骨架DNA质粒用磷酸钙共沉淀法共转染HEK293A细胞，通过同源重组使腺病毒表达mAFP基因，并在HEK293A细胞中大量扩增含目的基因的重组腺病毒，用TCBn法测定重组腺病毒滴度。结果 成功克隆了小鼠mAFP基因，构建出表达mAFP基因的重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-mAFP，获得了表达mAFP基因的重组腺病毒，病毒滴度达3．2×10^8PFU／ml。结论 本研究成功构建了pAdBM5-GFP-mAFP载体，获得了高滴度表达mAFP基因的重组腺病毒，为进一步开展肝癌的免疫基因治疗奠定了基础。     

含人AFP基因重组腺病毒载体的构建及其转染树突状细胞瘤苗的制备

目的：构建含人AFP基因的腺病毒载体,体外转染树突状细胞,制备树突状细胞肝癌瘤苗。方法：将AFP基因亚克隆到pIND载体和Shuttle2载体中,构建穿梭载体Shuttle2-AFP。用PI—SceⅠ和I—Ceu Ⅰ双酶切后将所获AFP基因片段再与线性化的腺病毒载体pAdeno—X连接,构成pAdeno—AFP重组腺病毒载体。其后,用重组腺病毒载体转染HEK293细胞,包装腺病毒表达载体。通过酶切、PCR对腺病毒载体进行鉴定。包装好的重组病毒载体pAdeno—AFP体外感染树突状细胞制备树突状细胞肝癌瘤苗后,FACS分析pAd-eno—AFP／DC表面分子的表达,酶联免疫吸附试验法（ELISA）检测AFP水平。结果：酶切、PCR鉴定证实,穿梭质粒插入片段为AFP基因。包装的腺病毒载体具有良好的感染性,可以在293细胞中形成病毒颗粒,腺病毒载体内携带AFP基因感染树突状细胞,pAdeno—AFP／DC能高水平的表达CD1a,CD11c,CD80,CD86以及HIA—DR,并分泌较高水平的AFP。结论：构建成功的含AFP腺病毒载体可以在树突状细胞中表达AFP,为DC瘤苗的进一步研究奠定了基础。     

表达绿色荧光蛋白和人类血管内皮生长因子的shRNA重组腺病毒的构建与鉴定

 【摘要】　目的　构建表达绿色荧光蛋白（GFP）和人类血管内皮生长因子（VEGF）的重组腺病毒载体,并对其相关指标进行鉴定,观察其对人类鼻咽癌细胞系CNE的感染效果。方法　使用基因工程技术将GFP和人类VEGF siRNA的cDNA通过LR法体外同源重组从质粒载体pGenesil-1上转移至pGSadeno腺病毒表达载体上,得到腺病毒载体pGSadeno-GFP-VEGF,将PacI线性化的腺病毒DNA转染HEK293细胞,并在其中包装扩增腺病毒。采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中所携带的GFP报告基因,进行病毒滴度的测定和对CNE细胞感染效率的检测。结果　酶切鉴定及PCR结果证明GFP-VEGF shRNA重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达到2×109 PFU／ml,对CNE有较强的感染能力,感染腺病毒后CNE细胞的增殖速率明显下降。结论　应用体外同源重组方法成功构建了表达GFP和VEGF shRNA的重组腺病毒载体。     

HBx基因重组腺病毒载体构建及其在SMMC-7721细胞中的表达

目的:利用pAdEasy1腺病毒载体系统构建人HBx基因重组腺病毒,感染肝癌细胞株SMMC7721使HBx基因有效表达。方法:自真核表达载体pcDNA3.1(-)HBx中获得HBx基因,插入腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV中构建pAdTrackCMVHBx,然后经PmeⅠ酶切线性化,电转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy1的BJ5183感受态细菌中。挑选和鉴定正确的同源重组质粒,然后将线性化的重组质粒转染293N细胞,产生重组病毒颗粒,并进一步感染SMMC7721细胞株。结果:经限制性内切酶酶切和基因测序鉴定,证实pAdTrackCMVpAdEasy1HBx重组成功,借助荧光显微镜可以观察到绿色荧光蛋白GFP在293N和SMMC7721细胞株中表达。结论:成功构建了携带HBx基因的重组腺病毒载体,并在SMMC7721细胞中使HBx基因有效表达,为后续研究奠定了基础。     

CRT180基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建表达CRT180基因重组的腺病毒载体,为肿瘤的基因治疗奠定实验基础。方法采用腺病毒表达系统（Vira Power^TM Adenoviral Expression System）构建重组腺病毒表达载体。首先利用RT-PCR的方法在人肺腺癌细胞系A549细胞中扩增CRT180基因,以连接、转化等方法克隆入载体pENTR／D—TOPO以获得重组的入门克隆,经测序及PCR鉴定正确后,用重组酶（LRClonase^TMⅡ Enzyme Mix）进行入门克隆与腺病毒表达载体（pAd—CMV／V5-DEST）间的重组反应,以获得表达克隆（rAd．CRT180）质粒。重组表达克隆鉴定后,用限制性内切酶PacⅠ是使之线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒。用极限稀释法检测病毒滴度用Western Blot法检测rAd．CRT180载体是否能正确表达CRT180蛋白。结果用RT-PCR的方法扩增到CRT180基因;重组入门和表达克隆经酶切和PCR鉴定构建正确,重组表达克隆转染HEK293A细胞获得病毒原液并扩增后测定病毒滴度为1．8×10^11pfu／mL,且这个病毒能正确表达CRT180蛋白。结论成功构建了CRT180基因的重组腺病毒载体,可为此重组载体用于肿瘤基因治疗提供实验依据。     

重组腺病毒Ad—hTERTp—HSV—TK载体的构建及抗肝癌实验研究

目的构建hTERT启动子调控的HSV—TK基因重组腺病毒载体系统,观察Ad—hTERTp—HSV-TK／GCV自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤作用。方法将穿梭质粒pSU-Tp-TK与腺病毒骨架质粒pBHGE3共转导至HEK293细胞,利用细胞内同源重组法构建出hTERT启动子调控的携带TK基因的复制缺陷型腺病毒Ad—hTERTp—HSV—TK载体系统;将不同感染复数（MOI=1、10、100、1000）的重组腺病毒Ad—hTERTp—HSV—TK感染肝癌细胞HepG2及正常肝细胞L-02,加入不同浓度的GCV（0、1、10、100、1000ug／ml）,MTT、法检测细胞活性。结果HEK293细胞出现病毒空斑,提取病毒DNA,经PCR鉴定正确后扩增、纯化,滴度为1．5×10^10pfu／ml;MTT法检测到Ad—hTERTp—HSV-TK／GCV能靶向杀死肝癌细胞HepG2,且细胞存活率随着病毒滴度和GCV浓度的增加而降低。结论该实验构建的Ad—hTERTp—HSV—TK载体系统,可靶向抑制肝癌细胞HepG2,而对正常肝细胞L-02几乎无影响。     

沉默结缔组织生长因子基因重组腺病毒的构建及功能验证

目的:构建沉默结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)基因的复制缺陷型重组腺病毒Ad-siCTGF,并进行功能验证.方法:选取已验证的能高效沉默CTGF基因的靶序列,克隆入载体pSES-HUS中;将质粒线性化处理后与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转染大肠埃希菌BJ5183,构建重组腺病毒载体Ad-siCTGF;腺病毒载体用Pac I酶切线性化处理后转染HEK293细胞,包装重组腺病毒;采用"乒乓交互感染法"提高病毒滴度.用此病毒感染4T1细胞,行实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative -PCR, RFQ-PCR)及Western 印迹法验证其沉默效果.结果:Pac I酶切电泳证实重组腺病毒载体Ad-siCTGF构建成功,扩增纯化后测定重组病毒Ad-siCTGF的滴度为2.6×10~(10) pfu/mL.感染此病毒后,4T1细胞中CTGF mRNA表达水平下调至36.27%,蛋白表达水平下调至31.56%.结论:成功构建能沉默CTGF基因的重组腺病毒,为进一步研究CTGF在肿瘤中的作用机制奠定了基础.     

介导尤文肉瘤融合基因的重组腺病毒的构建及其在外周血单个核细胞(PBMC)中的表达

目的　构建尤文肉瘤融合基因EWS -FLI1重组腺病毒 ,并检测其在外周血单个核细胞(PBMC)中的表达 ,为进一步进行尤文肉瘤的免疫治疗奠定基础。方法　将质粒pEC1EWS/FLI1酶切 ,切出的EWS -FLI1cDNA片段克隆至腺病毒穿梭质粒padtrack -cmv的HCMV启动子下游。将连接后的穿梭质粒和骨架质粒Padeasy -1共同转化大肠杆菌BJ5 1 83菌株 ,获得同源重组后的腺病毒质粒pADEWS/FLI1。将此质粒转染 2 93细胞 ,包装产生腺病毒AdEWS -FLI1。扩增、纯化产生高滴度的AdEWS -FLI1。转染PBMC ,并通过RT -PCR和免疫组化法检测EWS -FLI1的表达。结果　同源重组后产生的pADEWS/FLI1经PCR鉴定构建成功 ,纯化后的滴度为 4× 1 0 10 /ml。转染PBMC后 ,RT -PCR证实有EWS/FLI1mRNA的转录 ,免疫检测法检测在PBMC中有EWS/FLI1的表达。结论　重组腺病毒AdEWS/FLI1构建成功 ,并能在PBMC中稳定有效地表达 ,为进一步进行尤文肉瘤的免疫治疗研究奠定了基础。